优化用于中子大分子晶体学的晶体生长

为了获得适用于X射线和中子晶体学的大尺寸高质量晶体，存在多种结晶方法。其中一种方法是透析法。在该技术中，蛋白质溶液与沉淀剂溶液通过半透膜分隔开来。

沉淀剂分子穿过膜扩散进入蛋白质室。当达到适合自发成核的过饱和度时，将出现最初的晶核。在此，我们将演示一种可用于OptiCrys的实验方案，OptiCrys是我们实验室开发的全自动仪器，利用温度控制的透析结晶技术以及我们的微透析按钮装置，基于结晶相图的知识，生长适用于天然大分子晶体学研究的高质量大晶体。

对于具有特定微升体积的微型透析装置，用移液器将35微升溶菌酶溶液加入透析室中。此额外体积会在透析室顶部形成轻微的穹顶状，从而防止气泡产生。取一支涂布棒，并将弹性环或环状物置于其末端。

将膜置于透析室上方，通过将弹性环或环圈从加样器转移至透析按钮的凹槽中固定。将透析按钮转移至含有结晶溶液的孔中。用玻璃盖玻片或一片胶带封住孔口。

将样品置于无振动的恒温培养箱中，保持温度为293开尔文。鉴于透析结晶法在晶体生长方面具有优势，我们实验室设计并开发了名为OptiCrys的结晶平台，可对生物分子结晶实验的温度和化学组成实现完全自动化的联合控制。OptiCrys对晶体生长的优化基于温度-沉淀剂浓度相图。

成核发生在介稳区附近的成核区内，随后根据相图，晶体生长在介稳区内进行，直至蛋白质浓度达到代表溶液与晶体之间热力学平衡的溶解度曲线。对于具有直接溶解度的蛋白质，通过降低温度，或对于盐析情况通过增加沉淀剂浓度，使结晶溶液保持在介稳区内，此时不会发生新的成核。晶体持续生长直至达到第二个晶体-溶液平衡状态，此后晶体尺寸不再进一步增加。

重复降低温度或增加沉淀剂浓度数次，直至晶体达到所需大小。将蛋白质溶液加入温控流动装置的透析室中，用透析膜覆盖上室，并用弹性环或固定环将膜固定。翻转上室并将其放置在透析室上方。

轻轻且缓慢地按压，以排出两片之间夹带的所有空气，然后通过轻轻旋转将储液槽固定在相应位置，安装在上腔室的顶部。向储液槽腔室中加入结晶溶液，并用密封盖盖紧。将此组件转移并插入 OptiCrys 结晶台的乳房支撑部位。OptiCrys 晶体生长是 Crystallization Bench OptiCrys 的监控软件。

它包含四个不同的图形界面或视图。主视图包含用于导航至其他视图的按钮。设置界面的目的是定义一个实验场景，该场景可在测试视图中自动运行。

最后一个是维护界面。要重新启动实验，必须打开维护界面，在此界面中可以找到确保结晶实验顺利运行的全部关键参数。可通过光源部分增加亮度，光源亮度可从零（无光）调节至最大100（最大亮度）。

用于控制和监测温度时，需使用温度调节部分。单击按钮将其打开，在设定值部分设置温度，然后按回车键。

该按钮下方有两个图表。红色图表显示最终的有序温度，黄色图表显示当前温度。混合储备溶液后，通过掌上部分（Palm section）控制向储液室注入结晶溶液。

在第一阶段中加入储备液的浓度。然后确定每种新配制溶液的最终浓度，并将其填入最终浓度部分。按下计算按钮后，将自动计算出所需储备液的体积，并显示在每项浓度对应的体积面板中。

按下启动准备按钮，并等待新的首选溶液准备就绪。如需更换结晶溶液，请点击“溶液输入”按钮。如需停止该过程，请按下“停止分配”按钮。

在显微镜区域的右侧，设有多个用于记录每次晶体生长实验重要信息的面板。请在本部分填写相应的蛋白质名称、分子量及结晶条件。通过在文件夹名称处直接输入名称，即可为您的实验定义一个名称。

在 nb 图像部分，选择实验过程中应拍摄的图像数量。输入图像数量后，从右侧面板中选择时间刻度。单击文件夹按钮以打开文件夹。

在此文件夹中，有一个文本文件，包含您先前为实验定义的所有信息。可供进一步处理的图像也保存在此文件夹中。显微镜的缩放倍数也可自动调整。

通过显微镜部分上方的加号和减号按钮来调整放大倍数，分别用于增加或降低放大倍率。测量晶体尺寸有三种不同方法。测量长度或宽度时，请使用宽度矢量。

根据晶体的形状，可选择显微镜部分左侧的特定工具，例如矩形或多边形。测量结果将显示在测量部分。

在第一组实验中，将微透析小室浸入含有不同盐浓度的结晶溶液中。在此简单的结晶网格实验中，唯一变量是沉淀剂浓度，而温度保持恒定。

盐浓度的微小变化可通过将盐浓度从0.7增加至1.2摩尔过饱和度，来研究结晶相图，此时溶液逐渐远离亚稳区，进入成核区。因此，观察到晶体数量增多而尺寸减小的现象。在给定实验条件下首次使用OptiCrys进行的实验中，一旦透析室达到平衡，结晶溶液即位于结晶相图中亚稳区附近的成核区内。

因此，在实验的第一阶段仅生成少量晶核。为了使晶体生长保持在亚稳区并控制晶体生长过程，需在不同的时间间隔改变温度。每次晶体溶液达到平衡后，即调节温度。

因此，温度依次降低至291开尔文、288开尔文，最终降至275开尔文，以维持所选晶体在亚稳区内的生长。本实验的结果是获得一颗体积足以用于天然大分子晶体学研究的单一较大晶体。接下来的两个实验展示了温度控制透析实验在成核、晶体生长、溶解与再结晶过程中的可逆性。

在第二次OptiCrys实验中，结晶溶液的化学成分在整个实验过程中保持不变，仅改变温度。初始温度设定为291开尔文。由于过饱和度较高，结晶室中出现了大量微小晶体。

根据直接蛋白质溶解度的概念，通过逐步升温至313开尔文，所有晶体均完全溶解。最后，将温度降低至295开尔文，在亚稳区附近引发第二次成核，并实现了对成核过程的控制，从而形成较少数量的晶核。随后的晶体生长过程有助于产生尺寸较大且均匀的晶体群体。

本实验中，在恒定温度下改变结晶溶液的化学组成，可获得尺寸更大且均一的晶体群体。结晶条件与前次实验相似。通过将 NaCl 浓度从 0.9 摩尔逐步降低至零，实现晶体的溶解。

降低盐浓度可使溶液保持在相图的未饱和区域，从而导致晶体溶解。随后，将离子强度低于先前浓度的新型结晶溶液注入储液室。在此沉淀剂浓度下，出现的晶体数量较少，且晶体体积较之前更大。

本文提供了一套详细方案，描述了如何使用本实验室开发的全自动仪器，通过制备样品并调整控制软件，以生长出大尺寸且高质量的天然大分子晶体。该逐步操作流程基于对结晶相图的理解而设计，旨在分离成核与晶体生长过程。此外，当无法使用OptiCrys时，本文还提供了一种利用大细胞按钮作为替代手段、生长具有微细胞结构晶体的方案。

除了我提到的用于 OptiCrys 的策略外，改变结晶溶液的化学成分和温度，以及拍摄图像均需手动完成。必须使用带有温度调控功能的振动培养箱来保持温度恒定，这是本方法学演示中的关键步骤。