Name: 橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的中子射线照相和生物系统计算机断层扫描 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 了解橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆的中子射线照相和计算机断层扫描技术，用于生物样本的三维氢含量和水分布成像。该方法可无损检测大鼠股骨植入物、小鼠肺部及植物根系土壤系统。

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本研究的部分工作利用了由橡树岭国家实验室（ORNL）运行、美国能源部科学办公室用户设施资助的高通量同位素反应堆资源，合同号为 DE-AC05-00OR22725（UT-Battelle, LLC）。本研究的部分工作通过橡树岭国家实验室尤金·维格纳杰出职员奖学金项目获得支持。本研究还得到了美国能源部科学办公室生物与环境研究办公室的资助。大鼠股骨样本来自与拉什大学医学中心 Rick Sumner 博士合作开展的实验，相关经费来自美国国立卫生研究院（R01AR066562）以及骨科研究与教育基金会-史密斯与尼弗奖。研究团队谨向高通量同位素反应堆（HFIR）的支持团队致以感谢，正是他们的工作使得中子散射光束线的使用成为可能。

1. 仪器设置（参见图3，第3节）
<ol>
	<li>在光束线计算机上，打开终端窗口，输入 css，然后按 Enter 键以启动用户界面。</li>
	<li>如果未默认打开，请在 菜单 选项卡中选择 用户主界面，以打开 实验物理与工业控制系统（EPICS）成像界面。</li>
	<li>使用界面中的第一个选项卡（名为 提案/相机/SE设备），通过点击 相机/探测器 旁边的 光学元件 按钮来选择光束线光学配置，即通过点击 狭缝 按钮设置 针孔光阑尺寸 和 狭缝系统开度。</li>
	<li>将旋转台固定在XY平移台上（样品将放置于此），并安置探测器（sCMOS或CCD）。
	<ol>
		<li>对于CCD或sCMOS探测器，请与仪器团队协商，选择能够提供所需空间分辨率和焦距的镜头。首先使用可见光进行对焦，可通过移动探测器使其靠近或远离反射镜，或在探测器位置固定时手动调节镜头实现。将图像对焦至中子闪烁体所在位置。</li>
		<li>对于CCD或sCMOS探测器，使用紧贴探测器闪烁体放置的中子吸收分辨率掩模37&#160;，利用中子进一步微调镜头对焦。通过不同设置（即在EPICS中通过移动探测器电机自动改变探测器相对于反射镜的位置）连续采集射线照相图像。</li>
		<li>使用ImageJ/Fiji39&#160;或其他类似图像分析软件，通过评估线对图像来比较不同射线照相结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>必要时，将样品固定于合适的容器中（铝制容器和/或高强度铝箔），并将样品尽可能靠近探测器放置在旋转台上。使用中子屏蔽材料（含硼橡胶）和γ射线屏蔽材料（铅砖）对探测器及设备进行屏蔽。</li>
	<li>测量样品到探测器的距离，然后取下样品。替换为分辨率掩模，以评估在此光束线配置下样品位置处的像素尺寸。利用已知尺寸的特征结构，测量其在图像中所占的像素数量，从而确定像素尺寸。</li>
	<li>将样品重新放置到旋转台上。</li>
	<li>使用EPICS界面中的 对齐样品 选项卡，通过在样品移动过程中连续采集快速（毫秒至1秒）射线照相图像，直至样品完全处于探测器视野内，完成样品与中子束的对准。将样品对准参数保存为.csv文件，该文件将在CT扫描开始前重复使用。</li>
	<li>在开始CT扫描前，使用 对齐 选项卡中的自动 CT对准检查 功能，通过在不同样品取向下实时生成并评估射线照相图像，确认样品在各个角度下均保持在视野范围内。</li>
</ol>
2. 样品制备与数据采集策略
注意：小鼠肺部的动物样本方案已获得田纳西大学机构动物护理和使用委员会的批准，大鼠股骨的方案已获得拉什大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。&#160;
<ol>
	<li>大鼠股骨
	<ol>
		<li>植入钛6铝4将直径1.5 mm、长度15 mm的V棒插入雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨中，通过股骨远端髁将其置于髓腔内。</li>
		<li>12 周后处死大鼠，取下股骨。去除所有软组织（软组织会导致中子衰减），并将带有植入物的股骨包裹在生理盐水浸湿的纱布中冷冻保存。将 2 英寸见方的纱布海绵完全浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，每个样本均用这些浸湿的海绵完全包裹（参见 材料表).</li>
		<li>将股骨解冻至室温，用于基于X射线的显微CT扫描38，然后将其冷冻运输至HFIR。
