Name: 分离近端液研究胰腺腺癌肿瘤微环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 了解术中采集胰液及分离肿瘤间质液的方法，用于胰腺导管腺癌生物标志物研究。该方案支持人类与小鼠模型的转化研究，助力揭示肿瘤微环境机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Roberta Migliore提供的技术支持。本研究工作由意大利癌症研究协会（AIRC）资助，项目编号IG2016-ID.18443，项目负责人Marchesi Federica。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

所有入组患者均在手术时根据机构伦理委员会批准的方案采集外周血和胰液。所有患者在签署知情同意书后纳入研究，同意书内容包括生物样本和临床数据的采集。本研究已获得机构伦理委员会批准（方案编号 ICH-595，批准日期为2009年5月）。涉及小鼠的操作与护理均遵循欧盟及机构相关指南（方案编号 121/2016-PR）。
1. 胰液的分离
注意：胰液的抽取是在胰腺切除术（例如胰十二指肠切除术、全胰切除术、远端胰腺切除术）的开放手术过程中，由一组经验丰富的胰腺外科医生完成的。
<ol>
	<li>患者选择
	<ol>
		<li>对于所有计划接受开放性胰腺切除术的患者，均应考虑实施本操作。</li>
		<li>若主胰管直径足够以允许获取胰液，则确认符合纳入条件。在增强CT影像中，主胰管直径的最低限值为2 mm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术前通过增强CT影像对胰管进行研究，以协助规划胰液采集
	<ol>
		<li>在胰腺颈部水平，三维定位胰腺内的主胰管：在横断面图像以及冠状面和矢状面重建图像上，测量主胰管与胰腺前缘、上缘和下缘之间的距离。进入手术室后，利用这些测量数据大致确定穿刺胰腺以插管进入Wirsung管并采集胰液的正确位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>无菌材料：打开一支25 G针头和一支3 mL注射器的无菌包装，在刷手护士的协助下将其放置于无菌区域内。</li>
		<li>非无菌材料：在手术室内备好一支3 mL含K2EDTA的真空采血管，用于储存液体样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>患者准备
	<ol>
		<li>将患者置于手术台床上。采用瑞芬太尼、七氟烷和罗库溴铵实施联合全身麻醉，随后进行气管插管并开始机械通气。使患者仰卧，右臂紧贴身体，左臂外展90°并固定于臂板上。</li>
		<li>对手术切口部位的腹部皮肤进行消毒。通过铺巾建立并维持腹部的无菌区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>行肋缘下切口，进入腹腔。放置Rochard腹腔牵开器以充分暴露腹腔脏器&#160;。</li>
		<li>通过Kocher手法游离胰头，切开胃结肠韧带，并沿胰腺上下缘切开后腹膜组织，于胰颈前方与后方的肠系膜上静脉之间建立分离平面，从而暴露并游离胰腺。</li>
		<li>在胰腺完成游离并充分暴露后，于胰颈切断前进行胰液采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰管的识别与定位
	<ol>
		<li>根据影像学测量结果估计胰管位置，随后触诊胰腺前表面以确定其精确位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胰液采集
	<ol>
		<li>用左手托住胰头及十二指肠并向上抬起，同时用食指标记胰管所在位置。</li>
		<li>右手持装有25 G针头的3 mL注射器。</li>
		<li>使用右手将针头插入胰腺，穿刺点位于左手拇指稍远端处。根据术前测量数据以及针尖穿透胰管壁的手感，决定进针深度和角度。</li>
		<li>用注射器回抽胰液。若无法获取胰液，可将针头向四个方向调整位置，尝试重新插管进入主胰管。</li>
