Name: 腺病毒生产的有效方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 了解利用pAdEasy系统生产腺病毒颗粒的优化方法，包括重组、包装、扩增、纯化和功能测试等关键步骤。该技术可高效实现基因递送，适用于多种细胞类型的基因治疗研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由欧洲区域发展基金通过2014-2020年竞争力运行计划（POC-A.1-A.1.1.4-E-2015，项目编号：P_37_668；项目简称：DIABETER）、罗马尼亚研究与创新部PCCDI-UEFISCDI资助项目（项目编号：PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697，属于PNCD III计划）以及罗马尼亚科学院共同资助。作者感谢希腊帕特雷大学的Kyriakos Kypreos提供的宝贵且富有建设性的建议，感谢罗马尼亚布加勒斯特美术大学的Ovidiu Croitoru在拍摄、视频剪辑和图形设计方面的贡献，以及Mihaela Bratu提供的技术支持。

<ol><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes and Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).</li>
<li>He, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> The Journal of General Virology. 81, Pt 11 2573-2604 (2000).</li>
<li>Rauschhuber, C., Noske, N., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+stability+of+recombinant+adenovirus+vector+genomes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New insights into stability of recombinant adenovirus vector genomes in mammalian cells.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>Saha, B., Wong, C. M., Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenovirus+genome+contributes+to+the+structural+stability+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The adenovirus genome contributes to the structural stability of the virion.</a> Viruses. 6 (9), 3563-3583 (2014).</li>
<li>Kreppel, F., Kochanek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+adenovirus+gene+transfer+vectors+with+synthetic+polymers%3A+a+scientific+review+and+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+the+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modification of adenovirus gene transfer vectors with synthetic polymers: a scientific review and technical guide.</a> Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Dormond, E., Perrier, M., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+first+to+the+third+generation+adenoviral+vector%3A+what+parameters+are+governing+the+production+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Advances%22%5BJournal%5D)">From the first to the third generation adenoviral vector: what parameters are governing the production yield.</a> Biotechnol Advances. 27 (2), 133-144 (2009).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Jager, L., Ehrhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+adenoviral+vectors+for+stable+correction+of+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Emerging adenoviral vectors for stable correction of genetic disorders.</a> Current Gene Therapy. 7 (4), 272-283 (2007).</li>
<li>Luo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+generation+of+recombinant+adenoviruses+using+the+AdEasy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1236-1247 (2007).</li>
<li>Dumitrescu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+FasL+Minigene+Transfer+Endows+Transduced+Cells+with+Killer+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated FasL Minigene Transfer Endows Transduced Cells with Killer Potential.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).</li>
<li>Campos, S. K., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+and+future+challenges+in+Adenoviral+vector+biology+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 7 (3), 189-204 (2007).</li>
<li>Khare, R., Chen, C. Y., Weaver, E. A., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+future+challenges+in+adenoviral+vector+pharmacology+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting.</a> Current Gene Therapy. 11 (4), 241-258 (2011).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nature Protocols. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Zvintzou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+effects+of+apolipoprotein+C3+on+HDL+functionality+and+adipose+tissue+metabolic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic effects of apolipoprotein C3 on HDL functionality and adipose tissue metabolic activity.</a> Journal of Lipid Research. 58 (9), 1869-1883 (2017).</li>
<li>Karavia, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+modulates+processes+associated+with+diet-induced+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I modulates processes associated with diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice.</a> Molecular Medicine. 18, 901-912 (2012).</li>
<li>Lampropoulou, A., Zannis, V. I., Kypreos, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacodynamic+and+pharmacokinetic+analysis+of+apoE4+%5BL261A%2C+W264A%2C+F265A%2C+L268A%2C+V269A%5D%2C+a+recombinant+apolipoprotein+E+variant+with+improved+biological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A], a recombinant apolipoprotein E variant with improved biological properties.</a> Biochemical Pharmacology. 84 (11), 1451-1458 (2012).</li>
<li>Zheng, S. Y., Li, D. C., Zhang, Z. D., Zhao, J., Ge, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+FasL+gene+transfer+into+human+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated FasL gene transfer into human gastric carcinoma.</a> World Journal of Gastroenterology. 11 (22), 3446-3450 (2005).</li>
<li>Ambar, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+experimental+glioma+by+administration+of+adenoviral+vectors+expressing+Fas+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Treatment of experimental glioma by administration of adenoviral vectors expressing Fas ligand.</a> Human Gene Therapy. 10 (10), 1641-1648 (1999).</li>
<li>Okuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Fas-ligand+gene+expression+in+rodent+liver+after+intravenous+injection+of+a+recombinant+adenovirus+by+the+use+of+a+Cre-mediated+switching+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Fas-ligand gene expression in rodent liver after intravenous injection of a recombinant adenovirus by the use of a Cre-mediated switching system.</a> Gene Therapy. 5 (8), 1047-1053 (1998).</li>
<li>van Dijk, K. W., Kypreos, K. E., Fallaux, F. J., Hageman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 693, 321-343 (2011).</li>
<li>Zhao, Y. D., Li, T., Huang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+negative+selection+method+to+identify+adenovirus+recombinants+using+colony+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%2C+North+America%22%5BJournal%5D)">A simple negative selection method to identify adenovirus recombinants using colony PCR.</a> Electronic Journal of Biotechnology, North America. 17 (1), 46-49 (2014).</li>
<li>Kovesdi, I., Hedley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Adenoviral producer cells.</a> Viruses. 2 (8), 1681-1703 (2010).</li>
<li>Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+new+retroviral+producer+cells+from+adenoviral+and+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 5 (9), 1251-1258 (1998).</li>
<li>Fallaux, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+911%3A+a+new+helper+cell+line+for+the+titration+and+propagation+of+early+region+1-deleted+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors.</a> Human Gene Therapy. 7 (2), 215-222 (1996).</li>
<li>Altaras, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+formulation+of+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2F+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and formulation of adenovirus vectors.</a> Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 99, 193-260 (2005).</li>
<li>Schagen, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonium+sulphate+precipitation+of+recombinant+adenovirus+from+culture+medium%3A+an+easy+method+to+increase+the+total+virus+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Ammonium sulphate precipitation of recombinant adenovirus from culture medium: an easy method to increase the total virus yield.</a> Gene Therapy. 7 (18), 1570-1574 (2000).</li>
<li>Colombet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virioplankton+%27pegylation%27%3A+use+of+PEG+%28polyethylene+glycol%29+to+concentrate+and+purify+viruses+in+pelagic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Virioplankton 'pegylation': use of PEG (polyethylene glycol) to concentrate and purify viruses in pelagic ecosystems.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 212-219 (2007).</li>
<li>Kypreos, K. E., van Dijk, K. W., van Der Zee, A., Havekes, L. M., Zannis, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+apolipoprotein+E+contributing+to+triglyceride+and+cholesterol+homeostasis+in+vivo.+Carboxyl-terminal+region+203-299+promotes+hepatic+very+low+density+lipoprotein-triglyceride+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Domains of apolipoprotein E contributing to triglyceride and cholesterol homeostasis in vivo. Carboxyl-terminal region 203-299 promotes hepatic very low density lipoprotein-triglyceride secretion.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19778-19786 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

