分离邻近液体以研究胰腺导管腺癌的肿瘤微环境
2020年11月5日
胰液是人类胰腺癌生物标志物的宝贵来源。本文介绍了一种术中采集胰液的方法。为克服在小鼠模型中应用该方法的困难，我们提出了一种替代样本——肿瘤间质液，并在此描述了两种分离肿瘤间质液的实验方案。
本文所述在人类和小鼠中分离近端液体的方法，可用于研究胰腺癌的微环境，以鉴定新的疾病生物标志物。通过这一简便的方案，可将来自胰液的临床发现转化为胰腺导管腺癌（PDAC）的小鼠模型，从而开展机制性研究。胰液是一种尚未被充分探索的体液，已显示出作为宝贵生物标志物来源的潜力，有助于术前诊断和患者分型。
我将演示实验方案的第一部分，我们实验室的博士后 Marialuisa Barbagallo 将演示方案的第二部分。根据成像过程中获得的测量数据，估算胰管的位置，然后触诊胰腺的前表面以确定其精确位置。
用左手从下方托住十二指肠内的胰头并抬起，用食指标记胰管的位置。右手持一支3毫升注射器，针头为25号，将其插入胰腺，进针位置位于左手拇指远端。根据术前测量结果以及针尖穿透导管壁时的手感，确定针头刺入的深度和倾斜角度。
用注射器抽出胰液。如果无法获取胰液，可调整针头位置，尝试重新穿刺胰管。一旦获取胰液，将其移出无菌区域，并转移至一支3 mL含EDTA的真空采血管中。
将试管置于 4 °C 保存，直至样本转移至实验室。处理胰液时，在 4 °C 条件下以 400 ×g 离心 10 分钟，以去除细胞或碎片。收集上清液，分装后于 -80 °C 保存，待进一步分析。
通过离心法分离肿瘤间质液（TIF），将肿瘤切成两半，用PBS冲洗两部分，并在滤纸上轻轻吸干，操作过程应尽可能迅速，以避免肿瘤液体蒸发。立即将肿瘤转移至固定在50毫升锥形管上的20微米尼龙细胞筛中。在4摄氏度下以400 G离心10分钟。
从管底回收TIF，然后将其分装并立即在干冰上速冻。保存于-80摄氏度，直至进一步分析。若通过洗脱法分离TIF，需用剪刀或手术刀将肿瘤切成小块，并用预冷的PBS小心冲洗。
将肿瘤组织块转移至1.5毫升离心管中，加入500微升含蛋白酶抑制剂混合物的PBS，以防止分析物降解。将组织在37°C和5%二氧化碳条件下孵育1小时。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并在4°C下进行一系列离心步骤，以去除样品中的细胞成分。
每次离心后回收上清液，并转移至新管中。最后一次离心后，立即在干冰上对TIF样品进行分装并冷冻。保存于-80 °C，直至进一步分析。
本方案用于获取胰腺导管腺癌（PDAC）及其他良性胰腺疾病患者的胰液。在滤除大分子物质的宽泛核磁共振（NMR）信号后，小分子量代谢物的信号变得清晰可见。有监督的OPLS-DA分析显示，胰液中的代谢谱能够区分PDAC与非PDAC患者，准确率达82.4%。有趣的是，对同一患者血浆样本进行的代谢组学分析并未获得相同的鉴别能力。
为了证明肿瘤间质液成分能够可靠地反映肿瘤微环境的变化，将两种糖酵解速率相反的胰腺癌细胞系皮下注射至小鼠体内。切除肿瘤后，定量分析了葡萄糖和乳酸的浓度。高糖酵解肿瘤的间质液中葡萄糖含量较低，而乳酸含量高于低糖酵解肿瘤。
在本研究中，我们进行了代谢组学分析。然而，这些近端液体也适用于许多其他下游应用，例如质谱分析和微小RNA谱型分析。
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概述
本文介绍了一种术中采集胰液的方法，胰液是胰腺癌生物标志物的重要来源。此外，本文还引入了一种替代样本——肿瘤间质液，并提供了在小鼠模型中分离该样本的实验方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 生物标志物发现
背景
- 胰液作为一种生物标志物来源尚未得到充分探索。
- 其在术前诊断中具有潜在应用价值。
- 理解胰腺癌的微环境至关重要。
- 将人类研究结果转化为小鼠模型研究可促进科研进展。
研究目的
- 分离胰液和肿瘤间质液，用于生物标志物鉴定。
- 提供适用于人类和小鼠模型的实验方案。
- 促进胰腺癌的机制研究。
使用的方法
- 术中采集胰液。
- 肿瘤间质液的分离。
- 利用影像技术定位胰管。
