Name: 阿斯蒂亚纳克斯墨西哥最大育种和产卵的增量温度变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 了解如何通过渐进式温度调控促进墨西哥丽脂鲤Astyanax mexicanus的最大产卵量。该方法结合实验室饲养管理与产卵行为观察，为发育生物学和进化遗传学研究提供大量透明胚胎。

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我们感谢 David Martasian、Diedre Heyser、Amy Parkhurst、Craig Foote 和 Mandy Ng 为 Jeffery 实验室的 A. mexicanus 培养设施所做出的宝贵贡献。Jeffery 实验室的研究目前由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 EY024941 资助。

本实验程序已获得马里兰大学帕克分校机构动物照护指南的批准（当前批准编号：IACUC 469 #R-NOV-18-59；项目编号：1241065-1）。
<img alt="繁殖周与非繁殖周的鱼类饲养及水族箱维护时间表，包含每日任务和温度设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61708/61708fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 繁殖周与非繁殖周的维护日历。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61708/61708fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 周一
<ol>
	<li>在上午9-10点，进行水质检测及以下步骤1.1.1-4。
	<ol>
		<li>使用温度计记录房间、水箱和储水罐的温度。</li>
		<li>使用比色法检测试剂盒记录氨、亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。</li>
		<li>从监测系统以及比色法检测试剂盒中记录pH值。</li>
		<li>从大瓶储液器监测仪和主系统监测仪中记录电导率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从上午10点开始，喂食所有鱼类。
	<ol>
		<li>使用Tetra牌鱼粮薄片喂食成鱼系统中的所有鱼类；对于饲养幼鱼的水箱，需先将薄片碾碎。每箱投喂量以鱼群可在3-5分钟内完全摄食完毕为宜，约为“一指捏量”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查用于培养胚胎的孵化箱，必要时更换水。
	<ol>
		<li>打开胚胎孵化箱，检查所有储水槽的水位。若水位偏低，则补充系统用水。检查孵化箱的温度设置，胚胎培养温度应维持在73-77 °F（23-25 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清洁活体饵料。
	<ol>
		<li>清洁黑虫时，从活饵冰箱中取出未加盖的盛有黑虫培养物的特百惠容器，将虫团上方多余的水倒入水槽。使用蒸馏水反复悬浮并冲洗黑虫，直至倒出的水变清澈为止。</li>
		<li>加入足量清洁水，使虫团约有一半被浸没。将剩余黑虫放回活饵冰箱中，保持未加盖状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>喂食鱼类。
	<ol>
		<li>在首次喂食至少30分钟后，对需要促进繁殖的水箱中的鱼类投喂蛋黄薄片、黑虫或两者同时投喂。每箱添加约“一指捏量”的蛋黄薄片；黑虫则根据水箱中每条鱼可摄食5-10条的量，加入足够的虫团。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在上午10点至下午1点之间，将水温设定为74 °F。</li>
	<li>根据需要刷洗繁殖水箱，并安置繁殖网。</li>
	<li>在最后一次喂食后至少一小时再进行水箱清洁并放置繁殖网。在放置繁殖网前，需先清洁所有相关水箱。设置繁殖网时应小心操作，避免影响水箱的供气系统。</li>
</ol>
2. 周二
<ol>
	<li>收集胚胎并清洗所有繁殖网。
	<ol>
		<li>上午9-10点，从成鱼系统水箱底部取出繁殖网。使用连接在大瓶上的软管将胚胎轻轻冲洗至手持网中，然后将手持网倒置入盛有清洁系统水的培养皿中，使胚胎排出。</li>
		<li>收集并清洗每组胚胎，然后放入盛有含0.00003%亚甲蓝（蓝色水）的洁净系统水的指形管中。若单个水箱产生的胚胎数量特别多，应将其分装至多个指形管中。每个指形管中活胚胎的浓度应约为每200 mL蓝色水含100个胚胎。</li>
		<li>通过显微镜下观察胚胎发育阶段，并结合已发表的参考标准来估算受精时间 A. mexicanus 发育时间表17.</li>
		<li>频繁观察装有胚胎的培养皿，使用巴斯德吸管移除死亡或畸形的胚胎以及残渣（如未食用的食物或粪便）。频繁更换培养皿中的蓝色水。</li>
		<li>将培养皿放入培养箱中孵育5-7天。此时卵黄已耗尽，需投喂活体丰年虾以支持进一步发育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集产卵数据。
	<ol>
		<li>对于每一个产出胚胎的培养皿，记录以下信息。
		<ol>
			<li>记录日期和水箱编号。</li>
			<li>记录掉落的胚胎大致数量（图2): 
			高（500以上） 
			中等（200-500） 
			低(&lt;200)</li>
			<li>记录丢弃胚胎的质量（图2): 
			高（&gt;75% 存活 
			中等（25-50% 存活） 
			低（&lt;25% 存活</li>
			<li>通过查阅相关资料估算最初的产卵时间 Astyanax mexicanus 分期表17.</li>
			<li>记录鱼类产卵时系统设定的温度。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>喂食所有鱼类。</li>
	<li>将水温设定为 76 °F.</li>
	<li>准备活体饲料。</li>
	<li>喂养鱼 #2。</li>
	<li>从水箱中舀出多余的食物和碎屑，并在重置网具前进行刷洗。</li>
</ol>
3. 周三
<ol>
	<li>重复步骤 2.1–2.2。收集胚胎并清洗所有繁殖网。</li>
	<li>照常记录产卵数据。</li>
	<li>照常进行水质检测。</li>
	<li>喂食所有鱼类。</li>
	<li>将水温设定为 78 °F。</li>
	<li>准备活体饵料。</li>
	<li>检查孵化箱中的胚胎。
	<ol>
		<li>清洗并更换指形管中胚胎的水，这些胚胎最终将用于补充普通成年种群。使用亚甲蓝处理过的系统水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次喂食鱼类。</li>
	<li>根据需要清洁水箱并重置繁殖网。</li>
</ol>
4. 周四
<ol>
	<li>重复步骤 2.1–2.2。收集胚胎，并清洗和存放繁殖网。</li>
	<li>照常记录产卵数据。</li>
	<li>将水温设置为 76°F。</li>
	<li>清洁活体饵料。</li>
	<li>清洁所有单独的养殖缸。</li>
	<li>检查孵化箱中的胚胎。</li>
	<li>喂养鱼类 #2。</li>
</ol>
5. 星期五
<ol>
	<li>喂食所有鱼类。</li>
	<li>将水温设置为 74 °F。</li>
	<li>清洁活体饵料。</li>
	<li>检查孵化箱中的胚胎。</li>
</ol>
6. 星期六
<ol>
	<li>喂鱼。</li>
</ol>
7. 星期日
<ol>
	<li>喂鱼。</li>
</ol>