		<ol>
			<li>在进行中子计算机断层扫描（nCT）之前，将样品在靠近CG-1D中子成像束线的高通量同位素反应堆生物安全二级（BSL2）实验室中重新解冻，并使其升至室温。待样品达到室温后，用高强度铝箔包裹，并置于铝制圆筒中。</li>
			<li>将圆柱体垂直放置在光束线的旋转台上，并在室温下于光束线处对股骨进行0至360度的扫描&#176;，步进角度为0.25&#176;每张放射图像采集 50 秒。 
			&#8203;注意：考虑到旋转台移动的死区时间以及每张放射图像从CCD传输到数据采集计算机所需的时间，扫描总时间约为24小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在完成中子计算机断层扫描（nCT）且样本获准从光束线移出后，将样本带回BSL2实验室，拆除封装，并重新冷冻样本以保存，用于后续实验测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠肺脏
	<ol>
		<li>从与本研究无关的实验所用死亡小鼠中切除肺组织。在进行中子实验前，将样品固定于70%乙醇溶液中。</li>
		<li>用耐用的铝箔包裹组织样本，并从BSL2实验室直接运送至CG-1D束线。将样本放入铝制圆筒中，以实现双重封装并确保在中子计算机断层扫描（nCT）过程中样本在光束中的位置保持固定。</li>
		<li>将样品置于靠近CCD的位置，并在室温下过夜进行扫描。 
		注：每张射线照相曝光时间为150秒，旋转步进角度为0.5&#176;，从 0 到 182&#176;扫描总时长约为16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>草本植物根系/土壤系统 
	&#8203;注意：与其他生物样品类似，由于氢（尤其是土壤或植物根系中的水）对中子具有强衰减作用，植物-土壤系统的尺寸受到限制。种子或分株可种植于容器中（铝或石英材质，二者均具有较低的中子衰减截面），或可将较成熟的植物移植到容器中。
	<ol>
		<li>小心地挖掘并移栽生长在现场的一种本地草本植物（此处为葎草叶葎草（Fatoua villosa （Thunb.）Nakai）放入横截面为 2.38 cm × 2.58 cm、高 6.3 cm、壁厚 0.055 cm 的铝制容器中，容器内装有纯砂（SiO₂）2).</li>
		<li>用去离子水冲洗植物根部，并在铝制容器中仔细展开根系，同时向容器内填充湿沙浆。 
		&#8203;注意：用土壤填充容器时，必须使用湿土，因为干土会按颗粒大小分离，从而在容器中产生质地上的伪影12,13.</li>
		<li>种植后，测量植物系统的饱和质量，并每天称重以评估其用水速率。通过容器顶部的土壤表面，或使用管子或注射器经由容器底部的端口或孔洞进行加水。 
		&#8203;注意：此处将植物系统置于天平上，每天根据重量补充水分以替代每日的水分消耗。成像前可停止供水以降低土壤含水量，从而增强根系的对比度。</li>
		<li>在受控温光的原位生长室中培育植物系统12成像前将植物系统维持1周，以使植物根系适应铝制容器。 
		&#8203;注意：一旦开始成像，切勿给植物浇水。</li>
		<li>每次nCT扫描持续约1.75小时，在2.5天内连续扫描，以绘制土壤和植物水分含量的动态三维变化图。进行这些测量时，将空间分辨率降低至几百微米 &#956;以时间分辨率为优先（即每个投影的采集时间更短）。 
		&#8203;注意：每次CT扫描的旋转角度均为0.93&#176; 每次投影的采集时间为10秒。本论文仅展示第一次CT扫描结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据采集
注意：CG-1D 的数据采集系统采用 EPICS&#160;软件40。EPICS 的设计旨在引导实验流程并最大限度减少人为误差；该界面会按照逻辑顺序逐步执行测量样品前所需的各项步骤，如图3所示。&#160;EPICS 数据采集流程如下（图3）。左侧部分显示正在进行的实验状态、电机位置以及实验详细信息（样品信息、项目编号和团队成员）。每个实验均关联一个项目编号，以及一个或多个样品。项目相关信息，如团队成员和选定的样品名称，也可在右侧查看（第一个标签页名为“Proposal/Camera/Sample Environment Device”）。中间部分包含当前的放射图像，侧边附有动态范围标尺，图像下方则显示状态和日志信息。&#160;
<ol>
	<li>选择第一个标题为Proposal/Camera/SE Device的EPICS选项卡。点击Switch Proposal or Sample按钮。在已替换先前选项卡的List of Proposals（左侧）和Sample（右侧）中，选择待测量的项目编号和样品ID#。</li>
	<li>使用返回箭头返回主EPICS界面。在Camera/Detector下拉菜单中选择要使用的探测器（sCMOS或CCD），可选的四种探测器包括：Andor CCD、Andor sCMOS、SBIG CCD或MCP。 
