腺病毒生产的有效方法
2021年6月10日
在这里，我们提出了使用pAdEasy系统进行腺病毒生产的协议。该技术包括重新组合pAdTrack和pAdEasy-1质粒，腺病毒包装和放大，从细胞赖酸和培养基净化腺病毒颗粒，病毒滴定，和腺病毒的功能测试。
欢迎来到来自罗马尼亚布加勒斯特的细胞生物学和病理学研究所。在病毒转导实验室，我们使用基于沃格尔斯坦教授开发的 AdEasy 系统的优化方法展示了腺病毒粒子生产的一部分。生产这种腺病毒技术的主要步骤是，一是重新组合含有GFP的pAdTrack与BJ5183细菌中的pAdEasy-1质粒。
二、包装腺苷颗粒。三、放大AD293细胞中的腺病毒。四、从细胞水酸盐和培养基中净化腺苷酸颗粒。
五、腺病毒的病毒滴定和功能测试。在这里，我们将介绍方法的重要一步。从细胞水酸盐和培养基中净化腺苷酸颗粒。
腺病毒的净化从收获产生病毒的细胞和媒介开始。AD293细胞被重组的质粒和腺病毒包装而变质。然后腺病毒被连续的大文化放大。
在这里，我们获得了25个T175板，我们开始从细胞利萨酸盐和文化介质净化腺病毒。首先，我们检查了转基因细胞表达的GFP的绿色荧光。如果细胞仍然连接，我们将通过敲击培养皿或使用长刮刀分离它们。
细胞和介质被收集。烧瓶用PBS清洗，PBS也收集在猎鹰管中。这些细胞通过离心来撬动。
保留细胞颗粒以及进一步净化腺病毒的介质。在这一步，同事的帮助是值得赞赏的，以加快收获过程。由于 GFP 表达，细胞颗粒是绿色的。
颗粒在超音速三叉星缓冲器中恢复，这将有助于细胞的破坏。对于细胞裂解，我们使用液氮和干气加热高达37度。由于病毒会受损，不要执行超过三个周期。
为了提高细胞破坏的效率，通过23号仪表注射针小心地将细胞均质化。将细胞的离心解液在9，600 x g下，12分钟。将超自然物通过新管中，然后丢弃颗粒。
将超自然体保存在冰上，以进行超中心燃料的进一步加工。现在，我们处理培养介质，以隔离从细胞释放的腺病毒。为此，首先，我们称量硫酸铵的必要量，并将其添加到收集培养介质的瓶子中。
瓶子剧烈摇晃，直到晶体完全溶解。混合物在室温下孵育两个半小时。然后沉淀物的悬架被分成猎鹰管。
离心机在 1，600 x g 时 15 分钟。离心后，超自然物被丢弃，颗粒在10毫升的Tris缓冲器中再接再用。如果无法通过超集中式步骤继续净化腺病毒，沉淀物可能保持在四度，但只有在透析后才能去除硫酸铵。
在这里，我们介绍了透析步骤。我们使用注射器将悬架引入以前湿润的盒式磁带中。样品在四度隔夜对10毫升三叶草缓冲器进行透析。
净化的最后一步是氯化钠不连续梯度的超集中式步骤。为了形成梯度，首先，我们移液三毫升高密度溶液氯化钠。在此层的顶部，轻轻倒入三毫升低密度氯化钠。
然后，细胞赖酸或培养介质的腺苷酸颗粒悬浮物覆盖在梯度之上。管子充满矿物油，并引入 SW41 桶中。平衡后，管子对称地加载到转子中，转子引入超中心。
离心机运行35，000 RPM和4度，连续18小时不间断。超集中后，管子被放置在一个支架上，后面放着一张黑纸，以便收获带子。清晰的上部阶段和细胞碎片被丢弃在带有漂白溶液的废物容器中。
包含完整腺病毒的最低带用移液器尖端收获，并收集在无菌的埃彭多夫管中。透析后，蔗糖被添加到病毒悬浮到4%的最终浓度和病毒别名保持冻结在零下80度。在结果部分，我们展示了与获得腺病毒一起转化的细胞中的GFP表达。
转导后48小时，GFP由荧光显微镜显示的转导细胞表达。GFP表达细胞的百分比由流动细胞学决定。大约50%的人类和牛内皮细胞与每个细胞25个转导单元的转化是GFP阳性。
当每个细胞只使用5个转导单元时，对穆林肝细胞获得了相同的转导产量，但由于细胞敏感性，这与死亡率较高有关。由于特定受体的低表达，通过间质频闪细胞的转导获得降低到GFP表达。结束语。
我们优化这些费力的技术，以减少获得腺苷颗粒所需的时间、成本和努力。准备的腺病毒能够感染各种细胞类型，并诱导兴趣基因的表达。
概述
本文介绍了使用pAdEasy系统生产腺病毒粒子的详细协议。该过程包括重组、包装、扩增、纯化和腺病毒功能测试等关键步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒生物学
- 基因治疗
- 细胞生物学
背景
- 腺病毒因其能够感染多种细胞类型而被广泛用于基因治疗。
- pAdEasy系统是一种优化的腺病毒生产方法。
- 了解纯化过程对于获得高质量的病毒粒子至关重要。
- 荧光标记如GFP有助于追踪转导效率。
研究目的
- 优化腺病毒生产协议以提高效率。
- 为病毒转导研究人员提供全面指南。
- 展示生产的腺病毒在基因表达中的有效性。
使用的方法
- 在细菌细胞中进行质粒重组。
- 在AD293细胞中包装和扩增腺病毒粒子。
- 从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒粒子。
- 通过GFP表达和流式细胞术进行功能测试。
主要结果
- 成功纯化了腺病毒粒子。
- 约50%的转导的人类和牛内皮细胞表达了GFP。
- 不同细胞类型的转导产率存在差异。
- 优化减少了腺病毒生产的时间和精力。
结论
- 优化后的协议对生产腺病毒粒子有效。
- 它允许在各种细胞类型中有效地进行基因递送。
- 这种方法可以成为基因治疗研究人员的宝贵资源。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