<ol><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+as+a+model+system+in+evolutionary+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology.</a> Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+model+systems+in+evo-devo%3A+cavefish+and+mechanisms+of+microevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution.</a> Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li>
<li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).</li>
<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17, 452-454 (2007).</li>
<li>O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+genetic+analysis+of+retinal+degeneration+in+the+blind+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish.</a> PLoS ONE. 8 (2), 57281(2013).</li>
<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, 15(2015).</li>
<li>Elliot, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Astyanax+caves+of+Mexico.+Cavefishes+of+Tamaulipas%2C+San+Luis+Potosi%2C+and+Guerrero%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Mexican+Cave+Studies+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero.</a> Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1(2018).</li>
<li>Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+hardness+and+calcium%3Amagnesium+ratio+of+water+during+early+stages+of+rare+minnows+%28Gobiocypris+rarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus).</a> Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).</li>
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<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22Determining+the+sex+of+adult+Astyanax+mexicanus%22">Determining the sex of adult Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Paschos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks%2C+feeding+time%2C+and+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 112(2015).</li>
<li>Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+control+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Circadian control of the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).</li>
<li>Williams, M. B., Watts, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+basis+and+future+directions+of+zebrafish+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics.</a> Genes & Nutrition. 14, 34(2009).</li>
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<li>Neubauer, P., Andersen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+performance+in+fish+is+explained+by+an+interplay+between+physiology%2C+behavior+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology.</a> Conservation Physiology. 7 (1), 025(2019).</li>
<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Developmental staging table for Astyanax mexicanus.</a> Zebrafish. 8 (4), (2011).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22In+vitro+fertilization+of+Astyanax+mexicanus%22">In vitro fertilization of Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
<li>Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish+and+its+river-dwelling+conspecific%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific.</a> PLoS One. 14 (2), 0212591(2019).</li>
<li>Harvey, B. J., Carolsfield, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Breeding+in+Tropical+Fish+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Development+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Induced Breeding in Tropical Fish Culture.</a> International Development Research Centre. , (1993).</li>
<li>Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+lens+survival+pathway+including+sox2+and+aA-crystallin+in+the+evolution+of+cavefish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration.</a> EvoDevo. 5, 28(2014).</li>
<li>Krishnan, J., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+and+the+basis+for+eye+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cavefish and the basis for eye loss.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487(2017).</li>
<li>Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+changes+controlled+by+catecholaminergic+systems+explain+recurrent+loss+of+pigmentation+in+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society%22%5BJournal%5D)">Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish.</a> Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).</li>
<li>Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+using+TALENs+in+blind+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish.</a> PLoS ONE. 1093, 0119370(2015).</li>
<li>Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+mutagenesis+confirms+the+role+of+oca2+in+melanin+pigmentation+in+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