重组腺病毒是基因递送和表达的多功能工具12,13,14。为了通过腺病毒转导实现高效蛋白表达，需将目的基因的编码序列插入腺病毒基因组中。由Bert Vogelstein实验室开发的AdEasy腺病毒系统包含一个骨架质粒（pAdEasy-1），该质粒含有大部分野生型5型腺病毒基因组，以及一个用于基因克隆的穿梭载体（pAdTrack）2,10。通过删除腺病毒E1基因（负责感染性病毒颗粒的组装）和E3基因（编码参与逃避免疫宿主反应的蛋白），在腺病毒基因组中腾出空间，可插入大小为6.5–7.5 kb的目的基因2,3。该容量足以容纳许多基因，尤其适用于内含子较短的基因15,16,17。也有研究人员报道了携带转基因cDNA的腺病毒的制备18,19,20。然而，与携带完整基因或迷你基因的腺病毒相比，携带cDNA的腺病毒在转基因表达水平上产量较低（数据未显示）。
在改进和优化先前方法2,10,14,18,21的基础上，腺病毒制备技术所需时间更短、成本更低、操作更简便。全长腺病毒DNA通过穿梭载体与pAdEasy-1质粒在易于发生同源重组的E. coli菌株BJ5183中重组获得。该方案涉及对AdEasier-1细胞（含有pAdEasy-1质粒的BJ5183细菌）进行化学转化。该技术无需使用某些实验室可能不具备的电穿孔仪，操作极为简便，可提高重组效率，并缩短制备感受态细胞及完成转化所需的时间。通过PCR预先筛选重组克隆，进一步缩短了操作周期，简化了整体流程。Zhao及其同事曾采用过类似方法22，但在本方案中，我们对引物序列进行了优化。
在GFP-腺病毒的包装与扩增过程中，使用了一种HEK293衍生的细胞系，即AD293细胞，该细胞对培养皿的贴附性更强。其他常用于腺病毒生产的细胞系包括：911、293FT、pTG6559（A549衍生细胞系）、PER.C6（HER衍生细胞系）、GH329（HeLa衍生细胞系）、N52.E6以及HeLa-E123,24,25,26。据我们实验结果显示，使用911细胞并未提高腺病毒的产量（数据未显示）。采用K2试剂将重组质粒转染至AD293细胞，可显著提高病毒包装步骤的效率。腺病毒生产完成后，约有高达70%的腺病毒仍保留在细胞内，需通过三次冻融循环释放。增加冻融次数并不合适，因为这会破坏腺病毒的结构与活性。
在常规的腺病毒生产过程中，大量病毒颗粒会释放到细胞培养基中。在收获感染的AD293细胞时若丢弃该细胞培养基，将导致重要的病毒损失。我们优化了Schagen及其同事描述的方案，通过硫酸铵沉淀法从细胞培养基中纯化腺病毒颗粒27。与使用聚乙二醇的方法相比，该方法从细胞培养基中回收腺病毒的效率更高28。沉淀所得的腺病毒应立即通过超速离心进行纯化，或在透析去除过量盐分后于冰箱中保存数天。若未进行透析，沉淀物在数小时以上长时间存放会对病毒造成损害。
通过一步法超速离心纯化腺病毒颗粒，与采用多次超速离心步骤的方案相比，可减少对腺病毒原液的操作，使操作流程更为简便14,29。纯化后的腺病毒需进行透析，以去除可能影响转导效率的氯化铯。在本方案中，我们使用含MgCl2的Tris缓冲液进行透析，而非蔗糖，因为后者作为冷冻保护剂需使用大量且不合理的蔗糖用量。因此，我们在制备用于冷冻保存的腺病毒原液时，再直接加入蔗糖。为避免纯化后的腺病毒反复冻融，建议将腺病毒原液分装后于-80 °C保存。腺病毒滴度通过流式细胞术检测GFP报告基因及特定病毒稀释度下转导细胞的百分比来评估。该方法比经典的“空斑实验”更快，且相较于基于衣壳蛋白检测（如ELISA或流式细胞术等方法）的滴度测定更为可靠，因为后者无法反映腺病毒颗粒的感染能力。然而，基于ELISA的定量、Q-PCR或使用商业化试剂盒的空斑实验也是可选方法，尤其适用于不含荧光示踪标记的腺病毒滴定。
考虑到pAdTrack腺病毒来源于人腺病毒5型，而该型腺病毒可被柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）识别，我们证明了GFP-腺病毒不仅能够转导人源细胞（内皮细胞），还能转导其他物种来源的细胞，包括牛源（内皮细胞）和小鼠源细胞（间充质基质细胞和肝细胞）。实验结果表明，GFP-腺病毒可诱导外源基因高水平表达。
综上所述，我们优化了这一费力的技术，以减少获得腺病毒颗粒所需的时间、成本和工作量。所制备的腺病毒能够感染多种细胞类型，并诱导目的基因的表达。由于腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一，该方案可用于多种实验。
缩写： AdV-GFP，腺病毒颗粒；BAEC，牛主动脉内皮细胞；CsCl，氯化铯；GFP，绿色荧光蛋白；MSC，间充质基质细胞；TU，转导单位。

