Name: 人类乳腺上皮细胞致癌转化的体外评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习人类乳腺上皮细胞致癌转化的体外评价方法，通过检测细胞增殖速率、锚定非依赖性生长能力及三维培养中的细胞谱系分布，为肿瘤生物学研究提供可靠的实验工具。

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AG 实验室由西班牙核安全委员会资助。T.A. 和 A.G. 是一个获认可的研究团队的成员 加泰罗尼亚自治区政府 （2017-SGR-503）。MT 的合同由科学基金会资助 西班牙抗癌协会 [AECC-INVES19022TERR]。G.F. 的合同由Cellex基金会的资助提供资金。

以下实验所用的人体样本来自巴塞罗那的Clínica Pilar Sant Jordi诊所按照标准程序签署知情同意书后开展的乳房缩小成形术。除非另有说明，所有操作均在II级生物安全柜中进行。
1. 人乳腺上皮细胞的体外培养及生长曲线绘制
<ol>
	<li>乳腺原代上皮细胞（BPECs）的体外培养：细胞传代 
	注意：BPEC的分离与细胞培养请参照Ince等（2007）6所述方法。
	<ol>
		<li>培养基制备。
		<ol>
			<li>根据培养的是原代或转化的BPEC，向WIT基础培养基中添加制造商提供的P或T补充剂。</li>
			<li>向补充后的WIT培养基中加入霍乱毒素，终浓度为原代BPEC 100 ng/mL，转化BPEC 25 ng/mL。 
			警告：霍乱毒素若吞食可致死。使用时需佩戴个人防护装备，避免其释放至环境中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞培养的维持与传代。 
		注意：以下步骤以T25培养瓶中的细胞为例。然而，可根据培养容器的表面积按比例调整体积。
		<ol>
			<li>每日观察细胞汇合度。当培养物达到90%汇合时，进行细胞传代。</li>
			<li>为每个培养瓶准备1×PBS、3×胰蛋白酶、培养基，以及一个含有2 mL胎牛血清（FBS）的15 mL离心管。</li>
			<li>从培养瓶中移除培养基，并将其保留在含有FBS的15 mL离心管中。</li>
			<li>用1×PBS冲洗细胞。</li>
			<li>加入1 mL 3×胰蛋白酶，使细胞从培养表面脱落。在37 ˚C孵育5分钟。</li>
			<li>检查细胞是否已完全脱落。若未完全脱落，可剧烈震荡培养瓶。</li>
			<li>加入预先保留的含FBS的培养基以终止胰蛋白酶消化。</li>
			<li>收集细胞悬液，并转移至15 mL离心管中。</li>
			<li>以500 x g离心5分钟，弃去上清液，用手指轻弹管底重悬细胞沉淀。</li>
			<li>向细胞沉淀中加入1–2 mL新鲜培养基，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板测定细胞浓度。该数据将用于计算群体倍增数并绘制生长曲线。以12,000 个细胞/cm2（例如，T25培养瓶接种300,000个细胞）的密度接种于经修饰的细胞培养表面培养瓶中（见材料表）。 
			注意：若细胞浓度过高，应稀释细胞悬液，以确保准确计数。</li>
			<li>补加培养基至终体积5 mL，将细胞置于37 ˚C、5% CO2环境中培养。</li>
			<li>每48小时更换一次细胞培养基。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>群体倍增数计算与数据可视化
	<ol>
		<li>利用步骤1.1.2.10中获得的细胞计数数据，应用以下公式计算累积群体倍增数（PD）： 
		<img alt="静态平衡方程；PD=PDᵢ+log(Nₕ/Nₛ)/log2；用于分析的数学公式" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"> 