Astyanax mexicanus 是一种新型的生物学模型，繁殖频繁且易于在实验室中培育1,2。由于我们关注的是A. mexicanus洞穴鱼进化变化背后的发育机制，因此胚胎的获取与使用对实现我们的研究目标至关重要。饲养成鱼的主要目的是为了获得用于发育实验的胚胎和幼鱼，并用于补充成体繁殖种群。在某些情况下，成鱼也可用于生理学、行为学或遗传学实验。遗传学实验需要配对交配或体外受精18。在温度诱导的繁殖周期中，可将表现出产卵行为的个体19从水族箱中取出，用于体外受精的杂交实验。
为了最大限度地提高用于研究的胚胎质量和数量，在繁殖周之前需要注意一些操作细节。操作鱼缸中的鱼类时，应仅使用指定的手持网具，每次使用后需将网具浸入网具浸泡液中，并用热水冲洗，以防止不同鱼缸之间的交叉污染。仔细清洗和消毒所有用于鱼类护理的器械。在将繁殖网放回鱼缸之前，...

硬骨鱼 Astyanax mexicanus 具有具眼的穴居表层鱼类（表层鱼）形态，以及多种不同的盲眼洞穴鱼类（洞穴鱼）形态1,2洞穴鱼在持续黑暗和食物受限的环境中进化，导致了新的建设性性状和退化性性状的出现3。建设性性状包括味蕾和下颌尺寸的增加、侧线感觉器官以及脂肪储备。退化性性状包括黑色素沉着、眼睛以及某些行为（如睡眠、群集行为和攻击性）的缺失或退化。一种该物种的属性 Astyanax 两种形态之间具有完全的生育能力，使得可利用数量性状位点（QTL）定位来确定与建构性进化和退行性进化相关的基因组区域4,5,6,7. A. mexicanus 提供了一个研究发育的有利体系，因为它可在实验室中被诱导频繁产卵。其胚胎 A. mexicanus 呈半透明状，略大于斑马鱼的卵，可大量产出，并在约8-12个月内发育为性成熟的成体。其产卵能力的高峰期约为5年。本方案描述了在实验室中进行相关操作所需的流程 A. mexicanus 在典型繁殖周期内，养殖设施的管理细节，包括鱼类系统的维护以及为实现最大产卵量而采取的温度控制方案。
A. mexicanus 是一种热带鱼类，栖息于石灰岩高原的河流（表型鱼）以及石灰岩洞穴中的水池（洞穴型鱼）8。石灰岩溶解后形成硬水，A. mexicanus 能在硬水中良好生长。适应硬水环境的鱼类可耐受一定范围的盐度条件，但通常在特定条件下繁殖9。产卵行为的诱导需多种因素共同作用。由于鱼类为变温动物，依赖外界环境维持体内稳态，其代谢对环境变化敏感，对胁迫因素反应更为迅速10。A. mexicanus 应在水流量、pH、电导率、渗透压、光照和水温等参数均严格调控的水生系统中进行培养。
在Jeffery实验室中，鱼类饲养于两个流水系统中：（1）“幼鱼系统”，用于性成熟前的年轻成鱼；（2）成鱼（或主）系统，用于性成熟的繁殖成鱼。“幼鱼系统”由8 L和15 L的水箱组成，供应流动水。该系统中的幼鱼和刚完成变态的幼体最初在较小（1–10 L）的水箱中由鱼苗培育而来，这些小水箱每周换水一次。鱼苗、仔鱼和幼鱼对食物高度依赖，必须每天投喂一次活饵（卤虫），以确保较高的存活率。来自“幼鱼系统”的年轻幼鱼在约1–1.5年后被转移至成鱼系统。