腺病毒是一类无包膜病毒，含有核衣壳和线性双链DNA基因组1,2,3。腺病毒可感染多种类型的细胞，且其感染不依赖于宿主细胞的活跃分裂。感染后，腺病毒将其基因组DNA导入宿主细胞核内，病毒DNA以附加体形式存在，并与宿主基因一同转录。因此，其插入突变或调控原癌基因的潜在风险极低4,5,6。腺病毒基因组不会随宿主基因组一同复制，因此在分裂的细胞群体中，腺病毒基因会被逐渐稀释。腺病毒转导的优势包括：(i) 外源基因高水平表达；(ii) 由于为附加体表达，病毒DNA整合入宿主基因组的相关风险降低；(iii) 可转导多种分裂和非分裂细胞类型。目前生物医学研究中使用的大多数腺病毒均为非复制型，缺失E1区7,8,9。其生产需要提供E1序列的细胞系（如HEK293）。此外，病毒生命周期中的非必需区E3已被删除，以允许将外源基因插入病毒基因组；某些腺病毒还进一步删除了其他区域（E2和E4），但在这些情况下，报道显示腺病毒产量降低且外源基因表达水平较低7。
本文介绍了一种利用 AdEasy 系统构建、包装和纯化腺病毒的改进方案。相较于 Bert Vogelstein 最初建立的方法2,10，本改进方案具有以下优势，使腺病毒的包装更加快速且经济：（i）通过化学转化法将含有 pAdEasy-1 的 BJ5183 细菌进行同源重组；（ii）利用 PCR 筛选重组克隆；（iii）采用 K2 转染系统转染 AD293 细胞以实现腺病毒包装；（iv）在病毒包装与扩增后，从培养基中沉淀腺病毒颗粒；（v）通过一步式氯化铯（CsCl）梯度超速离心法纯化腺病毒。
使用AdEasy系统（图1）进行腺病毒制备的方案包含以下步骤：
(1) pAdTrack-GFP 与 pAdEasy-1 在 BJ5183 细菌中的重组 
(2) 腺病毒颗粒的包装 
(3) 腺病毒的扩增 
(4) 从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒 
(5) 腺病毒滴度测定。
<img alt="基因编辑过程示意图；pAdTrack-GFP 质粒的同源重组、包装、扩增与纯化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：腺病毒制备技术。腺病毒技术的主要步骤包括：（1）pAdTrack-GFP 质粒与 pAdEasy-1 质粒在 BJ5183 细菌中发生同源重组，筛选出的重组质粒在 DH5α 细菌中扩增，随后进行纯化；（2）在可表达腺病毒 E1 蛋白的 AD293 细胞中包装腺病毒颗粒；（3）在 AD293 细胞中扩增腺病毒；（4）通过 CsCl 密度梯度超速离心法，从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒；（5）腺病毒的滴度测定与功能检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
在本实验方案中，我们展示了用于制备腺病毒的技术，该病毒可诱导宿主细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达。GFP 已插入 pAdTrack-CMV 转移载体（Addgene #16405）的骨架中，位于第二个 CMV 启动子下游，作为报告基因使用（图1）。因此，本文中我们将 pAdTrack-CMV 载体命名为 pAdTrack-GFP，并以 GFP 的表达情况进行示例性评估。除 GFP 表达外，该系统还可用于过表达目的基因，目的基因可克隆至 pAdTrack-CMV 载体的多克隆位点中。与 cDNA 相比，克隆至 pAdTrack-CMV 载体中的基因或微型基因通常在诱导表达方面效率更高11。实验数据显示，在多种来源（人、牛、小鼠）的转导细胞（如肝细胞、内皮细胞）中均观察到强烈的 GFP 表达。腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一。