		其中，PDi表示细胞在前一次传代前所达到的群体倍增数（即前一次传代时累积的PD值），Nh为收获的细胞数，Ns为接种的细胞数。</li>
		<li>使用XY坐标图表示特定时间段内的数据，横轴（x-轴）为培养天数，纵轴（y-轴）为累积PD值。</li>
		<li>拟合最佳直线并获得拟合方程： 
		<img alt="线性方程 y=bx+a，代数中的数学公式，用于数据分析的教育图示" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式2"> 
		注意：斜率（b）增大表示增殖速率加快。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基底膜基质中的三维（3D）培养及免疫荧光蛋白检测
<ol>
	<li>在基底膜基质中的三维培养 
	注意：本实验方案改编自 Debnath 等人，200310，并针对 24 孔板进行了优化（参见材料表）。
	<ol>
		<li>实验前一天准备材料：将基底膜基质在 4 °C 预冷过夜，并将移液器吸头、微量离心管和培养板放入冰箱中冷却。 
		注意：基底膜基质长期储存需保存在 -20 °C。建议分装保存，以避免反复冻融。</li>
		<li>实验当天，将预冷的材料置于冰上。</li>
		<li>用冷的无菌 1× PBS 冲洗各孔，以降低表面张力。</li>
		<li>在每孔底部加入 100 µL 基底膜基质。 
		注意：缓慢分配基质，并使其均匀覆盖整个孔底；避免底层形成气泡至关重要，否则可能导致单层细胞生长。</li>
		<li>将培养板放入 37 °C 培养箱中，使基质层固化。 
		注意：通常约需 20 分钟完成固化。</li>
		<li>同时，按照步骤 1.1 所述方法进行细胞消化。在 500 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用培养基重悬细胞。制备浓度为 400,000 个细胞/mL 的细胞悬液，并通过移液轻轻吹打以分散任何细胞团块。</li>
		<li>在培养基中加入终浓度为 8% 的基底膜基质，与细胞悬液按 1:1（v/v）混合，得到含 4% 基底膜基质、浓度为 200,000 个细胞/mL 的细胞-基质混合液。 
		注意：应准确计算所需培养基体积，以避免基质浪费。</li>
		<li>在已固化的基质层上方加入 500 µL 上述细胞-基质混合液，接种总量为 100,000 个细胞（终浓度为 4% 基底膜基质）。</li>
		<li>将细胞在 37 °C 培养数分钟后，再加入 500 µL 含 4% 基底膜基质的培养基。将细胞置于含 5% CO2 的培养箱中 37 °C 培养 14 天。接种的细胞将聚集并增殖，形成类似腺泡的结构。 
		注意：可在三维结构形成过程中通过延时成像监测细胞运动与聚集情况。使用图像分析软件（如 Fiji/ImageJ 或 Imaris）评估这些过程。形成的腺泡数量与大小取决于细胞聚集效率和增殖速率，不同细胞类型间可能存在差异。可通过调整基底膜基质浓度和接种细胞数量，以获得理想的三维结构。</li>
		<li>每周 2–3 次补充 500 µL 含 4% 基底膜基质的培养基。 
		注意：操作过程中应轻柔处理培养板，避免扰动各层结构。</li>
		<li>如需分析，可在培养期间测量腺泡的数量与大小。方法为：接种后不同时间点，使用相差或微分干涉（DIC）倒置显微镜随机拍摄图像，并利用图像分析软件测量 100–200 个三维结构的直径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色 
	注意：本部分操作无需无菌条件。
	<ol>
		<li>移除培养基。</li>