		<li>一旦成功采集胰液，即将其移出无菌区域，并转移至3 mL含K2EDTA的真空采血管中。样本置于4 °C保存，直至尽快转运至实验室并进行后续处理。 
		注意：根据我们的经验，通过该方法可采集到的胰液体积差异较大，大约在0.2 mL至3 mL之间。采集量高度依赖于患者个体情况，包括Wirsung管的大小以及胰腺的功能状态（功能正常 versus 萎缩性腺体）。据我们经验，目前尚无有效手段可增加胰液采集量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胰液的处理
<ol>
	<li>将胰液在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟，以去除细胞或碎片。 
	注意：胰液在离心前应呈清澈透明状。手术过程中有时可能发生血液污染，导致样本颜色更浑浊且偏红。建议将此类样本排除在后续分析之外。</li>
	<li>收集上清液，分装后于 -80 °C 保存，待后续分析使用。</li>
</ol>
3. 皮下肿瘤的诱导
注意：小鼠 Panc02 和 DT6606 细胞系分别由意大利米兰圣拉斐尔糖尿病研究所 Lorenzo Piemonti 教授和意大利都灵实验医学研究中心 Francesco Novelli 教授提供，如先前文献12所述。
<ol>
	<li>肿瘤细胞的培养
	<ol>
		<li>在含有10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素抗生素的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基中培养Panc02和DT6606细胞。</li>
		<li>根据细胞系的生长速率，在肿瘤接种前1-2周复苏冻存的细胞。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2和95%湿度的无菌条件下培养细胞。</li>
		<li>当细胞融合度达到80%时，使用0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液在37 °C下消化5分钟，并通过离心去除胰蛋白酶。 
		注意：DT6606细胞为来源于LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre小鼠的原代细胞，非永生化细胞，为保持其原始特性，接种in vivo前传代次数不应超过3次。建议在接种前7-10天复苏DT6606细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤细胞的in vivo接种
	<ol>
		<li>胰酶消化细胞（见步骤3.1.4），用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。离心去除PBS后，将细胞重悬于新鲜PBS中，再进行计数。</li>
		<li>计数后将细胞重悬于PBS中，浓度为0.5-1 × 107 个细胞/mL，以便最终注射剂量为每只小鼠100 μL含0.5-1 × 106 个细胞。细胞应过量准备。在操作结束前，将细胞置于4 °C或冰上保存。</li>
		<li>根据不同的细胞系或处理方式，将动物（8周龄雌性C57BL/6J小鼠）分组饲养于不同笼具中。</li>
		<li>手动固定动物，并使用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉，或按照本地批准的程序实施麻醉。</li>
		<li>使用电动剃毛器剃除注射部位（通常为腿部上方的侧腹部）的毛发，并用酒精仔细清洁注射区域。</li>
		<li>用1 mL注射器反复吹打细胞悬液，通过推拉活塞排除所有气泡。在注射器上安装25 G针头，并向上推动活塞，使细胞悬液充满至针尖开口处。</li>
		<li>用平头镊夹起侧腹部皮肤，将针头小心插入镊子间皮肤皱褶基部，避免穿刺腹腔或肌肉组织。为确认针头位置正确，可轻柔地在皮下横向移动针尖，应能自由滑动。</li>
		<li>缓慢注射100 μL细胞悬液（含0.5-1 × 106 个细胞），轻压注射部位数秒，然后在无横向移动的情况下缓慢拔出针头。</li>