	注：SBIG CCD由仪器用于测试，本稿件中可忽略。</li>
	<li>在Sample Environment Device部分选择要使用的旋转台。
	<ol>
		<li>首先，在Sample Environment Device列表中点击Rotation Stage (CT Scan)，然后选择其中一个旋转台（对应待扫描的样品）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，在选项卡底部选择数据采集模式。此处选择第一个选项White Beam。 
	注：CG-1D光束线的数据采集模式分为白光束（覆盖整个中子波长范围）或单色光束两种。</li>
	<li>选择第二个标题为Align Sample的EPICS选项卡。输入样品文件名，然后按Enter键。对子文件夹名称重复此操作。 
	注：EPICS界面已编程为自动将数据保存至正确的实验目录中，供内部重建软件使用，以生成待研究三维物体的二维（2D）切片。第二个选项卡Align Sample允许使用仅需数秒曝光的放射图像进行样品对齐，这些图像不用于后续的数据处理与分析。当所有电机正确就位后，其位置可保存为.csv文件格式；因此，每个样品对齐均有对应的.csv文件，可在后续调用以重新定位样品进行CT扫描。</li>
	<li>跳过三个电机的对齐步骤，即假设样品已对齐并准备进行CT扫描。选择所需的采集时间，然后点击Take Quick Images按钮。采集一系列不同曝光时间的放射图像以评估信噪比（SNR）。</li>
	<li>打开ImageJ/Fiji软件；将不同的放射图像拖放至软件中。绘制一条从样品区域延伸至空白区域的剖面线，评估信噪比（SNR）。</li>
	<li>若在XY载物台上设置了多个样品（多个旋转台，每个对应一个样品），在对齐后记录每个样品的位置，并通过点击Save in a File按钮将数据保存为.cvs文件。</li>
	<li>选择第三个标题为Collect Data的EPICS选项卡，以设置CT扫描参数。在第一条可编辑行中输入文件名，然后按Enter键。对子文件夹名称重复此操作。 
	注：Collect Data选项卡的布局取决于在第一个选项卡中选择的是时间序列放射图像（无SE）还是CT扫描（选择旋转台）。</li>
	<li>在Align Sample Using the Saved File部分，选择先前记录样品电机位置的文件（步骤1.8）。使用Recently Saved Files浏览最近保存的样品对齐文件。点击Align Using File，使样品重新回到中子束中的正确位置。</li>
	<li>根据奈奎斯特采样定理计算CT所需的投影数量。计算样品水平方向上的像素数，并乘以1.5，以获得满足奈奎斯特采样要求的投影数量。</li>
	<li>输入旋转起始角度（通常为0°）、旋转终止角度（通常为180°）、旋转步长、每步图像数量（通常设为1）以及每幅图像的曝光时间。点击Collect Data按钮开始CT扫描。</li>
</ol>
4. 体积重建与数据处理/分析
注意：CG-1D 用于数据归一化、重建和分析的所有软件工具均可在 ORNL 设施的 Python 代码仓库以及设施的分析服务器上获取。对于二维测量，可使用 Jupyter Python 笔记本进行预处理41。笔记本示例见图4。&#160;用户可在选择样本外部感兴趣区域之前加载并预览数据，该区域用于将任何光束波动归一化至 1（或 100%）透射率。这些笔记本可根据每次测量进行调整，使预处理变得简便直接。此外，可在同一笔记本中进行二维分析，例如随时间追踪样本中的动力学变化（如样本中的水分吸收）。
<ol>
	<li>使用用户名和密码登录 Linux 分析服务器。打开网页浏览器，输入 jupyter.sns.gov。</li>
	<li>打开名为 iMARS3D 的 Python Jupyter 笔记本。运行代码的前几行（这些代码将加载运行 iMARS3D 所需的工具）。加载样品数据、平场（flat）和暗场（dark field）数据。确认这三个数据集均已正确加载。</li>
	<li>继续进行数据裁剪、滤波（根据需要）、归一化（含自动样品倾斜校正）以及体层重建（耗时较长的过程）。将数据保存到名为 Shared 的项目编号文件夹中。随后启动 AMIRA36（该软件也可在设施的分析服务器上获取），在软件中加载重建后的切片，并进行可视化、进一步滤波和分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生物样品的中子成像与计算机断层扫描（CT）是具有前景的成像技术，可作为X射线成像或磁共振成像的补充手段。开展生物样品中子成像实验的关键步骤主要涉及样品的制备及其在光束线上的封装。实验的优化取决于所要回答的科学问题。若科学问题要求高空间分辨率以观察特定现象，则需要较长的采集时间；而中子CT（nCT）的局限性在于其视场尺寸为厘米量级，完成一次扫描通常需要数小时。这主要是由于反应堆提供的中子总通量与同步辐射光源的X射线通量之间存在显著差异，后者可在数秒至数分钟内完成数毫米样品的CT扫描。2 视野。尽管该方法可应用于从动物体内提取的离体组织样本，但由于辐射暴露风险（例如中子产生的伽马射线以及中子与样本中原子的相互作用），无法将其扩展至活体动物或人体的在体应用。然而，该方法非常适用于植物根系与土壤相互作用的成像研究。图7例如水分吸收动态。