<table><tbody><tr><td>AD293 细胞</td><td>Agilent Technologies</td><td>240085</td><td></td></tr><tr><td>AdEasier-1 细胞</td><td>Addgene</td><td>16399</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 I（用于电泳）</td><td>Thermo Scientific</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>BamH I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板 100 mm</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Sigma</td><td>L4036</td><td></td></tr><tr><td>DH5alpha 细菌</td><td>Thermo Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（含 GlutaMAX，4.5 g/L D-葡萄糖）</td><td>Gibco</td><td>3240-027</td><td></td></tr><tr><td>EA.hy926 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（99.8%）</td><td>Roth</td><td>5054.2</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>培养瓶 T25、T75、T175</td><td>Eppendorf</td><td>30712129</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepa 1-6 小鼠肝细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1830</td><td></td></tr><tr><td>Hind III</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160054</td><td></td></tr><tr><td>K2 转染系统</td><td>Biontex</td><td>T060-5.0</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Formedium</td><td>LBx0102</td><td></td></tr><tr><td>LB-琼脂</td><td>Formedium</td><td>LBx0202</td><td></td></tr><tr><td>Mix &amp;amp; Go &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 转化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Midori Green Advanced DNA 染色剂</td><td>Nippon Genetics Europe</td><td>MG-04</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pac I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD2204</td><td></td></tr><tr><td>pAdEasy-1</td><td>Addgene</td><td>16400</td><td></td></tr><tr><td>pAdTrack-CMV</td><td>Addgene</td><td>16405</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇（24:24:1）</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M3005</td><td></td></tr><tr><td>Pme I (Mss I)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD1344</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>VWR Chemicals</td><td>43065P</td><td></td></tr><tr><td>Pst I</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0614</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen 大量质粒提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>TPP</td><td>99003</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>28365</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析夹</td><td>Thermo Scientific</td><td>66330</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>SIGMA</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>带 23G 针头的注射器</td><td>B Braun</td><td>464BR</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>超透明离心管（14×89 mm）</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>离心机（带制冷功能）</td><td>Sigma Sartorius</td><td>3-19KS</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 17 微型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>配备 SW41Ti 转子的超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-80 XP</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Thermo Scientific</td><td>II 级</td><td></td></tr><tr><td>移液器（0–2&amp;micro;l、1–10&amp;micro;l、2–20&amp;micro;l、10–100&amp;micro;l、20–200&amp;micro;l、100–1000&amp;micro;l）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干式恒温金属浴</td><td>Biosan</td><td>TDB-120</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>SensoQuest</td><td>012-103</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效的腺病毒制备方法