		<li>使用剪去尖端的 p200 移液器吸头破坏基底膜基质。取约 50 µL 分散后的基质滴加至载玻片上，并涂抹成 1–2 cm2 的区域。</li>
		<li>室温下自然晾干，或使用 37 °C 加热板加速干燥。随后在 -20 °C 条件下用甲醇:丙酮（1:1, v/v）固定 30 分钟。 
		注意：此步骤将消除先前标记物（如细胞表达的荧光蛋白）的荧光信号。 
		警告：甲醇易燃，吸入、吞咽或皮肤接触均有毒性。操作时须佩戴个人防护装备，并在通风橱内进行。</li>
		<li>弃去固定液，如有残留液体，可将载玻片倾斜置于滤纸上吸除。 
		注意：本步骤可暂停。样品干燥后可在 -20 °C 保存数月。</li>
		<li>使用含 5% 正常山羊血清和 0.1% Triton X-100 的 1× PBS（封闭液）在室温下封闭样本表位 2 小时。</li>
		<li>同时，将一抗或二抗用封闭液稀释至所需工作浓度，配制抗体工作液。 
		注意：抗体浓度需根据细胞类型和抗体产品编号精确调整。作为参考，在人乳腺上皮细胞（BPEC）中鉴定腔面细胞和肌上皮细胞谱系时，可使用抗 Cytokeratin 14 和抗 Claudin-IV 一抗（参见材料表）。推荐工作浓度为：上述一抗 1:100，抗小鼠和抗兔二抗 1:500（参见材料表）。</li>
		<li>每张载玻片加入 30 µL 一抗工作液，并用实验室封口膜覆盖以防止蒸发。4 °C 湿盒中避光孵育过夜。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤三次，每次 1 小时。</li>
		<li>重复步骤 2.2.7，使用二抗进行孵育，过程需避光进行。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 2 小时。 
		注意：可根据具体样本调整抗体浓度、孵育时间及洗涤强度，以优化信噪比。</li>
		<li>移除残留 PBS，待样本干燥后，用含 0.25 µg/mL DAPI 的抗荧光淬灭封片剂进行复染。盖上盖玻片，轻轻放下避免施压，最后用指甲油封片。 
		注意：样本可在 4 °C 保存数周；长期保存建议置于 -20 °C。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜分析每个腺泡的荧光信号分布。 
		注意：共聚焦显微镜的配置需根据所用设备和样本所用抗体精确设定。作为参考，若使用材料表中列出的设备与试剂，建议采用 40 倍物镜，并设置如下激光与检测器参数：DAPI 使用 405 激光激发（3%–5%），PMT 检测器（800 V，偏移量：-9），光谱采集范围为 410–500 nm；A488（Claudin-IV）使用 488 激光激发（7%–10%），PMT 检测器（800 V，偏移量：-20），光谱范围为 490–550 nm；Cy3（Cytokeratin 14）使用 555 激光激发（2%–10%），PMT 检测器（800 V，偏移量：-35），光谱范围为 560–600 nm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 非贴壁依赖性实验、MTT 染色及自动克隆计数
<ol>
	<li>非贴壁依赖性实验：琼脂与细胞悬液铺板 
	注意：本实验方案改编自 Borowicz 等，2014 年11 在BPECs中进行实验。
	<ol>
		<li>在无菌瓶中，用超纯水配制1.2%琼脂溶液。将溶液高压灭菌，并在实验过程中维持于42 °C。琼脂溶液可于4 °C保存；使用时，加热至完全融化呈液态即可。 
		警告：使用耐热手套，以免在高压灭菌后烫伤。 
		注意：从此步骤开始，必须保持无菌条件。</li>
		<li>将完全预热的培养基与1.2%琼脂溶液按1:1（v/v）混合，配制0.6%琼脂溶液。置于42 °C保温，防止提前凝固。 
		注意：培养基可预先添加双倍补充物，待混合后即可获得完全补充的含0.6%琼脂的培养基溶液。</li>