使用快速中子计算机断层扫描（nCT）研究植物动态过程的优势在于其对水中的氢（H）具有高灵敏度，并且不会像X射线CT那样对植物造成辐射损伤。此外，在骨骼/金属样品（如大鼠股骨）中使用中子可获得独特的对比度，其中金属相对于周围组织呈现较透明的状态（图5），从而有可能避免X射线CT引起的金属伪影39。动物组织（如小鼠肺组织）（图6）能够清晰显示软组织结构，这是因为中子对氢（H）敏感，但此类测量的空间分辨率在一定程度上受到限制。生物样品中存在的氢原子提供了图像对比度19,39。&#160;
随着中子光栅干涉等新技术的发展以及空间分辨率的提高（最近已有报道称达到几微米42,43），中子成像可能为生物组织提供具有更高空间分辨率的全新对比机制。探索更高能量的中子（以实现对较厚样品的测量）也有望能够测量动物组织的更大切片，例如完整的小鼠，从而为生物医学研究带来新的可能性。&#160;

中子成像（nR）的原理基于中子穿过物质时发生的衰减现象。与被原子核外电子云散射的X射线不同，中子可被原子核吸收或散射。中子对氢（H）等轻元素具有较高的灵敏度，因此可用于动物1,2,3,4,5,6,7、人体组织8,9以及地下土壤/根系系统10,11,12,13,14,15等生物学应用的成像。中子成像是一种与X射线成像互补的技术，后者适用于检测重元素16,17,18。基于衰减的中子成像遵循样品材料的线性衰减系数及样品厚度，其规律由比尔-朗伯定律描述：透射束强度与材料的量及其在材料中通过的路径长度成正比。因此，透射率 T 可按以下公式计算：
<img alt="透射方程 T=I/I0=e^(-μx)，指数衰减公式，光学吸收概念。" src="/files/ftp_upload/61688/61688eq01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> (1)
其中，I0 和 I 分别为入射光束和透射光束的强度；µ 和 x 分别为均匀样品的线性衰减系数和厚度。衰减系数 µ 由下式给出：
<img alt="摩尔吸光系数公式，μ=σ(ρNA/M)，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/61688/61688eq02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2"> (2)
其中，σ 为样品的中子衰减截面（包括散射和吸收），ρ 为其密度，NA 是阿伏伽德罗常数，M 是其摩尔质量。
使用低能中子（即能量低于0.5 eV）对生物样品进行放射成像时，其对比度主要源于氢（H）密度的变化（在样品厚度固定的情况下）。这归因于中子与氢原子核发生相互作用的概率高于与其他存在于生物样品中的原子核的相互作用概率，同时氢原子的密度至关重要，因为氢是生物样品中含量最丰富的原子。
自早期以来，中子成像（nR）和中子计算机断层扫描（nCT）已广泛应用于材料科学和工程领域19,20,21,22,23。20世纪50年代中期，首次开展了中子对生物样品中氢（H）敏感性的示范实验，当时测量了植物标本24。这项工作在20世纪60年代得以延续，例如对人体胸部25或大鼠26进行放射成像，并探索了使用钆氧化物（Gd2O3）等对比剂的可能性。此外，有研究假设人体肿瘤组织与正常组织之间的对比度差异源于局部氢含量的增加。在这些初期试验中，研究人员得出结论：提高中子通量和空间分辨率将改善nR的成像质量，并可能使其作为工业或生物医学应用的补充技术而得到更广泛的应用。最近的研究包括对癌症组织标本1和动物器官切片2,3,27进行的nR和nCT测量，用于生物医学和法医学应用。
位于美国田纳西州橡树岭国家实验室的高通量同位素反应堆（High Flux Isotope Reactor, HFIR）是一种强大的中子源，通过裂变反应产生中子。这些中子的能量约为 2 MeV，在反应堆池中通过与重水的动能相互作用被“冷却”，使其能量降至约 100–300 eV。无论进行的是中子散射还是成像实验，优化中子实验的第一步都是理解中子源和束线的特性，例如束流强度、能量分布以及背景信号（快中子、延迟中子、γ射线）的影响。在中子成像束线所在的 HFIR 冷中子导管大厅中，中子进一步通过与液态氢慢化剂的动能相互作用而被“冷却”。随后，中子通过弯曲导管系统传输，偏离源的直视路径，从而消除快中子和γ射线的干扰。如图1所示，CG-1D 中子成像束线28,29位于一条冷中子导管上，这意味着中子能量范围从几个 meV 到几十个 eV（在本例中，对应的可用中子波长范围为 0.8 至 10 Å），在样品位置处的通量约为 107 n/(cm2∙s)。一个由电机驱动的光阑/散射器系统定义了成像仪器的针孔几何结构。中子在充满氦气（He）的飞行管中传播 6.59 m，飞行管两端为铝（Al）窗。飞行管用于传输中子，同时限制空气散射，使束流强度损失最小化。在本文所述的测量中，散射器由封装在铝容器中的 1 mm 厚、50 nm 的氧化铝（Al2O3）纳米粉末制成。该散射器可减少来自中子导管的束流伪影（这些伪影会被成像束线的针孔几何结构放大），否则在放射图像中会出现明显的水平和垂直强度波动，导致数据归一化变得困难。在本研究展示的实验中，中子通过一层 25 μm 厚的氟化锂-6/硫化锌荧光体（6LiF/ZnS:Ag）转换为可见光。
