Name: 在Vivo CRISPR/Cas9筛查中同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解利用超声引导子宫内胚胎慢病毒注射技术，在小鼠皮肤和口腔中同时进行CRISPR/Cas9基因功能筛选的方法。该技术成本低、效率高，适用于头颈癌等多种癌症研究。

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本工作获得了加拿大卫生研究院项目资助（CIHR 365252）、克伦比尔基金会以及安大略研究基金研究卓越计划第八轮（RE08-065）的支持。Sampath Kumar Loganathan 获得了加拿大癌症协会博士后奖学金（BC-F-16#31919）。

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<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

CRISPR/Cas9 基因组编辑技术已广泛应用于体外和体内研究，以探究基因功能和细胞过程。大多数体内研究采用将经过 CRISPR/Cas9 基因编辑的细胞移植到动物模型中（同种移植或异种移植）的方法。尽管这是一种研究癌症遗传学和细胞功能的有力工具，但它仍然缺乏天然的组织微环境，并可能引发损伤和/或免疫反应。
为克服这些挑战，近年来多个研究团队开创了直接在体 CRISPR 技术，建立了多种可同时发生的自发性小鼠模型15,16,17,18。这些研究通常依赖腺相关病毒（AAV）将 sgRNA 递送至靶器官。AAV 可产生极高的滴度，从而便于制备体内操作所需的高滴度病毒。然而，由于 AAV 与慢病毒不同，无法稳定整合至基因组 DNA 中，因此严重限制了可分析基因的数量，通常仅能分析约 40–50 个基因，使得 sgRNA 文库的检测变...

在后基因组时代，癌症研究面临的挑战之一是从海量的基因组数据中挖掘出导致癌症的基因突变，并识别出基因网络中可作为治疗靶点的关键节点。尽管生物信息学分析在实现这些目标方面提供了巨大帮助，但建立高效的体外和体内模型仍是解析生物系统与疾病状态复杂性以及推动药物研发的前提条件。虽然传统的转基因小鼠模型已被广泛用于体内癌症遗传学研究，但其高昂的成本、耗时长以及劳动强度大等特点，严重限制了对现代基因组学所揭示的数百个潜在癌症基因进行系统性分析。为克服这一瓶颈，我们将一种先前建立的超声引导下子宫内注射技术1,2与CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列）基因编辑技术3相结合，能够在单只小鼠的皮肤和口腔中同时诱导并研究数百个基因的功能缺失突变。
本文所述方法利用超声引导，将经过改造的慢病毒注射到胚胎发育第9.5天（E9.5）活体小鼠胚胎的羊膜腔内。携带CRISPR/Cas9组分的慢病毒载体可转导单层的外胚层表面外胚层，该结构随后发育为皮肤和口腔的上皮组织。皮肤由外层的表皮、基底膜及真皮层组成。表皮是一种复层上皮，其最内层为基底层，该层与基底膜保持接触，并具有增殖能力和干细胞潜能。基底层进一步分化产生上方的棘层、颗粒层和角质层2,4。谱系追踪研究表明，这种直接体内CRISPR/Cas9方法可对基底层中持续存在于成年期的组织驻留干细胞进行遗传操作。由于慢病毒滴度可调节至在E9.5时期以克隆密度转导表面外胚层，因此该方法可用于构建嵌合小鼠，其体内可携带数千个独立的基因敲除克隆。随后可通过高通量测序以多重方式分析CRISPR/Cas9介导的基因失活在这些克隆中的效应5。
我们最近采用该方法评估了在人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中呈现反复突变的484个基因的功能5. 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种破坏性极强的癌症，死亡率高达40–50%，是全球第六大常见恶性肿瘤th 全球最常见的癌症6头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）起源于上呼吸道或口腔黏膜，与吸烟、饮酒或人乳头瘤病毒（HPV）感染相关。皮肤鳞状细胞癌（SCC）为皮肤肿瘤，是人类中第二常见的癌症7皮肤鳞状细胞癌和头颈部鳞状细胞癌在组织学和分子特征上非常相似，大多数病例表现出 TP53、PIK3CA、NOTCH1 和 HRAS 的改变8尽管仅有少数基因以较高频率发生突变，但已发现有数百个基因以较低频率发生突变（&#60; 5%），这一现象通常被称为长尾分布。由于大多数长尾基因缺乏生物学或临床验证，我们利用体内CRISPR筛选技术，在具有致瘤倾向且携带致敏突变的小鼠中对这些基因的功能缺失进行建模 p53, Pik3ca 或 Hras 并鉴定出多个与之协同作用的新型肿瘤抑制基因 p53, Pik3ca 或 Hras 诱导肿瘤发生5.
本文介绍了一种详细的实验方案，用于构建多重sgRNA慢病毒CRISPR文库，并在小鼠表层外胚层中进行CRISPR/Cas9基因敲除筛选。值得注意的是，该方法可进行调整，以整合其他基因操控技术，如CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi），或经修改后靶向小鼠其他器官系统，以研究基因功能。