An Efficient Method for Adenovirus Production

腺病毒转导具有在多种细胞类型和器官中实现目的基因强效且瞬时表达的优势。然而，重组腺病毒技术操作繁琐、耗时且成本较高。本文介绍了一种利用pAdEasy系统改进的实验方案，可获得纯化的腺病毒颗粒，从而在转导细胞中诱导强烈的绿色荧光蛋白（GFP）表达。与Bert Vogelstein最初开发的方法相比，该改进方法具有制备更快、生产成本更低的优点。腺病毒技术的主要步骤包括：（1）在BJ5183细菌中将pAdTrack-GFP与pAdEasy-1质粒进行重组；（2）腺病毒颗粒的包装；（3）在AD293细胞中扩增腺病毒；（4）从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒颗粒；（5）对腺病毒进行病毒滴度测定和功能检测。本方法的改进之处包括：（i）通过化学转化法在含有pAdEasy-1的BJ5183细菌中进行重组；（ii）通过“阴性”和“阳性”PCR筛选重组克隆；（iii）使用K2转染系统将AD293细胞转染以实现腺病毒包装；（iv）利用硫酸铵沉淀法沉淀AD293细胞释放到培养基中的病毒颗粒；（v）通过一步式氯化铯不连续密度梯度超速离心法纯化病毒。在多种来源（人、牛、小鼠）的不同类型转导细胞（如肝细胞、内皮细胞）中均获得了目的基因（本实验中为GFP）的高效表达。腺病毒介导的基因转移是开发现代基因治疗的主要工具之一。