准直优化取决于样品与探测器之间的距离、所需的空间分辨率以及采集时间。当样品距离闪烁体几厘米时，高准直度（L/D 大于 800，其中 L 为针孔孔径（直径为 D）到探测器的距离）可在牺牲中子通量的前提下获得更高的空间分辨率。而在原位动态研究中，当时间分辨率优先于空间分辨率时，宜采用低准直度（L/D 小于 800）。在本论文所述的测量中，L/D 和空间分辨率分别约为 355 和 75 μm，分别。时间分辨率根据信噪比（SNR）而变化。样品尽可能靠近闪烁体放置，以减少几何畸变（如模糊）。可通过平移和旋转样品台将样品置于靠近探测器的位置，并进行计算机断层扫描（CT）。CG-1D提供三种类型的探测器：一种电荷耦合器件（CCD），其像素阵列为2048像素 × 2048像素，像素间距为 13.5 μm，一种科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）探测器，具有2560像素 × 2160像素，像素间距为 6.5μm以及微通道板（MCP）探测器30,31 512 像素 × 512 像素，像素尺寸为 55μm散射的中子被约5 mm厚的含硼橡胶吸收，以保护探测器芯片免受中子照射。这种吸收会产生伽马射线，可在含硼橡胶与探测器之间放置铅（Pb）以阻挡。每个探测器均针对不同的视场（FOV）以及空间和时间分辨率进行了优化。在大鼠股骨和小鼠肺部的测量中，采用了电荷耦合器件（CCD）探测器，因其具备较大的视场（约7 cm × 7 cm）和适当的空间分辨率（约 75μm使用sCMOS探测器对植物根系/土壤系统进行中子计算机断层扫描（nCT），目的在于以尽可能快的速度获取nCT图像，代价是视野（FOV）受限（约为5 cm × 4.2 cm），因此空间分辨率明显降低。在这些探测器中，中子通过转换为光信号或α粒子以实现探测。通过围绕样品垂直轴旋转，并在连续的旋转角度下采集放射影像，可实现nCT的获取。通过使用本单位开发的基于Python的Jupyter滤波反投影（FBP）笔记本iMARS3D、pyMBIR或商业软件，可获得待测样品的三维体层渲染模型，具体方法如下所述。
最后，未与样品或探测器发生相互作用的中子将被收集到位于探测器系统下游约1米处的束流挡板位置，以最大限度地减少背景噪声。CG-1D束流挡板宽0.75米、高0.5米、厚35毫米，由环氧树脂中的碳化硼（B4C）制成。在中子束入射区域，束流挡板 дополнительно增强有10毫米厚、含95%富集碳酸锂（6Li2CO3）的耐火环氧树脂，并设计有内衬6Li、铅（Pb）和钢的空腔，用于容纳高通量的次级伽马射线。束流挡板直接连接至光束线的钢制屏蔽墙。CG-1D光束线的照片见图2。
分别使用三种重建软件对三个实验数据进行三维重建。小鼠肺样本的重建采用商业重建软件 Octopus32，该软件基于滤波反投影（FBP）算法。Octopus 软件运行于服务器计算机上，可用于对光束线采集的数据进行重建。CG-1D 站点提供一种名为 iMARS3D 的重建软件，其基于开源代码 TomoPY33，并增加了自动倾斜校正、后处理滤波等功能。iMARS3D 包括数据的预处理（背景与噪声扣除）、裁剪、中值滤波（用于校正伽马射线干扰和坏像素）、自动光强波动校正以及样品倾斜校正。在生成正弦图后，可选择进一步的数据处理步骤，如环形伪影去除和图像平滑。重建过程中的各个步骤均保存在分析服务器上（随后转移至课题共享文件夹），而最终的二维切片则立即存储于课题共享文件夹中。大鼠股骨样本使用 iMARS3D 进行重建。植物根系/土壤样本的预处理通过 TomoPY 进行中值滤波，随后利用 Python 的 SciPy 库进行旋转轴校正。重建过程采用自主研发的 Python 软件包 pyMBIR（基于 ASTRA 工具箱34 的内核构建），该软件包实现了一系列断层重建算法，从基础的 FBP 到先进的基于模型的迭代重建技术35，能够在极稀疏且噪声严重的中子数据集上获得高质量重建结果。上述所有重建工具生成的体数据均以衰减对比度呈现。所有可视化操作均使用商业化的可视化、分割与数据分析软件 AMIRA36 完成。