		<li>在35 mm培养孔底部加入1.5 mL含0.6%琼脂的培养基溶液，室温下静置使其凝固。确保琼脂凝固前培养皿底部完全覆盖，否则细胞可能贴附于皿底并以单层形式生长。 
		注意：可使用黏附性和非黏附性表面培养板。</li>
		<li>同时，用胰蛋白酶消化细胞，离心后重悬于培养基中，配制成 50,000 个细胞/ml 的溶液，并通过反复吹打轻轻分散任何细胞团块。</li>
		<li>在培养基中制备含0.3%琼脂的细胞悬液，终浓度为25,000个细胞/mL。 
		注：不同细胞类型的最适细胞浓度可能有所不同。可尝试不同浓度，直至形成单个克隆集落。
		<ol>
			<li>放置一个 40 µm 将滤器置于50 mL无菌离心管上方，过滤50,000个细胞/mL的溶液，使滤液滴入管底。</li>
			<li>从50 mL无菌管中取出滤器，将含有细胞的管子倾斜至45˚角，沿管内壁滴加等体积的0.6%琼脂+培养基溶液。此操作可使琼脂溶液充分冷却，避免损伤细胞并防止其过早凝固。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将混合物充分匀浆，取1 mL含0.3%琼脂与细胞悬液的混合物（含25,000个细胞）加至先前已凝固的底层琼脂培养基上。</li>
		<li>使用倒置显微镜观察接种的细胞，以确保细胞呈单个分布。否则，应重复实验。</li>
		<li>待琼脂层完全凝固后，小心地在上方加入1 mL新鲜培养基，注意不要扰动下方脆弱的琼脂层。</li>
		<li>在 37 ˚C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞2 在培养箱中孵育3周。 
		注：不同细胞类型的集落形成所需时间可能有所不同，但通常3周已足够。</li>
		<li>每周更换培养基两次。操作时，轻轻将培养板向您方向倾斜，从较低一侧的角落吸除培养基，然后加入1 mL新鲜培养基。 
		注意：避免触碰琼脂层，因其易从培养皿上脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT染色
	<ol>
		<li>在无菌瓶中用超纯水配制 6 mg/mL 的噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）储存液，并使用滤器过滤溶液 0.2 µm 过滤器。该MTT溶液可在-20 ˚C保存长达6个月。 
		注意：MTT 可能引起刺激，并疑似导致遗传缺陷。使用安全眼镜、手套和呼吸过滤器。 
		注意：避免反复冻融循环。</li>
		<li>用无菌超纯水将MTT储备液稀释，配制成1 mg/mL的工作液。</li>
		<li>菌落形成期结束后，移除培养板中的培养基，每孔加入1 mL浓度为1 mg/mL的MTT溶液。</li>
		<li>在培养箱中孵育24小时。轻轻吸去MTT溶液。培养板可在4 ˚C下保存数周。 
		注意：避免光照，以防产生非特异性结晶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>菌落计数
	<ol>
		<li>使用倒置显微镜获取每块培养皿的图像。调整放大倍数，以在尽可能少的图像数量下获得最大的视野，同时仍能检测到微小菌落（通常使用 4x 或 10x 物镜）。 
		注意：确保图像具有均匀的背景。由于未染色的菌落不会被定量分析，因此无需使用相差显微镜或微分干涉相差显微镜。</li>
		<li>将图像上传至 ImageJ/Fiji 软件12 计数集落的数量以及每个 MTT 阳性集落的面积。 
		注意：用于自动定量的脚本作为补充材料提供 补充文件. 要执行代码，请将其粘贴到宏编辑器中（插件 | 新建 | 宏）并按照说明操作。
		<ol>
			<li>通过阈值分割原始图像获得二值掩膜（图像 | 调整 | 阈值）以获得边界清晰的菌落（图1). 