		<li>将小鼠放回笼中，并监测其从麻醉中的恢复情况。</li>
		<li>使用游标卡尺监测肿瘤生长3-4周。当肿瘤体积达到约0.5-1 cm3时，采用CO2或本地批准的程序实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤间质液（TIF）的分离
<ol>
	<li>皮下肿瘤的切除
	<ol>
		<li>用纸胶带固定动物的四肢，并用酒精清洁皮肤。在腹部切开皮肤，将其与腹膜分离，并继续向上分离至四肢。使用&#160;剪刀、止血钳，必要时使用手术刀，切除 flank 部位皮下生长的肿瘤。</li>
		<li>称量肿瘤重量，并将其置于干净的离心管中，冰上保存，待后续进行肿瘤间质液（TIF）的分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过离心法分离 TIF
	<ol>
		<li>将肿瘤切成两半，用 PBS 快速冲洗两部分，并在滤纸上轻轻吸干，以去除多余的 PBS。尽可能快速完成这些步骤，以避免肿瘤组织中的液体蒸发。</li>
		<li>立即将肿瘤组织转移至固定在 50 mL 锥形管上的 20 μm 尼龙细胞筛网上。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 400 x g 离心 10 分钟。 
		注意：此低速离心可保持细胞完整性，避免细胞内成分污染 TIF。可通过下游实验检测细胞内物质是否泄漏，例如检测核糖体蛋白等细胞内管家蛋白的存在25。</li>
		<li>从管底收集 TIF，必要时分装，立即在干冰上速冻，并于 -80 °C 保存，直至进一步分析。 
		可选步骤：根据后续拟进行的蛋白质组学分析，可将样本用含蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 稀释，以防止特定分子降解。 
		注意：根据肿瘤的组成成分不同，某些极小的肿瘤可能无法获得任何液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过洗脱法分离 TIF
	<ol>
		<li>用剪刀或手术刀将肿瘤切成小块（≈1–3 mm3），并用冷 PBS 小心冲洗。 
		注意：此步骤中操作需迅速，尽量减少对组织的机械处理，以避免细胞损伤。</li>
		<li>将肿瘤组织块转移至 1.5 mL 离心管中，加入 500 μL 含蛋白酶抑制剂混合物的 PBS，以防止分析物降解。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
		<li>收集上清液并转移至新的 1.5 mL 离心管中。在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 5 分钟，以去除样品中的细胞成分。</li>
		<li>将上清液转移至新管中，在 4 °C 条件下以 2,000 x g 再次离心 8 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至另一新管中，在 4 °C 条件下以 20,000 x g 离心 30 分钟，以去除所有残渣。收集上清液，立即分装 TIF 样品，在干冰上速冻，并于 -80 °C 保存，直至进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中，我们描述了一种术中采集胰液的技术，胰液是一种尚未被充分研究的液体活检样本。我们近期的研究表明，胰液可作为疾病代谢标志物的来源12。对其他液体活检样本（如血液5,6,7、尿液8和唾液9）进行的代谢组学分析，在区分胰腺导管腺癌（PDAC）患者与健康个体或胰腺炎患者方面已显示出良好的应用前景。然而，胰液由胰腺导管细胞直接分泌，由于其与肿瘤部位非常接近，可能更能可靠地反映周围组织的改变，即使在疾病早期阶段也是如此。事实上，胰液的¹H-NMR谱数据能够有效区分PDAC患者与其他良性胰腺疾病患者，而血浆样本则未能实现这一区分。因此，尽管胰液相较于其他体液活检样本更难获取，但它代表了一种宝贵的临床生物标志物来源，有助于识别快速进展的疾病。本文描述了术中采集胰液的技术，但该方法也可在微创操作过程中实施，以期发现有价值...