我们对原始的Vogelstein方案进行了修改和优化，以实现更快速、更高效的腺病毒制备。首先，我们改进了方法以更简便地筛选重组子。在发生重组后，通过“阴性PCR”检测BJ5183细菌克隆，以评估pAdTrack-GFP的完整性，作为判断是否未发生重组的指标（图 3A），或通过“阳性PCR”鉴定目标基因（在本研究中将其等同于GFP）图3B）。在“阴性”和“阳性”PCR中，我们均使用pAdTrack-GFP作为对照模板，以检测pAdTrack的完整性，扩增出986 bp的条带图3A，第1泳道），以及GFP的264 bp条带（图3B，第3泳道）。用于“阴性PCR”的引物设计用于扩增pAdTrack-GFP中包含PmeI位点的986 bp片段。该DNA片段在发生重组后显著增大，因此在阳性重组克隆中无法被扩增。重组阴性克隆即pAdTrack-GFP保持完整的克隆，如图所示 图 3A，第3、4和6泳道。引物与重组位点相邻的DNA序列退火。潜在的阳性重组克隆（图3A，第2和第5泳道）表达GFP，如图所示 图3B，泳道1和2。提取这些克隆的质粒DNA，用于转化DH5α以获得更大量的DNA。在DH5α中扩增的这些预筛选重组质粒随后通过酶切鉴定。在 图3C-E 一个重组阳性克隆经 Hind III、PstI 和 BamHI 限制性内切酶消化后的酶切结果如图所示图3C，D，E 第2泳道）。重组克隆的HindIII和PstI酶切图谱与pAdEasy-1相似，因为HindIII和PstI分别在pAdEasy-1质粒上切割24次和25次，图3C 和 D，第3泳道）；HindIII 对 pAdTrack-GFP 载体进行一次切割，PstI 进行四次切割（图3C 和 D，第1泳道）。BamHI 对 pAdEasy-1 载体进行双酶切（图3C，第3泳道）以及一次pAdTrack-GFP（图3C，第1泳道）。
PacI 从重组质粒中切割出一个 4.5 kb 的片段图3F，第2泳道），来自pAdTrack-GFP的2863 bp片段（图 3F，第1道），并线性化pAdEasy-1载体（图3F，第3泳道）。DNA标记物用以下表示 图3C-F在第4泳道中。将重组质粒用Pac I酶切，以备后续用于AD293转染。
<img alt="显示质粒分析的PCR筛选和酶切示意图；标注了条带大小的电泳凝胶图；使用了HindIII、PstI、BamHI、PacI酶。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：pAdTrack-GFP与pAdEasy-1质粒的重组。 pAdTrack-GFP与pAdEasy-1重组后获得的质粒通过“阴性”PCR检测pAdTrack-GFP的完整性（A）。非重组克隆因存在一条986 bp的条带而被确认，该条带对应于从pAdTrack-GFP质粒扩增出的序列（A，泳道3、4和6）。同时也获得了可能为重组阳性的克隆（A，泳道2和5）。当以pAdTrack-GFP载体作为模板时，得到一条986 bp的条带（A，泳道1）。对可能为阳性的重组克隆进一步通过“阳性”PCR检测GFP表达（B）；在两个可能重组的克隆（B，泳道1和2）以及pAdTrack-GFP质粒中均出现一条264 bp的条带。对一个可能重组克隆的DNA使用HindIII、PstI、BamHI和PacI限制性内切酶进行酶切分析（C–F，泳道2）。在对照组中，pAdEasy-1载体（C–F，泳道3）和pAdTrack-GFP质粒（C–F，泳道1）也用相同的酶进行消化处理。DNA标记物显示于C–F泳道4。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
腺病毒的包装与扩增在AD293细胞中进行。腺病毒颗粒（AdV-GFP）从AD293细胞裂解液以及被感染细胞释放到的细胞培养基中进行纯化。为了浓缩细胞培养基中的腺病毒，采用硫酸铵沉淀病毒颗粒，随后将其重悬于含2 mM MgCl2的10 mM Tris HCl（pH 8）缓冲液中，该缓冲液与细胞裂解所用缓冲液相同。随后，来自细胞裂解液和培养基的腺病毒颗粒通过CsCl不连续梯度超速离心法进行纯化。超速离心后获得了明显的高纯度AdV-GFP条带，如图4所示。
<img alt="细胞裂解液和培养基离心梯度，腺病毒条带分离，密度梯度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过在不连续 CsCl 梯度上进行超速离心纯化腺病毒。将细胞匀浆液以及从培养基中沉淀的腺病毒置于由低密度和高密度 CsCl 溶液构成的不连续梯度中进行超速离心。在两种情况下均观察到清晰的 GFP-腺病毒条带。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了测定以每毫升转导单位（TU/mL）表示的病毒滴度，使用腺病毒-GFP（AdV-GFP）的不同梯度稀释液感染AD293细胞。感染48小时后，细胞表达GFP，其表达水平与病毒悬液的稀释倍数呈负相关。通过荧光显微镜观察该现象，并通过流式细胞术确定GFP阳性细胞的百分比（图5）。在计算滴度时，选择诱导5–20% GFP阳性细胞的病毒稀释度进行分析（图5C）。通常，GFP腺病毒的病毒滴度可达约~1010（TU/mL）。
以下，我们以特定批次的腺病毒为例，说明其病毒滴度的计算方法：将 1 mL 腺病毒溶液（V）以 106 倍稀释（D）后，转导 300000 个细胞（C），获得 6% 的 GFP 阳性细胞（F）：
滴度（TU/mL）= D × F/100 × C/V = 106 × 6/100 × 300000/1 = 1.8 × 1010 TU/mL
<img alt="转导细胞中GFP表达分析的稀释系列显微镜图像和流式细胞术图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：腺病毒滴度的评估。AD293细胞用不同稀释度的腺病毒感染。48小时后，通过荧光显微镜观察细胞，并通过流式细胞术分析以确定不同腺病毒稀释度所诱导的GFP阳性细胞百分比（A-D）。为建立流式细胞术的设门标准，同时分析了未转导的细胞（E）。当6%的细胞为GFP阳性时，对应稀释倍数106的滴度计算结果为1.8 × 1010 TU/mL。图A-E中，标尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了检测制备的腺病毒的转导潜能，使用了四种细胞系：人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、小鼠肝细胞（Hepa 1-6）以及小鼠间充质基质细胞（MSC）。内皮细胞（EA.hy926 和 BAEC）以每细胞 25 TU 的剂量进行转导，肝细胞以每细胞 5 TU 的剂量转导，MSC 则以每细胞 250 TU 的剂量转导。
以下是计算使用滴度为 1.8 × 1010 TU/mL 的腺病毒悬液，以每细胞 25 TU 的感染复数感染 3 × 106 个细胞所需病毒悬液体积的示例。
对于 1 个细胞 .............. 25 TU 
3 x 106 个细胞 .............. x TU <img alt="静态平衡示意图，ΣFx=0；杠杆与支点装置；力与力矩的分解。" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> x=75 x 106 TU 
如果病毒原液含有 
1.8 x 1010 TU .............. 1 mL 
75 x 106 TU .............. y mL <img alt="静态平衡示意图，ΣFx=0；杠杆与支点装置；力与力矩的分解。" src="/files/ftp_upload/61691/61691equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1"> y= 4.2 x 10-3 mL = 4.2µL 病毒原液
转导48小时后，通过荧光显微镜分析细胞。如图所示 图6，人或牛的内皮细胞以每细胞25 TU的感染复数进行转导，效率良好（约50%）图6 EA.hy926 和 BAEC）。小鼠肝细胞（Hepa 1-6）在低剂量腺病毒颗粒（5 TU/细胞）条件下即可被高效转导，但这类细胞对腺病毒也较为敏感，与其他细胞类型相比，其死亡细胞比例（PI阳性细胞）较高（约16%）。间充质基质细胞最难被转导（图6），由于缺乏特异性的腺病毒受体（未发表数据）。
<img alt="流式细胞术图谱和荧光图像显示腺病毒-GFP在不同细胞类型中的转导效率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61691/61691fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：腺病毒的感染能力及其在转导细胞中诱导GFP表达的效果。采用指定剂量的腺病毒对人内皮细胞（EA.hy926）、牛主动脉内皮细胞（BAEC）、小鼠肝细胞（Hepa 1-6）以及小鼠间充质基质细胞（MSC）进行转导。通过荧光显微镜检测GFP表达，并利用流式细胞术分析GFP阳性细胞的百分比。通过流式细胞术测定的PI阳性细胞反映了病毒转导导致的细胞死亡率。EA.hy926细胞、牛主动脉内皮细胞和Hepa 1-6细胞对腺病毒的转导效率较高，转导率范围为41–52%。而对于MSC，即使使用较高剂量的病毒（250 TU/细胞），仅有27%的转导细胞呈GFP阳性。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61691/61691fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用pAdEasy系统制备腺病毒的实验方案。该技术包括pAdTrack与pAdEasy-1质粒的重组、腺病毒的包装与扩增、从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒颗粒、病毒滴度测定以及腺病毒的功能验证。