			注意：通常需要 8 位或 16 位图像来执行此步骤。推荐使用“最小阈值”方法。</li>
			<li>运行 Biovoxxel 插件中的扩展粒子分析器13 (插件 | BioVoxxel | 扩展粒子分析器)以鉴定MTT阳性菌落（图2）。初始引导条件：大小（µm2) = 250–Infinity；实度 = 0.75–1.00。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据公式由每个菌落面积值（A）估算平均直径（D）： 
		<img alt="物理学中衍射公式 D=2(A/π)^1/2，光学研究用推导示意图。" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"></li>
		<li>通过排除低增殖菌落（如直径较小的菌落）来筛选结果。
		<ol>
			<li>每周选择最少的分裂次数（m) 需予以考虑（例如，1）。</li>
			<li>估算菌落的半径（R）与 n 细胞，依据以下公式： 
			<img alt="物理学中的方程，显示 R = r(n/ρ)^(1/3)，表示在密度分析中的一种关系。" src="/files/ftp_upload/61716/61716equ04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4"> 
			其中， r 是悬浮单个细胞的平均半径， n 是形成菌落并遭受损伤的细胞数量 m 每周分裂次数 w 培养数周后，处于指数生长期： n = 2(m*w). ρ 是包装效率。注意，在随机排列中，包装效率约为 0.64，而相同球体最致密的可能堆积分数为 0.7414.</li>
			<li>丢弃所有直径小于2R的菌落，因为这些菌落的细胞未达到步骤3.3.4.1中所考虑的最小分裂次数。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+models+of+human+mammary+epithelial+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Culture models of human mammary epithelial cell transformation.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (4), 365-378 (2000).</li>
<li>Schinzel, A. C., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+and+experimental+models+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%3A+A+Journal+and+Virtual+Library%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation and experimental models of human cancer.</a> Frontiers in Bioscience : A Journal and Virtual Library. 13 (13), 71(2008).</li>
<li>Balani, S., Nguyen, L. V., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+process+of+human+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modeling the process of human tumorigenesis.</a> Nature Communications. 8 (1), 15422(2017).</li>
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<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+human+reduction+mammoplasty+and+mastectomy+tissues+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Zubeldia-Plazaola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+promote+transition+of+ductal+carcinoma+in+situ+to+invasive+ductal+carcinoma+by+inducing+myoepithelial+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids promote transition of ductal carcinoma in situ to invasive ductal carcinoma by inducing myoepithelial cell apoptosis.</a> Breast Cancer Research. 20 (1), 65(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的实验方案为评估体外培养细胞的癌变转化提供了有用的工具。每种技术仅评价转化过程的特定方面，因此在根据单一分析得出结论时必须特别谨慎。生长曲线的建立是一种方法，其所需信息在为其他目的培养细胞时通常已经具备，这使得该技术相较于其他细胞增殖检测方法更为经济且易于实施。然而，为了获得有效的结果，在每次传代培养时对细胞进行计数和接种都必须格外注意。生长速率的增加提示细胞可能发生转化1，但不应单独依赖此指标，因为其他外源性因素，如抗生素和抗真菌物质的添加或去除，或培养条件（例如温度、CO2浓度）的变化，也可能影响细胞分裂。还应注意到，细胞转导或药物处理可能在随后数天或数周内影响其生长速率，从而导致对长期增殖能力的误判。因此，必须设置适当的对照实验。
在基底膜基质中进行三维培养，可评估细胞在一个完整功能单位——腺泡内的分布情况。结构排列异常提示细胞间通讯受损，可能导致功能丧失，这是肿瘤组织的特征之一。某些腺泡呈现非极性排列，表明部分细胞已启动转化过程。在技术层面，准确确定接种细胞的最...