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的肿瘤之一，即将成为癌症相关死亡的第二大原因1,2,3。PDAC以其免疫抑制的微环境以及对免疫治疗方案缺乏应答而广为人知4。目前，手术切除仍是唯一可能治愈PDAC的方法，但术后早期复发和手术并发症的发生率较高。由于在疾病晚期之前缺乏特异性症状，难以实现早期诊断，从而加剧了该疾病的致死性。此外，PDAC与其他良性胰腺疾病的症状存在重叠，可能导致现有诊断策略难以快速且可靠地确诊。识别与特定胰腺疾病相关的变量，有助于外科手术决策过程，并改善患者的个体化分型。
利用易于获取的体液（如血液5,6,7、尿液8、唾液9和胰液10,11,12）进行生物标志物发现已取得令人鼓舞的成果。许多研究采用基因组学、蛋白质组学和代谢组学等全面的“组学”方法，以鉴定能够区分胰腺导管腺癌（PDAC）与其他良性胰腺疾病的候选分子或分子特征。我们近期已证明，胰液这一相对未被充分研究的体液可用于识别具有不同临床特征患者的代谢特征谱12。胰液是一种富含蛋白质的液体，汇集了胰腺导管细胞的分泌物，经主胰管流入胆总管。由于其与胰腺位置相近，可能受到肿瘤组织引起的微环境扰动的显著影响（图1），因此相比血液、尿液或基于组织的分析，可能提供更丰富的信息。已有若干研究通过多种方法探索胰液在发现新型疾病生物标志物方面的潜力，包括细胞学分析13、基于质谱的蛋白质组学分析14,15、K-ras 和 p53 突变等遗传与表观遗传标志物的检测16,17、DNA甲基化改变18以及miRNA分析19。从技术上讲，胰液可通过术中采集，或通过内镜超声、逆行性胰胆管造影术，以及内镜下十二指肠液分泌采集等微创手段获取20。目前尚不明确采集技术在多大程度上影响胰液的成分。本文描述了术中采集的操作流程，并表明胰液可作为PDAC生物标志物的宝贵来源。
<img alt="胰腺肿瘤诊断示意图，突出显示用于肿瘤分析的胰液提取。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：胰液采集的示意图。（A）示意图显示胰液分泌进入胰管，并在手术过程中进行采集。插图为肿瘤微环境的放大图：胰液在胰管中收集由肿瘤细胞和基质细胞释放的分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在胰腺导管腺癌（PDAC）的遗传性和原位小鼠模型中收集胰液，有助于将这种生物流体应用于临床前机制研究；然而，该操作在技术上极具挑战性，且不适用于皮下移植瘤等较简单的模型。因此，我们选择肿瘤间质液（TIF）作为胰液的替代来源，因其具有与胰液相似的、反映周围组织异常变化的特性。间质液（IF）是一种细胞外液体，存在于血管和淋巴管之外，可浸润并包围组织细胞21。IF的成分既受器官血液灌注的影响，也受局部分泌作用的影响；事实上，周围细胞会主动合成并分泌蛋白质进入IF21。间质组织能够反映周围组织微环境的变化，因此可能成为多种病理状态下（如肿瘤）生物标志物发现的重要来源。TIF中富含局部分泌的蛋白质，可用于筛选潜在分子，进一步在血浆中验证其作为预后或诊断性生物标志物的价值22,23,24。多项研究已证实，TIF适用于高通量蛋白质组学分析方法，如质谱技术23,24,25，以及多重ELISA检测26和微小RNA（microRNA）表达谱分析27。
已提出多种用于分离肿瘤间质液（IF）的方法，这些方法 broadly 可分为 体内 方法（毛细血管超滤法28,29,30,31 和微透析法32,33,34,35）和 体外 方法（组织离心法22,36,37,38 和组织洗脱法39,40,41,42）。这些技术已被广泛而详细地综述过43,44。选择合适的方法时，应考虑下游分析与应用需求以及回收液体积等因素。我们最近采用该方法作为原理验证，以证明来自两种小鼠胰腺导管腺癌细胞系的肿瘤具有不同的代谢活性12。根据文献报道24,38，我们选择使用低速离心法，以避免细胞破裂及胞内成分的释放和稀释。肿瘤间质液（TIF）中葡萄糖和乳酸的含量反映了这两种不同细胞系各自的糖酵解特征。本文中，我们将详细描述分离肿瘤间质液（TIF）最常用的两种方法的实验方案：组织离心法和组织洗脱法（图2）。
<img alt="肿瘤分离示意图；离心法；洗脱缓冲液；试管中的间质液。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61687/61687fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：肿瘤间质液分离方法的示意图。本方案中详细描述的技术示意图，即组织离心法（A）和组织洗脱法（B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61687/61687fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Greiner BioOne</td><td>GR616201</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m 尼龙细胞筛</td><td>pluriSelect</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 mL K2EDTA 真空采血管</td><td>BD Biosciences</td><td>366473</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309656</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Medicon</td><td>06.20.12</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Medicom</td><td>9000-10</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Microtech</td><td>MG10432</td><td></td></tr><tr><td>平头镊</td><td>Medicon</td><td>06.00.10</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Lonza</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>34044100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Euroclone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Medicon</td><td>02.04.09</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 1x</td><td>Lonza</td><td>BE17-161F</td><td></td></tr><tr><td>UltraGlutamine 100x</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E/U1</td><td></td></tr></tbody></table>