腺病毒转导具有在多种细胞类型中高效且瞬时诱导目的基因表达的优势……

欢迎来到位于罗马尼亚布加勒斯特的尼古拉·西米奥内斯库细胞生物学与病理学研究所。在本病毒转导实验室中，我们将展示利用基于Vogelstein教授开发的AdEasy系统优化后的方法进行腺病毒颗粒生产的一部分流程。该腺病毒生产技术的主要步骤包括：第一步，在BJ5183细菌中将含有GFP的pAdTrack质粒与pAdEasy-1质粒进行重组。第二步，腺病毒颗粒的包装；第三步，在AD293细胞中扩增腺病毒；第四步，从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒。五、腺病毒的病毒滴度测定与功能检测。在此，我们将介绍该方法学中的一个重要步骤：从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒。腺病毒的纯化首先从收获产病毒细胞及其培养基开始。AD293细胞被转染重组质粒后，腺病毒得以包装。随后通过逐级扩大培养对腺病毒进行扩增。在此，我们准备了25个T175培养瓶，并开始从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒。首先，我们检测了转导细胞表达的GFP的绿色荧光。如果细胞仍然贴壁，可通过轻敲培养皿或使用长刮刀将细胞刮下。收集细胞和培养基。用 PBS 清洗培养瓶，并将 PBS 也收集到 Falcon 管中。通过离心将细胞沉淀。保留细胞沉淀以及培养基，用于后续腺病毒的纯化。此步骤中，建议由一位同事协助，以加快收获过程。由于表达GFP，细胞沉淀呈绿色。将沉淀重悬于高渗Tris缓冲液中，这有助于细胞的破裂。对于细胞裂解，我们使用液氮以及加热至37摄氏度的干燥气体。裂解循环次数不得超过三次，否则病毒将受到损伤。为提高细胞破碎效率，需小心地将细胞匀浆液通过23号针头反复抽打。将细胞裂解物在9,600 × g离心12分钟。将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。将上清液置于冰上，以备后续超速离心处理。现在，我们对培养基进行处理，以分离从细胞中释放的腺病毒。为此，首先称取所需量的硫酸铵，并将其加入收集培养基的瓶子中。将瓶子剧烈振荡，直至晶体完全溶解。混合物在室温下孵育两个半小时。然后将沉淀物的悬液分装到Falcon管中。在1,600 × g条件下离心15分钟。离心后弃去上清液，将沉淀重悬于10毫摩尔Tris缓冲液中。若无法立即通过超速离心步骤继续进行腺病毒的纯化，则沉淀物经透析去除硫酸铵后，可在4摄氏度保存数天。此处我们介绍透析步骤。使用注射器将悬浮液注入预先润湿的透析盒中。样品在4°C条件下，于10毫摩尔Tris缓冲液中透析过夜。纯化的最后一步是在氯化铯不连续梯度上进行超速离心。为了形成梯度，首先用移液器吸取3 mL高密度的氯化铯溶液。在此层上方，轻轻加入3 mL低密度氯化铯溶液。将来自细胞裂解液或培养基的腺病毒颗粒悬液覆盖在梯度液顶部。用矿物油充满离心管，并放入SW41离心桶中。平衡后，将离心管对称装载到转子中，然后将转子放入超速离心机内。离心机以35,000 RPM的转速在4°C下连续运行18小时。超速离心后，将离心管放置在带有黑色背景纸的支架上，以便收集条带。将上层透明相和细胞碎片弃入含有漂白液的废液容器中。用移液枪头吸取含有完整腺病毒的最低条带，并收集至无菌的Eppendorf管中。透析后，向病毒悬液中加入蔗糖，使其终浓度为4%，并将病毒分装后于-80摄氏度冷冻保存。在结果部分，我们展示了用所获得的腺病毒感染的细胞中GFP的表达情况。转导后48小时，通过荧光显微镜观察可见，转导细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。通过流式细胞术测定表达GFP的细胞百分比。使用每细胞25个转导单位转导的人源和牛源内皮细胞中，约有50%呈GFP阳性。当仅使用每细胞五个转导单位时，小鼠肝细胞获得了相同的转导效率，但由于细胞敏感性，这与较高的死亡率相关。由于特异性受体表达水平较低，间充质基质细胞的转导导致GFP表达降低。结论。我们优化了这些繁琐的技术，以减少获得腺病毒颗粒所需的时间、成本和工作量。所制备的腺病毒能够感染多种细胞类型，并可诱导目的基因的表达。