肿瘤的发生需要多个连续事件的积累。2011年，Hanahan 和 Weinberg 提出了使转化细胞能够生长、存活和扩散的10种能力，即所谓的“癌症标志性特征”1。本文所述的方法整合了三种不同的工具，通过聚焦肿瘤细胞的一些特有特征，用于评估体外细胞转化。这些技术可评估细胞增殖速率、细胞在三维培养中的行为，以及细胞在非贴壁依赖条件下形成克隆的能力。
细胞模型对于体外验证假设至关重要。为研究癌症，已开发出多种方法以建立细胞转化的实验模型。2,3,4由于乳腺癌是全球女性中最常见的癌症，约占癌症死亡病例的15%&#160;在女性中5，为深入研究提供合适的乳腺上皮细胞模型至关重要。本文展示了三种技术在评估细胞转化方面的潜力，所用实验模型为乳腺原代上皮细胞（BPECs）的转化，该模型最初由Ince及其同事于2007年描述。6 并在我们实验室中后续实施7。该实验模型基于对三个靶向基因的依次修饰（SV40 Large T 和 small t 抗原，下文中简称为 Ttag, hTERT，以及 HRAS)整合到非转化BPECs的基因组中。此外，BPECs的衍生方法有利于维持具有腔面或肌上皮标志物的乳腺上皮细胞，从而获得保留部分乳腺生理特性的异质性细胞培养体系。
在乳腺中，负责乳汁生成的腔面乳腺上皮细胞位于腺腔附近，而肌上皮细胞则分布在腔面细胞周围，负责收缩运动，将乳汁推送至乳头。这些细胞谱系之间正常排列结构的丧失是肿瘤转化的一个特征8，可通过三维细胞培养中对特异性谱系标志物进行免疫荧光检测，在体外进行评估。肿瘤细胞的另一个重要特征是其无需附着于其他细胞或细胞外基质即可生长的能力1。当正常细胞被迫在悬浮状态下生长时，会激活诸如anoikis（失巢凋亡）——一种因脱离细胞外基质而诱发的细胞死亡形式——等机制9。逃避细胞死亡是癌症的显著标志之一，因此转化细胞能够抑制anoikis，以锚定非依赖的方式存活。该能力可通过软琼脂锚定非依赖性生长实验在体外进行评估。此外，肿瘤组织的一个固有特征是其持续的增殖信号能力，这一特性可在体外通过测量细胞数量随时间的增加来轻松监测，不仅可在悬浮实验中进行，也可通过监测单层贴壁培养细胞的生长速率来实现。
尽管测试肿瘤发生潜能的最佳模型是将肿瘤细胞接种到小鼠模型中并原位评估肿瘤的形成，但仍应尽可能减少实验过程中所使用的动物数量。因此，建立合适的体外转化评估方法成为当务之急。本文提供了一套可用于评估部分及完全转化的乳腺上皮细胞肿瘤发生潜能的工具，这些方法可轻松应用于大多数从事细胞转化模型研究的实验室。

<table><tbody><tr><td>1 ml 血清学移液管</td><td>Labclinics</td><td>PLC91001</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3451</td><td>长期储存 MTT 时，建议使用避光离心管</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;无滤芯移液器吸头</td><td>Biologix</td><td>20-0010</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 玻璃瓶</td><td></td><td></td><td>带盖，可高压灭菌</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;带滤芯的移液器吸头</td><td>Labclinics</td><td>LAB1000ULFNL</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;无滤芯移液器吸头</td><td>Biologix</td><td>20-1000</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 血清学移液管</td><td>Labclinics</td><td>PLC91002</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;带滤芯的移液器吸头</td><td>Labclinics</td><td>FTR200-96</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 血清移液管</td><td>Labclinics</td><td>PLC91005</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>525-0304</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>PanReac AppliChem</td><td>211007</td><td>用于免疫荧光标记前的三维结构固定</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>用于锚定实验</td></tr><tr><td>抗Claudin 4抗体</td><td>Abcam</td><td>15104，RRID:AB_301650</td><td>工作浓度 1:100，宿主：兔</td></tr><tr><td>抗细胞角蛋白14 [RCK107] 抗体</td><td>Abcam</td><td>9220，RRID:AB_307087</td><td>工作浓度 1:100，宿主：小鼠</td></tr><tr><td>抗小鼠花青素Cy3抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>115-165-146，RRID:AB_2338690</td><td>工作浓度 1:500，宿主：山羊</td></tr><tr><td>抗兔 Alexa Fluor 488 抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-11034，RRID:AB_2576217</td><td>工作浓度 1:500，宿主：山羊</td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVoxxel 工具箱</td><td></td><td>RRID:SCR_015825</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养24孔板</td><td>Labclinics</td><td>PLC30024</td><td>用于 Matrigel 中的三维培养。