分离邻近液体以研究胰腺导管腺癌的肿瘤微环境

Isolation of Proximal Fluids to Investigate the Tumor Microenvironment of Pancreatic Adenocarcinoma

胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第四大原因，即将成为第二大原因。迫切需要发现与特定胰腺疾病相关的变量，以辅助术前鉴别诊断和患者特征分析。胰液是一种相对未被充分研究的体液，由于其靠近肿瘤部位，能够反映周围组织的改变。本文详细描述了术中胰液采集的操作流程。遗憾的是，将胰液采集技术应用于PDAC的小鼠模型以开展机制研究，在技术上极具挑战性。肿瘤间质液（TIF）是指存在于血液和血浆之外、浸润并包围肿瘤细胞和基质细胞的细胞外液。与胰液类似，由于TIF具有富集那些在血浆中被稀释的分子的特性，因此可被用作微环境变化的指示剂，并作为疾病相关生物标志物的重要来源。由于TIF不易直接获取，已有多种分离技术被提出。本文介绍了两种操作简便且技术要求较低的TIF分离方法：组织离心法和组织浸提法。

我们采用上述方法获取了来自胰腺导管腺癌患者（n=31）及其他良性胰腺疾病患者（非胰腺导管腺癌，n=9）的胰液，后者包括胰腺炎（n=2）、壶腹乳头肿瘤（n=4）、神经内分泌肿瘤（n=2）以及导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN；n=1）。12胰腺液样本随后采用核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）进行代谢组学分析1氢核磁共振（H-NMR）12通过滤除大分子（如脂蛋白、脂质等）的宽核磁共振信号，我们能够详细观察到小分子量代谢物，如一维 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）谱图所示。图3A）。有监督的OPLS-DA分析显示，胰液中检测到的代谢谱能够区分胰腺导管腺癌（PDAC）与非PDAC患者，经交叉验证获得的准确率为82.4%（图3B）。有趣的是，对同一患者血浆样本进行的代谢组学分析并未获得相同的区分能力（通过交叉验证得到的准...

胰液是人类胰腺癌生物标志物的宝贵来源。本文介绍了一种术中采集胰液的方法。为克服在小鼠模型中应用该方法的困难，我们提出了一种替代样本——肿瘤间质液，并在此描述了两种分离肿瘤间质液的实验方案。

胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第四大原因，即将成为第二大原因。迫切需要寻找新的变量……

本文所述在人类和小鼠中分离近端液体的方法，可用于研究胰腺癌的微环境，以鉴定新的疾病生物标志物。通过这一简便的方案，可将来自胰液的临床发现转化为胰腺导管腺癌（PDAC）的小鼠模型，从而开展机制性研究。胰液是一种尚未被充分探索的体液，已显示出作为宝贵生物标志物来源的潜力，有助于术前诊断和患者分型。我将演示实验方案的第一部分，我们实验室的博士后 Marialuisa Barbagallo 将演示方案的第二部分。根据成像过程中获得的测量数据，估算胰管的位置，然后触诊胰腺的前表面以确定其精确位置。用左手从下方托住十二指肠内的胰头并抬起，用食指标记胰管的位置。右手持一支3毫升注射器，针头为25号，将其插入胰腺，进针位置位于左手拇指远端。根据术前测量结果以及针尖穿透导管壁时的手感，确定针头刺入的深度和倾斜角度。用注射器抽出胰液。如果无法获取胰液，可调整针头位置，尝试重新穿刺胰管。一旦获取胰液，将其移出无菌区域，并转移至一支3 mL含EDTA的真空采血管中。将试管置于 4 °C 保存，直至样本转移至实验室。处理胰液时，在 4 °C 条件下以 400 ×g 离心 10 分钟，以去除细胞或碎片。收集上清液，分装后于 -80 °C 保存，待进一步分析。通过离心法分离肿瘤间质液（TIF），将肿瘤切成两半，用PBS冲洗两部分，并在滤纸上轻轻吸干，操作过程应尽可能迅速，以避免肿瘤液体蒸发。立即将肿瘤转移至固定在50毫升锥形管上的20微米尼龙细胞筛中。在4摄氏度下以400 G离心10分钟。从管底回收TIF，然后将其分装并立即在干冰上速冻。保存于-80摄氏度，直至进一步分析。若通过洗脱法分离TIF，需用剪刀或手术刀将肿瘤切成小块，并用预冷的PBS小心冲洗。将肿瘤组织块转移至1.5毫升离心管中，加入500微升含蛋白酶抑制剂混合物的PBS，以防止分析物降解。将组织在37°C和5%二氧化碳条件下孵育1小时。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并在4°C下进行一系列离心步骤，以去除样品中的细胞成分。每次离心后回收上清液，并转移至新管中。最后一次离心后，立即在干冰上对TIF样品进行分装并冷冻。保存于-80 °C，直至进一步分析。本方案用于获取胰腺导管腺癌（PDAC）及其他良性胰腺疾病患者的胰液。在滤除大分子物质的宽泛核磁共振（NMR）信号后，小分子量代谢物的信号变得清晰可见。有监督的OPLS-DA分析显示，胰液中的代谢谱能够区分PDAC与非PDAC患者，准确率达82.4%。有趣的是，对同一患者血浆样本进行的代谢组学分析并未获得相同的鉴别能力。为了证明肿瘤间质液成分能够可靠地反映肿瘤微环境的变化，将两种糖酵解速率相反的胰腺癌细胞系皮下注射至小鼠体内。切除肿瘤后，定量分析了葡萄糖和乳酸的浓度。高糖酵解肿瘤的间质液中葡萄糖含量较低，而乳酸含量高于低糖酵解肿瘤。在本研究中，我们进行了代谢组学分析。然而，这些近端液体也适用于许多其他下游应用，例如质谱分析和微小RNA谱型分析。