本手稿旨在展示在HFIR CG-1D束线使用中子成像（nR和nCT）的操作流程。本研究还展示了当前最先进的中子成像技术在生物样品中的应用能力，具体包括小鼠肺组织、大鼠骨骼以及植物根系/土壤系统。选择小鼠肺组织用于说明中子对肺组织成像的互补性优势，而X射线则主要对骨骼敏感。骨骼样品为带有钛（Ti）植入物的大鼠股骨，从而可展示骨骼与金属之间的对比度，并可观察骨/金属界面（由于金属对X射线有强烈衰减，该界面难以用X射线成像4）。最后，植物根系-水系统展示了中子计算机断层扫描（nCT）对根系/土壤系统进行原位三维（3D）成像的能力。此外，该案例还说明了使用中子成像（nR）对生物样品成像的优缺点。显然，该方法可安全用于测量植物根系系统中的水分动态，但由于辐射暴露风险，不能将其视为活体动物或人类的成像技术，因此其应用仅限于对（死亡）小鼠或类似病理学检测的研究，例如从患者（动物或人类）体内切除组织样本，经固定处理后置于中子束中进行测量。

<table><tbody><tr><td>铝制容器</td><td>定制</td><td></td><td>由铝板或铝管制成（可选石英），适用于植物和小鼠样品</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher</td><td>01-213-100</td><td>用于包裹小鼠肺组织样品</td></tr><tr><td>去离子水或重水</td><td></td><td></td><td>水或D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O可用于增强对比度，适用于植物样品</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>04-355-223</td><td>用于小鼠肺组织样品</td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>CardinalHealth</td><td></td><td>完全浸没于磷酸盐缓冲液（PBS）中，用于包裹样品，适用于大鼠股骨样品</td></tr><tr><td>生长室</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td>任何可控制环境条件的生长室或温室均可使用，适用于植物样品</td></tr><tr><td>实验室天平</td><td></td><td></td><td>可使用植物称重系统来测定土壤中的实际含水量，适用于植物样品</td></tr><tr><td>纯二氧化硅砂</td><td>US Silica Co.</td><td>Flint#13</td><td>纯SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;相较于土壤具有较低的中子衰减，适用于植物样品</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley大鼠</td><td>Harlan</td><td>订单编号：002-US</td><td>用于大鼠股骨样品</td></tr><tr><td>钛棒</td><td>Goodfellow</td><td>TI007905</td><td>用于大鼠股骨样品</td></tr></tbody></table>

在美国橡树岭国家实验室高通量同位素反应堆上对生物系统进行中子射线照相与计算机断层扫描

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

中子历史上已被广泛应用于多种生物学研究，所采用的技术包括小角中子散射、中子自旋回波、衍射以及非弹性散射等。与在倒易空间中获取信息的中子散射技术不同，基于衰减的中子成像在实空间中测量信号，其空间分辨率可达数十微米量级。中子成像的原理遵循比尔-朗伯定律，基于对样品整体中子衰减的测量。某些轻元素（尤其是氢）对中子具有较强的衰减能力，而这些元素正是生物样品的主要组成成分。类似于医学成像中的做法，可以使用氘、钆或锂化合物等对比剂来增强成像对比度，这与光学成像、磁共振成像、X射线以及正电子发射断层扫描等技术中的对比增强方式相似。对于生物系统，中子射线照相和计算机断层扫描 increasingly 被用于研究地下植物根系网络的复杂结构、根系与土壤的相互作用，以及原位水通量的动态变化。此外，研究人员也在积极探索动物样品（如软组织和骨骼）中对比度细节的理解。本文重点介绍利用高通量同位素反应堆CG-1D中子成像束线在中子生物成像方面的进展，包括样品制备、仪器设备、数据采集策略以及数据分析方法。上述能力将通过一系列实例加以说明，涵盖植物生理学&#160;（草本植物/根系/土壤系统）&#160;以及生物医学应用&#160;（大鼠股骨和小鼠肺组织）。

图 5A 是一张与所测样本尺寸相似的大鼠股骨的代表性照片； 图 5B，C 代表大鼠股骨带有钛植入物的 nCT 图像。 图 5B 显示基于伪彩色衰减的股骨nCT图像，而 图 5C 表示沿相同方向对骨组织进行的斜向切面 图5B 以显示呈灰度的钛植入物（Ti implant），其外观类似于X射线医学CT图像。该植入物对中子的相互作用弱于骨组织材料，因此其衰减程度最低，在图像中表现为较暗区域（即衰减较小），相较于周围骨组织更明显。在样本近端可见位于股骨髓腔内的骨小梁结构（图中红箭头所示） 图5B).