初期投喂碾碎的薄片饲料，随着进一步生长，再转入常规的成鱼喂养方案。雌鱼的性成熟可通过腹部体积进行评估，性别鉴定方法已有描述11。在成鱼系统中，42 L水箱内的水每24小时自动更换3次。该系统通过目视检查以及探头自动监测温度、pH值和电导率，每日进行监控。系统最适pH值约为7.4，可维持在6.8–7.5之间；基础温度为72/73 °F；理想电导率范围为600–800 mS。自动读数显示在控制器屏幕上，同时通过分布于整个系统的流量计读取水压的目视检查结果。每周还需通过比色法检测温度，并测定pH值、氨和硝酸盐等水质参数，以独立核查水质。通过向系统中添加有益细菌（如Nutafin Cycle），将氨和硝酸盐水平维持在零或接近零的水平。室内光照由定时器控制，设定为每日14小时光照、10小时黑暗。除上述整体水质参数外，在繁殖周还需特别关注以下事项。
首要考虑因素是光周期，因为鱼类（即使是在实验室中的洞穴鱼）依赖光周期来调节其昼夜节律。昼夜节律可影响从繁殖、摄食到免疫系统健康等各个方面12,13，为获得最佳健康效益，光周期必须保持稳定。鱼类在流水系统中饲养，采用14小时光照与10小时黑暗的光周期。通常情况下，表型鱼在系统转为黑暗约一小时后开始产卵，若在此期间引入光照，可能会干扰甚至终止产卵过程。盲眼洞穴鱼的产卵行为受光照干扰较小。与表型鱼相比，洞穴鱼的产卵时间较晚，通常在系统转为黑暗后四至五小时才开始。
第二个考虑因素是营养。成年鱼类通常每天投喂一次七彩神仙鱼薄片饲料。在产卵前，鱼类需投喂富含蛋白质的饲料，并额外补充七彩神仙鱼薄片及其他食物：蛋黄薄片，偶尔添加活的加利福尼亚黑蠕虫（Lumbriculus variegatus），以弥补上一个产卵周期因产卵造成的蛋白质流失。在繁殖周期的一周内，鱼类每天投喂两次，分别在早晨和下午/傍晚进行。应避免每天仅投喂一次但单次投喂量过大的方式，因为这可能导致营养不良14。
第三个考虑因素是空间。空间需求基于成年个体的平均体重，以及行为学因素，例如鱼类是否具有群游行为或攻击性行为。养殖密度过高或过低均可能导致攻击行为加剧和持续性应激，使鱼类容易受到同缸同伴的伤害，并且不愿参与繁殖活动15。我们通常在每个42 L的水族箱中饲养10至20条鱼。
第四个考虑因素是温度。如上所述，鱼类是变温动物，依赖环境来维持体温。由于温度对代谢过程具有直接影响，温度变化可能引发鱼类行为的改变16。本繁殖程序包含为期两周的温度循环：第一周将温度升高至78 °F，第二周则维持在72 °F的恒定温度。在第一周（繁殖周）的每个晚上，将带有塑料边缘的繁殖网放置在水族箱底部。繁殖网可在成鱼与产出的卵之间形成屏障，防止卵被摄食。温度在当周中期之前每天升高2 °F，直至达到最高78 °F，并在本周前2至3个傍晚根据光照周期诱导产卵。随后在当周剩余的几天内，温度以每天降低2 °F的幅度逐步降至72 °F，并在此后维持基础温度，直至下一轮繁殖周开始。通常每月诱导繁殖不超过两次，以保证鱼类有足够的恢复时间。
总体而言，该方法可实现大量产卵&#160;在更长的时间内获得大量最优质胚胎。