平底</td></tr><tr><td>细胞培养6孔板</td><td>Labclinics</td><td>PLC30006</td><td>用于锚定实验</td></tr><tr><td>细胞培养箱（37 &amp;ordm;C 和 5% CO2）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>Fisherbrand</td><td>11587522</td><td>网孔尺寸：40 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>CellSense 软件</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>用于图像采集</td></tr><tr><td>离心</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>霍乱弧菌霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>用于补充细胞培养基</td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Herasafe</td><td>HAEREUS HS12</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Witeg Labortechnik GmbH</td><td>4600122</td><td>22 × 22 mm，厚度 0.13 - 0.17 mm</td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>2-(4-脒基苯基)-1H-吲哚-6-脒</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td>用于灭活胰蛋白酶活性</td></tr><tr><td>Fiji 软件（ImageJ）</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>RRID:SCR_002285</td><td>免费下载，无需许可证</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>11844782</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Biowest</td><td>S2000</td><td>用于三维结构的免疫荧光染色</td></tr><tr><td>耐热手套</td><td></td><td></td><td>用于高压灭菌后琼脂的操作</td></tr><tr><td>加热浴（37 &amp;ordm;C)</td><td></td><td></td><td>用于细胞传代前对溶液进行温度平衡</td></tr><tr><td>加热浴（42 &amp;ordm;C)</td><td></td><td></td><td>用于保持琼脂的温度</td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td></td><td>用于 Matrigel 脱水</td></tr><tr><td>湿盒</td><td></td><td></td><td>用于免疫荧光实验中抗体的孵育</td></tr><tr><td>冰</td><td></td><td></td><td>用于 Matrigel 操作过程中</td></tr><tr><td>冰盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel基质</td><td>Becton Dickinson</td><td>354234</td><td>-20℃保存 &amp;ordm;C，使用时保持低温。称为基底膜基质</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131091</td><td>用于免疫荧光标记前的三维结构固定</td></tr><tr><td>微量移液器</td><td></td><td></td><td>p1000、p200 和 p10</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>微软</td><td>RRID:SCR_016137</td><td>用于计算群体倍增时间并获得生长速率方程</td></tr><tr><td>MilliQ 水</td><td></td><td></td><td>被称为超纯水</td></tr><tr><td>指甲油</td><td></td><td></td><td>用于封片后密封样本</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>贝米斯</td><td>PM-999</td><td>用于孵育期间覆盖抗体溶液</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4（不含钙） &amp;和镁）</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>无菌。用于细胞传代培养</td></tr><tr><td>PBS片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>用超纯水稀释。无需无菌。