图6A、B展示了经乙醇固定的实验小鼠肺组织在两种不同位置下的代表性照片，用于中子计算机断层扫描（nCT），以展示中子探测软组织样本的能力。图6C、D展示了通过nCT重建的小鼠肺组织三维图像，其摆放位置与图6A、B相似。图6E展示了肺右叶的切面图。尽管样本尺寸相对较小，中子探测的灵敏度仍清晰可见，能够以约75 µm的空间分辨率检测到肺组织的结构。正如预期，衰减范围较宽，大部分区域对应较低至中等程度的中子衰减，这是因为肺组织具有类似海绵的结构并含有空气。
图7A展示了植物样品的照片，而图7B表示在矩形铝制容器中植物根系/土壤系统的伪彩色体渲染图像（该容器不可见，因为铝对中子几乎是透明的）。与之前的数据集相比，信噪比（SNR）较差，这是预期的结果，因为数据采集速度更快，以在2.5天内三维追踪根系吸水的动态变化。因此，每次CT扫描均优化为在约1.75小时的时间窗口内完成。尽管信噪比较差，但在图7C、D所示样品的垂直切面伪彩色图像中，土壤中的根系仍清晰可见。
<img alt="冷中子束线示意图：CG-1D导管、束线快门、用于中子散射研究的散射器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：HFIR CG-1D中子成像束线的示意图。 成像束由定义锥形束几何结构的光阑系统确定。束流通过充满He的飞行管传输，并利用束流削除器去除不需要的杂散中子。飞行管内部的含硼橡胶衬里可降低来自邻近束线的背景信号。缩写：HFIR = 高通量同位素反应堆；He = 氦气；L = 直径为D的针孔光阑与探测器之间的距离。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学激发和数据分析的光路管光谱装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：高通量同位素反应堆 CG-1D 中子成像设施。照片从前向右至左依次显示了光路管、样品区和束流挡板。中子束流来自照片右侧。该光路管上留有使用此仪器的科学界和工业研究界研究人员的签名。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CT扫描过程、软件界面、X射线成像装置、材料分析的数据采集。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：EPICS界面。 CG-1D的EPICS界面分为三个部分：状态区（左侧）、显示区（本示例中为黄铜航海日晷的原始放射图像）以及用于二维和三维成像的参数输入区。缩写：EPICS = Experimental Physics and Industrial Control System（实验物理与工业控制系统）；2D = 二维；3D = 三维。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="数据加载与可视化流程；代码片段与热图；数据分析工具。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：Jupyter 笔记本的截图。 该笔记本用于在归一化之前预览一组X射线图像。在此示例中，可视化了图 3中所示的同一款黄铜航海日晷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示应力分布的骨分析示意图；CT扫描对比；骨科研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：植入钛合金假体的大鼠股骨。（A）典型大鼠股骨的照片。（B）通过nCT获取的大鼠股骨三维重建图像。（C）显示股骨内钛合金杆的斜切面图像。红色箭头指示小梁骨。比例尺分别由x轴和y轴表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用示意图和影像进行肺部形态学比较；右肺与左肺组织学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：小鼠肺部中子计算机断层扫描（nCT）。（A）和（B）小鼠肺的代表性照片。（C）和（D）基于衰减的三维重建小鼠肺容积图像，成像位置与（A）和（B）相同。（E）穿过小鼠右肺叶的代表性切片图像（D），显示肺部结构，该结构由不同的中子衰减梯度（主要为低衰减）获得。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="植物根系吸收成像；吸收分析示意图，突出显示养分浓度区域。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61688/61688fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图7"> 
图7：中子计算机断层扫描及植物根系/土壤系统的切片图像。（A）植物样品照片。（B）植物中子计算机断层扫描重建的三维体积图像，显示地上茎部分以及土壤系统中的水分（红色所示）。（C）和（D）为穿过样品的斜切面，用于展示土壤中的茎和根（红色箭头所示）。土壤中较深的蓝色区域表示水分的存在。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61688/61688fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文描述了一种利用高通量同位素反应堆（HFIR）CG-1D束线对生物样品进行中子射线成像和计算机断层扫描的实验方案，用于测量大鼠股骨中的金属植入物、小鼠肺组织以及草本植物根系/土壤系统。

中子历史上已被用于多种生物学应用，所采用的技术包括小角中子散射、中子……