- 通过触诊胰腺实现精确定位。
主要结果
- 展示了体液分离的实验方案。
- 强调了胰液作为生物标志物来源的潜力。
- 证明了将临床发现转化为小鼠模型的可行性。
- 为未来的机制研究奠定了基础。
结论
- 胰液和肿瘤间质液在生物标志物研究中具有广阔前景。
- 这些实验方案有助于加深对胰腺癌的理解。
- 尚需进一步研究以探索这些体液的全部潜力。
常见问题
执行层面的行业相关性
近端体液分离技术可直接研究胰腺导管腺癌的微环境，为连接临床观察与临床前机制研究的生物标志物发现提供了途径。本方案通过在人和小鼠体系中提供技术上可行的胰液及肿瘤间质液采集方法，支持针对微环境改变的靶点验证和检测开发工作。该方法通过获取反映基质细胞与肿瘤细胞相互作用的疾病相关性体液，提高了早期发现阶段的预测可信度，有助于胰腺癌药物研发项目中的决策判断。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离浓缩肿瘤微环境生物标志物的液体，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：利用邻近液体中的生物标志物，提供一个与疾病相关的功能靶点验证系统。
- 科学价值：通过对肿瘤间质液（TIF）中葡萄糖和乳酸的定量分析，比较糖酵解型肿瘤表型，支持机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：制备经过验证的生物流体，用于质谱分析和微小RNA谱分析等下游应用。
- 操作价值：提供标准化、可重复的分离方案（离心和洗脱），适用于检测方法的规模化扩展。
- 科学价值：获得可定量的代谢物读数，能够实现可用于筛查的生物标志物检测，并具有良好的区分能力（OPLS-DA中准确率达82.4%）。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将人胰液的研究结果转化为小鼠TIF模型，建立与疾病相关的系统连续性。
- 操作价值：通过分离皮下肿瘤模型中的TIF以反映微环境变化，促进临床前验证。
- 战略价值：通过将体液生物标志物谱与肿瘤表型关联，支持基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法可融入从早期靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，实现微环境特征分析，从而为机制研究和生物标志物引导的筛选工作提供依据。
- 发现生物学：通过分离反映胰腺导管腺癌（PDAC）中基质-肿瘤相互作用的液体，支持假设验证与通路解析。
- 筛选：通过标准化的肿瘤间质液（TIF）和胰液分离，获得可量化的代谢物和核酸输出，实现检测就绪。
- 分析：提供可测量的生物标志物（葡萄糖、乳酸、代谢物），用于不同条件间的比较分析及表型筛选。
- 转化研究：通过在小鼠模型中证明肿瘤间质液（TIF）可反映肿瘤的糖酵解状态，将发现研究与临床前研究连续性衔接。
- 企业级复用：建立一种可在人源和小鼠系统中通用的邻近液体分离能力，降低模型转化障碍。
运营与企业影响
- 科学价值：通过检测胰腺导管腺癌（PDAC）微环境中的生物标志物并验证靶点，实现预测性判断。
- 操作价值：采用简单的离心和洗脱技术分离肿瘤间质液（TIF），实现标准化与可重复性。
- 战略价值：通过将液体生物标志物与肿瘤表型关联，优化“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目影响：基于生物标志物可区分的液体谱型进行风险校正的优先级排序（在PDAC与非PDAC中准确率达82.4%）。
实施注意事项
- 需要具备外科手术中液体处理和肿瘤解剖方面的专业知识，以实现近端液体的分离。
- 需要配备离心设备（400 G，4°C）以及无菌操作条件，用于胰液和组织间液（TIF）的处理。
- 要求外科、病理和分析团队之间在样本完整性方面实现跨团队标准化操作。
- 针对小鼠组织间液（TIF）的分离，需根据组织大小和后续应用选择离心或洗脱方法进行适应性调整。
- 存在实际操作限制，例如小鼠胰液采集技术难度较高，因此需以组织间液（TIF）作为替代样本。