<table><tbody><tr><td>0.45 微米滤膜</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k 或 92k 寡核苷酸芯片</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm 细胞培养板</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>铬制肠线缝合线</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>深度测序（Next-Seq 或 Hi-Seq）</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy 血液与组织 DNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Endura 电转感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Wisent Technologies</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>质粒小提试剂盒</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>小鼠氧气麻醉系统</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 微操作仪</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1（BsmBI 缓冲液）</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>针头研磨器</td><td>Sutter Instrument</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸纯化试剂盒</td><td>Zymo research</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 纯化的 Illumina 测序引物</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI（聚乙烯亚胺）</td><td>Sigma</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Permoplast 建模黏土</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带中央开口的培养皿</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 聚合酶 2x 预混液</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 荧光定量系统</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>半圆形硅胶塞</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶膜</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2000 超声成像系统</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用体内crispr/cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

基因修饰小鼠模型（GEMM）在评估基因功能、模拟人类疾病以及作为临床前模型用于探索治疗策略方面发挥了重要作用。然而，这类模型在时间、人力和成本上的高投入限制了其在系统性基因功能分析中的应用。近年来，基因组编辑技术的进步克服了这些局限，使得能够在小鼠特定器官内以多重化和快速的方式直接产生特定的基因扰动。本文介绍了一种基于CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复序列）的方法，可在小鼠皮肤和口腔黏膜上皮中生成数千个基因敲除克隆，并提供详细的操作步骤方案，以实现直接在体基因编辑&#160;体内&#160;CRISPR&#160;筛选肿瘤抑制基因。该方法可应用于其他器官或其他CRISPR/Cas9技术，例如CRISPR激活或CRISPR失活，以研究基因在组织稳态或多种疾病状态下的生物学功能。

图1A展示了在单个12k或92k寡核苷酸芯片中以经济高效的方式多重化多个定制CRISPR文库的寡核苷酸设计。在选定sgRNA（以蓝色标注）后，寡核苷酸设计需包含限制性酶切位点（橙色标注的BsmBI）以及文库特异性的PCR引物对（以绿色标注）。通过为不同文库使用独特的引物对组合，可在同一寡核苷酸芯片中设计多个文库。在使用特定PCR引物对扩增文库时，务必设置仅含水的阴性对照，并将所有反应产物在琼脂糖凝胶上进行电泳检测。阴性对照泳道在100 bp处不应出现任何条带，而文库扩增的泳道应仅出现一条100 bp的单一条带。若无条带出现，需确认所选PCR引物对是否合适。图1B展示了克隆文库的质量控制步骤，以及慢病毒的制备与浓缩流程。从克隆到转导的整个过程中，应确保sgRNA的均等代表性。对质粒DNA以及经慢病毒文库转导的细胞中PCR扩增后的DNA进行高通量测序时，其测序读数应呈现高度相关性。任何偏差均需仔细分析，以确定sgRNA代表性的丢失发生在慢病毒制备之前还是之后。若质粒DNA中的sgRNA测序读数已显示代表性不均，则必须谨慎重...