由于营养物质对氢原子具有敏感性，营养放射成像和计算机断层扫描技术在测量生物样品方面具有独特优势。这些技术的主要优点是能够提供组织样品中氢含量或植物根系与土壤中水分含量的无损、非侵入式三维图谱。营养成像可应用于多个不同的研究领域，如能源材料、材料科学、工程学、植物、土壤、水分运移等。由于辐射暴露的风险，该技术不能用于治疗或临床诊断。然而，它可以用于确定小的完整切除肿瘤的肿瘤边界等用途。我建议对该技术感兴趣的人士与我们联系，讨论他们的研究问题。我们的信息可在网站 neutrons.ornl.gov 上获取。演示该实验流程的人员包括：中子散射科学家 Yuxuan Zang、计算机仪器科学家 Jean Bilheux，以及来自我们成像团队的科研助理 Erik Stringfellow。首先，在束线计算机上打开一个终端窗口。输入 CSS 并按 Enter 键以启动用户界面。如果未默认打开，请在菜单选项卡中选择“用户主页”以打开 APEX 成像界面。在界面的第一个选项卡“ProposalCameraSE 设备”中，点击“相机/探测器”旁边的“光学元件”按钮，选择光束线光学元件。单击“狭缝”按钮以设置针孔光阑尺寸和狭缝系统的开度。将旋转台固定在用于放置样品的XY平移台上。如果使用CCD以外的探测器，请根据所需的空间分辨率和焦距选择合适的透镜。在调整相机焦距后，将图像焦点对准中子闪烁体所在位置。然后，将中子吸收型分辨率掩模紧贴探测器闪烁体，利用中子进一步微调镜头焦距。接下来，使用 APEX 自动控制探测器电机移动，并通过镜面不同位置的探测器采集大量射线照相图像。使用 Fiji 或 ImageJ 等图像软件工具，通过评估图像中的线对来比较X线片。然后，将样品固定在合适的铝制容器或加厚铝箔中，并将样品尽可能靠近探测器放置在旋转台上。测量样品到探测器的距离，随后取出样品。更换为分辨率掩模，以评估此光束线配置下样品位置的像素尺寸。利用已知的特征尺寸，评估特征所占的像素数量，从而确定像素尺寸。重新调整样品在旋转台上的位置。接下来，在 APEX 界面中使用“对齐样品”选项卡，通过在样品移动的同时连续采集快速的中子成像图，直至样品完全处于探测器视野中，从而将样品与中子束对齐。保存样品对齐文件。在开始 CT 扫描之前，单击“对齐样品”选项卡，并启用“自动样品旋转”检查选项，通过在不同样品取向下采集生成的成像图，验证样品在各个角度下均保持在视野范围内。选择名为 ProposalCameraSE 设备的第一个 APEX 选项卡。点击“切换项目或样品”按钮。在右侧的样品列表和左侧的项目列表中，选择待测的项目编号和样品编号。使用返回箭头回到主 APEX 界面。在相机探测器选项列表中，从四个可用探测器中选择一个探测器，以及 CCD、sCMOS、SBIG CCD 或 MCP。在样品环境设备部分，单击旋转台、CT 扫描。然后，选择与待扫描样品相对应的旋转台。在选项卡底部，选择数据采集模式，并选择白光束。接着，选择名为“Align Sample”的第二个 APEX 选项卡。输入一个示例文件名，然后按 Enter 键。接着输入子文件夹名称并按 Enter 键。假设该样品已对齐并准备就绪，可进行 CT 扫描。选择所需的采集时间，然后单击“采集快速图像”按钮，以采集一系列不同采集时间的放射图像。为了评估信噪比，使用 ImageJ 或 Fiji 打开采集的放射图像，并绘制一条从样品到空白区域的轮廓线。如果在 XY 载物台上多个旋转装置上设置了多个样品，在完成对准后记录每个样品的位置，然后单击“保存到文件”按钮，将数据保存为 CSV 文件。接下来，选择标题为“采集数据”的第三个 APEX 选项卡，以设置 CT 扫描参数。在第一个可编辑行输入文件名，然后按 Enter 键。对子文件夹名称重复此操作。在“使用已保存文件对齐样品”部分，选择先前记录样品电机位置的文件。单击“使用文件对齐”以使样品重新回到中子束中的位置。根据奈奎斯特采样定理计算投影数量时，首先计算样品水平方向上的像素数，再乘以1.5，以获得满足奈奎斯特采样所需的投影数量。输入旋转起始角度、旋转终止角度、旋转步长、每步采集的图像数量以及每幅图像的曝光时间。单击“采集数据”按钮以开始 CT 扫描。在 Linux 分析服务器上，通过单击顶部菜单快捷方式“应用程序”，然后选择“分析-成像”和“CT 重建”来访问 Imaris 3D 笔记本。运行代码的前几行，这将加载运行 Imaris 3D 所需的工具。加载平场和暗场数据。确认所有三个数据集均已正确加载。通过在图像中选择感兴趣区域来裁剪数据。根据需要运行过滤部分的代码进行过滤。随后进行归一化处理，接着进行光束波动校正。从图像中选择背景区域，然后将其传输至衰减处理。然后，通过使用代码计算倾斜角度并应用倾斜校正，实现样品倾斜的自动校正。接着，进行条纹去除和旋转中心计算。随后，进行三维重构并查看数据。将数据保存在名为 Shared 的项目编号文件夹中。然后，在 Facility Analysis 服务器上启动 Amira 软件，将重建的切片加载到软件中，并进行可视化、进一步滤波和分析。本实验方案采用定制设计的界面，以指导操作流程并最大限度减少人为误差。该界面会按逻辑顺序依次执行测量样本前的必要步骤。此处展示的是带有钛植入物的大鼠股骨的中子计算机断层扫描（NCT）图像。已获得基于伪彩色衰减的股骨NCT图像，以及沿对角线切割骨骼以显示植入物的图像。植入物与中子的相互作用远小于骨组织材料，因此其衰减程度极小，表现为比周围骨组织更暗。股骨髓腔内的小梁骨在样本近端清晰可见。中子对软组织样本的检测能力已在乙醇固定的 小鼠肺组织上得到验证。肺部的重建体积来自NCT。此处展示了肺右叶的切面。同时，还获得了矩形铝制容器中植物根系与土壤系统的伪彩色体渲染图像。尽管信噪比较低，根系在土壤中的结构在样品的垂直切面中仍清晰可见。评估像素尺寸至关重要，以便将记录的图像与实际物理尺寸相对应。三维体重建的质量依赖于遵循奈奎斯特采样定理的良好采样。更先进的中子成像技术，例如中子相位衬度干涉成像，可按照类似的流程进行。这些新兴方法能够解答诸如多孔材料中三维纳米孔隙分布等科学问题。中子照相与计算机断层扫描具有广泛的科学影响。这些技术可应用于电池及其失效机制的研究，以及先进材料（如3D打印材料）的行为分析、考古学、生物学和肿瘤的精确定位。

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