与抗原标记阻断病变的复制体遭遇的可视化

该技术有助于可视化复制体抗原标记的DNA加合物遭遇，并且可以扩展到任何蛋白质与适合免疫检测的DNA结构或病变的相互作用。该方法可用于评估单个细胞内的相互作用频率，而不是整个群体，并且允许原位可视化细胞周期依赖性相互作用而不会损坏细胞。演示该程序的是Seidman实验室的博士后Ishani Majumdar。

在实验前一天，将1.5乘以10至2毫升培养基中的第五个细胞接种到用细胞粘合剂溶液预处理的35毫米玻璃底培养皿上。第二天，用37摄氏度5微摩尔Dig TMP补充培养基将每个培养皿中的上清液更换到50至70%汇合的细胞培养物中，并将板放回细胞培养箱30分钟，以使Dig TMP平衡。当细胞孵育时，将紫外线盒预热至37摄氏度。

在平衡结束时，将板转移到预热的盒子中，将细胞暴露于五分钟每平方厘米三焦耳的UVA光剂量下，并用两毫升新鲜的预热培养基替换上清液，然后将板返回到细胞培养箱一小时。在孵育结束时，用PBS轻轻洗涤培养物，并在室温下用一毫升0.1%甲醛在PBS中固定细胞5分钟。在孵育结束时，用PBS洗涤细胞一次，然后用80微升细胞骨架提取缓冲液处理细胞两次，每次处理在室温下补充有RNase5分钟以除去细胞质。

第二次孵育后，用两毫升PBS洗涤细胞三次，然后在室温下用一毫升4%甲醛在PBS中固定细胞10分钟。第二次固定后，如图所示用PBS洗涤细胞三次，然后用一毫升冷的100%甲醇在零下20摄氏度下处理20分钟。在孵育结束时，在两毫升PBS中洗涤细胞三次，然后在80微升的5毫摩尔Triton X-100中以4摄氏度孵育10分钟。

在孵育结束时，用PBS中的100微升5毫摩尔EDTA处理细胞，并补充有1微升100毫克/毫升RNase A，在37摄氏度下30分钟。在孵育结束时，在PBS中洗涤细胞三次，然后将它们储存在5%牛血清白蛋白和10%驴血清中的PBS中，在潮湿的室内过夜，温度为4摄氏度。为了进行邻近连接测定，将40微升感兴趣的一抗溶液添加到每个板的中心，并将板在潮湿的室中在37摄氏度下孵育一小时。

在孵育结束时，用两毫升PBST洗涤细胞三次，然后将40微升新鲜制备的PLA探针溶液加入每个培养皿中，在细胞培养箱中孵育一小时。在孵育结束时，在室温下倾斜平台上的两毫升缓冲液A中用三次10分钟的洗涤洗涤细胞。最后一次洗涤后，向每个板中加入40微升新鲜制备的连接混合物，在37摄氏度下孵育30分钟，然后在倾斜平台上的缓冲液A中洗涤三次两分钟。

最后一次洗涤后，向每个板中加入40微升新鲜制备的扩增溶液，在潮湿的室中以37摄氏度的温度孵育100分钟。在孵育结束时，在倾斜平台上用新鲜缓冲液B洗涤细胞六次，每次洗涤10分钟。最后一次缓冲液B洗涤后，在室温下用0.01x缓冲液B洗涤细胞一次1分钟，然后在潮湿的室中用适当的二抗在37摄氏度下标记30分钟。

在孵育结束时，在室温下在PBST的倾斜平台上洗涤样品三次10分钟，然后将其安装在补充有DAPI的封片剂中。在安装后的四天内，对每个样品或条件细胞进行至少100个观察结果的成像，在落射荧光或共聚焦显微镜上，对实验和对照样品使用相同的曝光设置。Dig标签可以通过免疫荧光可视化，以揭示整个细胞核中链间交联的存在。

为了可视化爬酶体与链间交联的相互作用，可以在链间交联引入一小时后应用PLA来可视化MCM5和Dig标签的关联频率。由于复制应激激活ATR激酶，pMCM两个丝氨酸108和Dig标签之间的PLA也是阳性的。来自单个细胞核的PLA结果可以以三维重建的形式呈现，允许可视化整个细胞核中的重复体链间交联相遇。

复制叉分析表明，由于GINS复合物的蛋白质无法表现出与链间交联的PLA信号，因此链间交联相遇表现出意外的复制重启现象。相反，CD 45的测定是阳性的，表明另一种锁定蛋白被保留。当细胞与ATR抑制剂孵育时，重新启动被完全抑制，并且GINS Dig PLA强烈阳性。

CSK+R处理对于减少背景信号至关重要。确保在平板上涂上细胞粘合剂，并以0.1%FA为前缀，否则细胞会从板上剥落。