本文介绍一种快速、直接的体内CRISPR/Cas9筛选方法，该方法通过超声引导下的子宫内胚胎慢病毒注射，同时评估多个基因在免疫功能健全小鼠皮肤和口腔中的功能。

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

转基因小鼠模型（GEMM）在评估基因功能、模拟人类疾病以及作为临床前模型等方面发挥了重要作用……

该方案具有重要意义，因为它使研究人员能够以远低于传统基因敲除小鼠模型的成本，同时探究数百个基因在头颈癌中的肿瘤抑制功能。该技术具有灵活性，可进行调整以覆盖基因表达，用于研究其在皮肤中的功能。靶向CRISPR文库方案也可应用于其他类型的癌症。将麻醉后的动物仰卧位放置在加热的手术台上，使用手术胶带固定其足部。连接鼻式麻醉管，持续供给异氟烷和氧气，直至手术结束。为确认胚胎发育第9.5天（E9.5）的妊娠状态，取少量脱毛膏涂抹于腹部，并用棉签将其均匀涂抹至约3厘米×3厘米的区域。两到三分钟后，用纱布或纸巾轻轻擦去药膏，并使用 PBS 和 70% 乙醇将区域擦拭干净。使用超声探头和耦合剂，检查小鼠胚胎发育情况以确定是否处于胚胎第 9.5 天（E9.5）。也可在前一天（E8.5）进行此项检查，以便节省手术当天的时间。去除超声耦合剂，使用BPS擦拭清洁该区域，然后用70%乙醇消毒。皮下注射适量镇痛剂。随后使用无菌镊子和剪刀在皮肤上做一个垂直切口。使用钝头镊子将切口周围的皮肤与腹膜分离。然后使用无菌镊子和剪刀剪开腹膜。用钝头镊子轻轻拉出左侧和右侧子宫角，并计数胚胎。将大部分子宫角重新插入，但保留含有三个胚胎的子宫角远端暴露在外。使用钝头镊子，轻轻推动和拉动带有三个胚胎的子宫角，使其穿过经改造的培养皿中硅胶膜上的开口。使用油灰状黏土小块固定培养皿。使用硅胶模具在培养皿中固定含有三个胚胎的子宫。然后用钝头工具将胚胎侧边的硅胶塞压平。向培养皿中加入无菌磷酸盐缓冲液（PBS），并用妊娠母鼠的腹部冲洗培养皿底部的硅胶膜，以防止任何泄漏。将超声探头移入培养皿中，位于最上方胚胎上方约0.5厘米处，并调节载物台，使羊膜腔在超声图像中清晰可见。将注射针小心地对准改良后的培养皿。使用显微操作器，将针尖置于距离最上方胚胎5毫米范围内，然后前后微调针的位置，使其针尖进入超声图像中亮度最高的平面。使用显微操作仪将针头穿过子宫壁进入羊膜腔。以缓慢的注射速度向其中注入62纳升携带sgRNA文库的慢病毒。每枚胚胎按压注射按钮8次，总计注射496纳升。对另外两个胚胎重复相同的操作步骤。然后抬起超声探头，移除硅胶塞。使用无菌棉签轻轻将三个胚胎中的前两个推入小鼠腹腔内。取出接下来的三个胚胎，并将之前已注射的第三个胚胎推入。重复注射步骤，直至完成所需数量胚胎的注射，注意麻醉时间不得超过30分钟。操作结束后，抬起超声探头，取下带有注射针的显微操作器，吸除PBS，移走培养皿。使用无菌擦拭巾吸干腹腔内可能积聚的 PBS。使用可吸收缝线缝合腹膜切口。然后使用两个皮肤钉合器闭合腹部皮肤切口。接下来，对质粒和慢病毒文库转导细胞中PCR扩增的DNA进行高通量测序，其测序读长应显示出高度相关性。如果质粒DNA中的sgRNA读长未能呈现均等的sgRNA代表，则必须仔细重复慢病毒的制备和浓缩步骤。此处展示的是在出生后第0天（P0）对E9.5 Lox-STOP-Lox confetti小鼠幼崽进行超声引导下注射携带Cre重组酶的慢病毒的结果。虽然高滴度的病毒会导致小鼠皮肤更广泛的感染区域，但也可能导致多个sgRNA转入同一细胞中。该图显示了来自质粒和慢病毒文库转导细胞以及四个代表性肿瘤样本的PCR扩增DNA的高通量测序读数。与质粒文库或感染细胞相比，靶向肿瘤抑制基因ADAM10和RIPK4的sgRNA在肿瘤样本中显著富集。在E9.5天进行手术至关重要。在设置交配后的第九天，需使用超声波检查小鼠是否怀孕，并确定每只雌鼠胚胎的发育时间点。幼崽出生后，可分离出被转导的细胞，并利用最新的基因分析技术（如单细胞RNA测序）对其进行深入的表征分析。

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在Vivo CRISPR/Cas9筛查中同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。...

筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。...

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9...

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。...

利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。...

通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。...

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内...

平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

了解利用超声引导子宫内胚胎慢病毒注射技术，在小鼠皮肤和口腔中同时进行CRISPR/Cas9基因功能筛选的方法。该技术成本低、效率高，适用于头颈癌等多种癌症研究。

利用体内CRISPR/Cas9筛选技术同时评估小鼠皮肤和口腔中的基因功能

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