<table><tbody><tr><td>黑涡虫</td><td>Eastern Aquatics, Lancaster, PA</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>繁殖网</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丰年虾卵</td><td>AquaCave Lake Forest, IL.</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>比色测试试剂盒</td><td>Petco</td><td>SKU:11916</td><td>API 淡水 pH 测试试剂盒</td></tr><tr><td>蛋黄片</td><td>Pentair, Minneapolis, MN</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>指形管</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>741004</td><td>培养皿，4.5 英寸，250 mL</td></tr><tr><td>手持网</td><td>任意宠物商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-029-321HPM</td><td>405 L</td></tr><tr><td>Instant Ocean 海盐</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>亚甲基蓝</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20</td><td>5.75 英寸</td></tr><tr><td>网具浸泡液</td><td>任意宠物商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrafin Cycle</td><td>Amazon</td><td>无</td><td>细菌促进剂</td></tr><tr><td>活体饲料冷藏冰箱</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>任意来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetra 热带薄片饲料</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>无</td><td></td></tr></tbody></table>

astyanax mexicanus 繁殖和产卵最适条件下的渐进式温度变化

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

墨西哥四眼鱼（Astyanax mexicanus）是研究发育与进化生物学的一个新兴模式系统。该物种中存在具眼的表层形态（表层鱼）和无眼的洞穴形态（洞穴鱼），为探究形态与行为进化的潜在机制提供了独特机会。洞穴鱼在进化过程中获得了多种新的构造性特征和退化性特征。构造性变化包括味蕾和下颌的增加、侧线感觉器官的发达以及体脂含量的升高；退化性变化则包括眼睛的缺失或退化、黑色素色素的减少、群游行为的丧失、攻击性的降低以及睡眠时间的减少。为了通过实验手段深入研究这些变化，获得大量受精卵胚胎至关重要。自20世纪90年代在德克萨斯州和墨西哥采集到最初的A. mexicanus表层鱼和洞穴鱼以来，其后代已在Jeffery实验室中被定期诱导繁殖，每两个月可产生成批的胚胎。尽管繁殖过程受到食物丰度与质量、明暗周期和温度等因素调控，但我们发现，逐步变化的温度在诱导最大程度产卵方面起着关键作用。在一个繁殖周的前3天内，将水温从72 °F逐步升高至78 °F，可实现连续两到三天的高效产卵，获得数量最多且质量最高的胚胎；随后在产卵周的最后3天内，再将温度从78 °F逐步降低至72 °F。本视频所展示的流程详细说明了在实验室条件下，为实现温度梯度诱导产卵而在繁殖周前后所执行的操作步骤。

我们通常繁殖和培育来自墨西哥圣路易斯波托西州纳西米恩托-德尔里奥乔伊（Rio Choy surface fish）的地表鱼类后代，以及来自德克萨斯州巴尔莫雷亚州立公园圣所罗门泉（Texas surface fish）的地表鱼类后代；洞穴鱼类则源自墨西哥塔毛利帕斯州的埃尔帕琼洞穴（Pachón cave fish）、墨西哥圣路易斯波托西州的洛斯萨比诺斯洞穴（Los Sabinos cave fish）和蒂纳哈洞穴（Tinaja cave fish）。
在繁殖周期的一周内，需对多个水箱的数据进行收集。观察每个水箱中产出的胚胎数量和质量。数量分为高、中、低三个等级：若产出的胚胎数量超过500，则记录为“高”；若数量在200至500之间，则记录为“中”；若数量少于200，则记录为“低”。质量同样分为高、中、低三个等级：若培养皿中存活的胚胎比例超过75%，则记录为“高”；若存活比例在25%至75%之间，则记录为“中”；若存活比例低于25%，则记录为“低”。数量和质量等级随后被赋予数值，其中“高”对应3，“中”对应2，“低”对应1。若某次繁殖未产出胚胎，或产出的胚胎均无存活，则赋值为0。</p...