isolation-proximal-fluids-to-investigate-tumor-microenvironment

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

分离近端液研究胰腺腺癌肿瘤微环境

癌症干细胞（CSCs）已在多种恶性肿瘤中被发现。本方案描述了一种流式细胞术方法，利用醛脱氢酶活性以及CD44和CD24的表达，从人胰腺导管腺癌异种移植瘤中分离癌症干细胞。这些活细胞随后可用于功能性和分析性研究。...

从人胰腺癌异种移植瘤中分离干细胞

本报告中，我们描述了一种用于分离高度纯化的肿瘤浸润白细胞群体的实验方案。该方案改编自 Miltenyi Biotech...

从原发性肿瘤中分离免疫细胞

本文介绍了从人胰腺导管腺癌（PDAC）组织中分离胰腺癌干细胞（CSCs）的技术。这些CSCs用于研究药物处理对肿瘤功能影响的实验研究 体外...

胰腺导管腺癌干细胞分离：一种从胰腺肿瘤中分离癌症干细胞的方法

胰腺癌干细胞（CSCs）可被扩增 体外...

研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略

本文介绍一种从胚胎期、新生期和成年小鼠胰腺组织中分离胰腺微环境中细胞的方法，重点在于间充质细胞的分离。该方法可用于分析细胞的基因表达和蛋白质分泌，从而阐明调控胰腺发育、功能及肿瘤发生过程中的外在信号。...

通过流式细胞术分离和分析胰腺间充质细胞

小鼠原位胰腺导管腺癌同种移植瘤免疫表型分析的实验步骤旨在对肿瘤免疫微环境进行特征分析。通过手术将肿瘤原位植入小鼠体内。收获体积为200–600...

通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）KPC 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

胰腺导管腺癌的患者来源类器官培养是一种快速建立的三维模型，能够高保真地代表上皮肿瘤细胞区室，为这种致命恶性肿瘤的转化研究提供了有力工具。本文中，我们提供了建立和扩增类器官以及利用这些模型进行相关生物学检测的详细方法。...

患者来源的胰腺导管腺癌类器官模型的分离与表征

本方案描述了原位胰腺肿瘤的手术建立方法以及新鲜分离的小鼠胰腺肿瘤的快速消化过程。消化后，可获取具有活性的免疫细胞群体，用于后续分析，包括 离体...

原位胰腺肿瘤的构建与 离体 肿瘤浸润性T细胞毒性的表征

本方案描述了器官型脑片培养物（OTSCs）的制备方法。该技术有助于 离体 完整多细胞组织的培养。OTSCs...

作为原发性胰腺癌及转移癌肿瘤微环境临床前模型的器官型脑片培养

胰腺化生细胞是可发展为胰腺肿瘤的恶性细胞前体。然而，分离完整且具有活性的胰腺细胞具有挑战性。本文介绍一种高效的胰腺组织解离方法，所获得的细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维、三维共培养实验。...

胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

肿瘤类器官已彻底改变了癌症研究及个体化医疗的方法。它们代表了一种具有临床相关性的肿瘤模型，使研究人员能够在临床治疗中领先于肿瘤的发展。本方案建立了源自新鲜胰腺肿瘤组织样本及胰腺腺癌患者来源异种移植瘤的肿瘤类器官。...

从新鲜组织建立胰腺癌来源的肿瘤类器官和成纤维细胞

了解术中采集胰液及分离肿瘤间质液的方法，用于胰腺导管腺癌生物标志物研究。该方案支持人类与小鼠模型的转化研究，助力揭示肿瘤微环境机制。

分离邻近液体以研究胰腺导管腺癌的肿瘤微环境

探索更多视频