an-efficient-method-for-adenovirus-production

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

腺病毒生产的有效方法

成年心肌细胞是从动物心脏中分离并可培养数天的原代细胞。在此培养期间，可利用腺病毒基因转导表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法均可通过共聚焦显微镜进行细胞水平的研究。...

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

本文介绍一种仅基于细胞感染的实验方案，与现有其他方案相比，该方案可将重组细小病毒的生产效率提高100倍以上。本方案依赖于使用一种新型的基于腺病毒5型的辅助病毒，该辅助病毒含有细小病毒VP转录单元（Ad-VP）。...

利用腺病毒衍生系统高效生产重组细小病毒

来源：Ehrke-Schulz, E., 等. 基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产。J. Vis. Exp.

大规模生产高容量腺病毒载体

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

在此，我们介绍一种用于构建原理验证型二价腺病毒5型（Ad5）载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的实验方案。6 通过利用抗原衣壳整合策略，该载体被证明具有良好的适应性，并能够逃逸Ad5阳性血清的中和作用...

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。...

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

随着基因治疗领域不断发展，人们日益需要创新的方法来应对这些挑战。本文介绍了一种独特的方法，该方法利用细胞工厂平台简化了高产率、高纯度腺相关病毒（AAV）载体的制备流程，可满足临床级质量标准 体内...

利用细胞工厂平台制备高滴度、高质量腺相关病毒载体的简化与标准化流程

本文描述了一种从大鼠肠道制备无细胞基质的方法。肠道支架的构建对于组织工程、干细胞生物学以及药物测试等未来应用具有重要意义。...

一种用于制备天然去细胞肠道基质的脱细胞方法

传统的可溶性I型胶原蛋白（COL1）分离方法从开始到结束需要约10天时间，原因在于缓冲液孵育时间较长，且纤维的重悬过程繁琐耗时。本文中，我们描述了一种从小块皮肤活检组织中纯化COL1的方法，耗时不足3小时。...

一种改进的皮肤I型胶原蛋白制备方法

本文介绍了一种改进的机械测试方法，用于评估骨组织与候选植入物表面之间的锚定强度。该方法可使破坏力精确地垂直或平行于植入物表面平面，并能准确地将破坏力施加于特定的种植体周围区域。...

一种改进的力学测试方法以评估骨-植入物锚定性能

了解利用pAdEasy系统生产腺病毒颗粒的优化方法，包括重组、包装、扩增、纯化和功能测试等关键步骤。该技术可高效实现基因递送，适用于多种细胞类型的基因治疗研究。

一种高效的腺病毒制备方法

探索更多视频