本文概述了用于诱导墨西哥盲鱼Astyanax mexicanus最大程度产卵的基本实验室条件和实验方案，该物种是发育与进化研究领域的一个新兴模式生物。

Astyanax mexicanus 繁殖和产卵最适条件下的渐进式温度变化

墨西哥四眼鱼（Astyanax mexicanus）是一种新兴的发育与进化研究模式体系。其存在具眼的表层个体（表层鱼）……

因此，墨西哥盲鱼是一种小型鱼类，原产于墨西哥东北部和美国德克萨斯州南部。其重要特征在于它以两种形态存在。一种是生活在地表的鱼类，具有较大的眼睛和色素沉着；另一种是洞穴生活的鱼类，已经失去了眼睛和色素。这两种形态仍然能够产卵，并且可以相互杂交，因此可用于正向遗传学分析，以研究遗传学与发育过程。此外，它们具有较大且透明的胚胎，可用于比较发育生物学的研究。因此，长期以来，它们一直被用作研究发育进化的模型系统。在期望产卵前数天，我们开始改善鱼类的喂养条件。同时逐步提高水温，使其在预定产卵时间内经历大约两到三天的强烈产卵期，产生大量受精胚胎，这些胚胎能够良好发育，并顺利通过幼虫阶段直至成体。上午10:00用少量Tetra鱼粮喂鱼后，检查将用于培养发育中胚胎的指形管的培养箱，并在必要时更换水。检查所有储水槽的水位，向水位偏低的储水槽中添加系统用水。然后将培养箱温度设为23摄氏度。首次喂食至少30分钟后，向繁殖缸中的鱼投喂少量蛋黄薄片，或投喂足量的黑蠕虫团块，使每条鱼可摄食约5至10条蠕虫，也可两者同时投喂。第二次喂食至少一小时后，根据需要刷洗繁殖缸，并小心设置繁殖网，避免干扰鱼缸的供气系统。次日上午9:00至10:00之间，将繁殖网从成鱼系统缸底部取出。使用连接到其上的软管将胚胎轻轻冲洗到手持网中。将网倒置入装有清洁系统水的指形管中，并将约100个胚胎转移至含有200毫升清洁系统水的指形管中，水中需添加0.00003%亚甲蓝。在体视显微镜下对胚胎进行分期，根据A-mexicanas发育时间表估算受精时间。完成分期后，将指形管放入培养箱中孵育5至7天，并用活体丰年虾喂养培养物。对于每一个产卵的水族箱，记录产卵日期和水族箱编号，并记录所产胚胎的数量和质量。根据分期表记录平均产卵时间，并记录鱼类产卵时系统的温度。全天使用巴斯德移液管监测胚胎培养皿中的情况，及时移除死亡或畸形的胚胎以及残渣（如未食用的食物或粪便），并根据需要更换蓝色的水。下午1:00，按照示范方法喂食繁殖缸中的鱼类，并将水温设定为24摄氏度。然后清除水箱中多余的饲料和残渣，并在重新安置网具前刷洗水箱。在周三和周四重复进行胚胎收集与评估操作，方法同周二所示。喂食鱼类，并将水温调节至适当温度。检查培养箱中的胚胎，并用新鲜的亚甲蓝处理过的系统水更换手指碗中的水。然后根据需要清洁繁殖箱并重新设置网具。周五在喂鱼后，将水温设置为23摄氏度，并检查培养箱中的胚胎。在周六和周日喂食鱼类。本图显示了从2017年7月至2020年3月期间，Rio Choy和Texas Surface鱼类以及Los Sabinos、Tinaha和Pachon洞穴鱼的繁殖数据。数据按繁殖周进行分析，并统计了每繁殖周内每天平均收集的胚胎数量。数据显示，里奥乔伊地表鱼、德克萨斯地表鱼和帕琼洞穴鱼全年持续繁殖。大多数里奥乔伊地表鱼的繁殖数量和质量处于低至高水平之间，而大多数德克萨斯地表鱼和帕琼洞穴鱼的繁殖数量和质量则处于低至中等水平之间。蒂纳哈洞穴鱼和洛斯萨比诺斯洞穴鱼的产卵并不持续，在夏末至秋季期间，这些鱼类的产卵量较低或几乎不产卵。尽管洛斯萨比诺斯洞穴鱼的产卵量最低，但其胚胎质量最佳。总体而言，这种表面栖息的鱼类在产卵数量和质量上均优于洞穴鱼。利用该系统，我们能够每两个月繁殖数百甚至数千枚卵，这些卵以及随后的胚胎可用于多种不同用途。

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Developmental Biology

发育生物学

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