在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

本方案详细展示了在大型动物模型中将整个视网膜类器官递送至视网膜下腔的技术，旨在开发针对视网膜变性疾病的细胞治疗策略。该技术的主要优势在于可将类器官直接递送至靶组织——视网膜。该技术旨在治疗晚期致盲性视网膜退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性或莱伯先天性黑蒙。

进行该操作演示的是Dr.Peterson Jones。对于类器官的视网膜下植入，使用Stevens Tenotomy剪刀对一只禁食过夜的四个月大麻醉猫进行0.5至1厘米的外侧睑缘切开术，并将适当大小的Barraquer眼睑开睑器置入切口，由手术助手在手术过程中定期用BSS冲洗角膜以保持眼睑张开。使用0.5号Castroviejo角膜打结镊和小型蚊式止血钳轻轻夹住靠近角膜缘的球结膜。

在4点和8点位置的角膜缘附近结膜处分别置入两根6-0丝线缝线，以固定眼球于原在位并牵拉第三眼睑。使用小型蚊式止血钳夹住缝线末端，以便操作。在12点位置的角膜缘处，经部分角膜缘厚度置入另一根缝线，注意避免穿透眼球。将该缝线 loosely 打结，剪短末端，并在4点位置角膜缘附近的结膜处再放置一根固定缝线，以固定眼球并维持原在位。

将角膜缘10点至2点之间的球结膜翻起，使用斜视剪在距离角膜缘2至3毫米处剪开结膜。分离结膜下组织，清除Tenon囊，暴露距离角膜缘3至5毫米处2点和10点位置的巩膜，作为玻璃体切除术的穿刺口。使用卡尺确定巩膜穿刺位置，避开在猫眼中可能较明显的巩膜主血管。

为右利手术者在10点钟位置的器械通道预留3毫米区域，在拟定的巩膜切口处预先放置6-0或7-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin）十字缝合线，暂不打结。缝线放置完成后，让助手抓住12点钟位置的固定缝线以帮助维持眼球位置，并使用0.12毫米卡斯特罗维霍镊（Castroviejo forceps）夹住巩膜切口旁的组织。使用穿刺锥在2点钟和10点钟位置以朝向视神经的角度经巩膜插入23G玻璃体切除套管，避免接触晶状体，并使用打结镊轻轻推动灌注套管，以确定套管尖端是否可在玻璃体腔内被观察到。

让助手将 Machemer 放大灌注玻璃体切除镜放置于角膜上，以观察眼后段，并通过器械通道插入 23G 玻璃体切除探针切割头，进行部分核心玻璃体切除。接着，将装有 1 毫升曲安奈德溶液的 1 毫升注射器针头经器械通道插入，注入 250 至 500 微升晶体悬液。溶液注射完成后，将玻璃体切除探针经器械通道推进至视盘附近，探针开口方向应背离视网膜表面。

使用高真空辅助将玻璃体面从视网膜上分离，通过器械通道将注射器插入至视网膜表面，并推出套管尖端。轻轻按压视网膜表面的尖端，同时让助手对注射器推杆施加轻微而快速的推动，以开始视网膜脱离，并降低注射压力，使视网膜脱离范围缓慢扩大，直至达到所需大小。使用注射器的41号套管轻微扩大视网膜脱离区域，直至可引入视网膜剪，随后移除10点钟方向的巩膜通道。

然后使用一把朝向视神经的直形2.850毫米裂口刀，避免接触晶状体，以扩大该部位的巩膜切口。在远离视神经的隆起处进行视网膜切开，以避免损伤来自移植区域的视网膜神经纤维，并避免切断主要的视网膜血管，以降低出血风险。植入类器官时，将装有类器官的玻璃毛细管通过扩大的巩膜切口插入至视网膜切开部位，并用毛细管尖端轻微打开视网膜切口，以便进入视网膜下隆起腔隙。

让助手再次缓慢推动注射器的活塞，将类器官注入视网膜下隆起区域。BSS 应先于类器官进入，进入眼内，并冲开视网膜切口。当所有类器官都已输送完毕后，将玻璃毛细管原位停留数秒钟，然后缓慢将其从眼球中取出，注意避免液体突然释放。

移除毛细血管后，使用预先放置的缝线以十字交叉方式关闭巩膜切口。助手移除灌注端口后，迅速结扎巩膜切口缝线，并用聚乙醇酸乳酸缝线以连续简单方式关闭结膜切口。用6-0聚乙醇酸乳酸缝线和八字皮肤缝线闭合外眦切口，以完成外眦成形，其余伤口则采用间断简单皮肤缝线关闭。

随后给予适当的术后类固醇和抗生素混合药物。通过直接观察，可在注射装置的玻璃套管内及手术过程中确认人多能干细胞来源的视网膜类器官的装载情况。术后可通过眼科检查和眼底成像确认类器官是否位于视网膜下腔。

在实施安乐死之前，还可进行共聚焦扫描激光检眼镜和谱域光学相干断层扫描成像，以评估类器官的位置。这些技术可用于证明视网膜类器官在受体眼神经视网膜与视网膜色素上皮之间的视网膜下腔中持续存在。组织学和免疫组织化学分析可用于说明异种移植物在免疫抑制动物大眼球的视网膜下腔内的存活情况。

仅具备玻璃体视网膜手术经验的专业人员（例如接受过专业培训的兽医眼科医生，或熟悉猫眼与人眼解剖差异的玻璃体视网膜外科医生）方可开展本手术。本视频所展示的技术同样适用于其他用于将玻璃体视网膜外科技术转化至临床应用的大型动物模型。