用于免疫荧光</td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primaria T25 培养瓶</td><td>康宁</td><td>353808</td><td>用于BPEC培养</td></tr><tr><td>Scepter 自动细胞计数器</td><td>Millipore</td><td>PHCC20060</td><td>或者，使用血细胞计数板</td></tr><tr><td>剪刀</td><td></td><td></td><td>用于切割移液器吸头和封口膜</td></tr><tr><td>0.22 微米无菌滤器 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>用于过滤 MTT 溶液</td></tr><tr><td>噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td>-20℃保存 &amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>用于三维结构的免疫荧光染色</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 10倍浓缩液</td><td>Biowest</td><td>X0930</td><td>用 PBS 稀释，得到 3X 溶液</td></tr><tr><td>Vectashield 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>WIT-P-NC 培养基</td><td>Stemgent</td><td>00-0051</td><td>用于原代BPEC培养</td></tr><tr><td>WIT-T 培养基</td><td>Stemgent</td><td>00-0047</td><td>用于转化的BPEC培养</td></tr></tbody></table>

人乳腺上皮细胞中癌基因转化的体外评估

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

肿瘤发生是一个多步骤的过程，在此过程中，细胞获得一系列能力&#160;，使其能够在不利条件下持续生长、存活并扩散。不同的实验方法旨在识别和量化癌细胞的这些特征；然而，这些方法通常仅关注细胞转化的某一特定方面，实际上需要多种检测手段才能对细胞转化进行准确表征。本研究的目的是为研究人员提供一套工具，以更全面的视角在体外评估细胞转化，从而得出可靠的结论。
持续的增殖信号激活是肿瘤组织的主要特征，可通过计算随时间推移所达到的群体倍增次数，在体外条件下轻松监测。此外，细胞在三维培养中的生长可使其与周围细胞相互作用，更接近体内真实情况。这使得研究人员能够评估细胞聚集行为，并结合特异性细胞标志物的免疫荧光标记，获取有关肿瘤转化另一重要特征的信息：正常组织结构的丧失。转化细胞的另一个显著特征是其无需依附于其他细胞或细胞外基质即可生长的能力，该特性可通过锚定依赖性实验进行评估。
本文提供了评估细胞生长速率、在三维培养中对细胞谱系标志物进行免疫荧光标记以及在软琼脂中检测细胞锚定非依赖性生长的详细实验步骤。这些方法针对乳腺原代上皮细胞（BPEC）进行了优化，因其在乳腺癌研究中的重要性；但经过适当调整后，也可应用于其他类型的细胞。

选择在BPECs中引入三种遗传元件的细胞转化实验模型，以产生具有代表性的肿瘤发生转化结果6,7（图3）。非转化的BPECs（N）来源于无疾病的乳腺组织，其获取方法由Ince及其同事所述6，并按照本文所述方案进行培养。在克服STASIS（即应激或异常信号诱导的衰老，这是体外培养乳腺上皮细胞时通常观察到的现象，一般在细胞培养建立后约4周被克服）后，细胞依次转导慢病毒颗粒pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP和pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP，获得部分转化细胞（双次转导；D）。病毒Ttag的表达可抑制p53和视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma）功能，而外源性表达hTERT基因可补偿增殖依赖性的端粒长度缩短。经流式细胞分选进行荧光筛选后，细胞...

本方案提供了用于评估人乳腺细胞转化的体外实验工具。文中详细描述了检测细胞增殖速率、非贴壁依赖性生长能力，以及在含有基底膜基质的三维培养中细胞谱系分布的实验步骤。

肿瘤发生是一个多步骤过程，在此过程中细胞获得多种能力，使其能在不利环境中持续生长、存活并扩散……

该方法通过整合多种指标来评估任何细胞模型的转化程度。该技术为研究人员提供了一套耗时较长但操作简便的工具，用于体外评估细胞转化，从而使该方法可在大多数实验室中应用。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Teresa Anglada 和显微镜技术专家 Joan Repulles 进行示范。当乳腺原代上皮细胞培养至90%融合度时，将培养瓶中的上清液转移至含有2毫升胎牛血清的15毫升离心管中，并用PBS洗涤细胞。随后在37°C条件下，用1毫升胰蛋白酶处理细胞5分钟。当细胞脱落后，用预留的培养基终止胰蛋白酶作用，并通过离心收集细胞。轻弹离心管使沉淀重悬，加入一至二毫升新鲜培养基进行计数。确定细胞浓度后，取300,000个细胞加入新离心管中，并用额外的新鲜培养基补足终体积至五毫升。将细胞接种至新的T25培养瓶中，并将细胞放回细胞培养箱。然后使用公式计算累积的群体倍增次数。为评估细胞的增殖速率，绘制特定时间间隔内的累积群体倍增次数曲线。斜率增加表明细胞增殖速率加快。进行三维细胞培养时，用冷的无菌 PBS 冲洗表面积为 1.9 平方厘米的孔板孔，并在每个孔底部加入 100 µL 基底膜基质进行包被。然后将孔板放入细胞培养孵育箱中约 20 分钟，使基质凝固。在此期间，按照刚刚演示的方法收获乳腺细胞，并将细胞稀释至每毫升培养基含 400,000 个细胞的浓度。将细胞与添加了 8% 基底膜基质的新鲜培养基按 1:1 比例混合，每孔加入 500 微升细胞悬液至已固化的基质中。将细胞在 37 摄氏度孵育数分钟，然后每孔加入 500 微升添加了 4% 基底膜基质的培养基。将细胞放入细胞培养孵育箱中培养14天。接种的细胞会聚集成团并增殖，形成类似腺泡的结构。对于三维培养的乳腺细胞中的免疫荧光蛋白检测，使用截断的P200移液枪头从每个孔中取出基底膜基质，并将每个孔中约50微升的解离基质涂抹到各自的玻片上。当样品完全干燥后，在负20摄氏度条件下，用甲醇-丙酮1:1溶液固定细胞30分钟。固定后，在室温下用封闭液封闭样品2小时。孵育结束后，加入30微升目标一抗工作液，并用实验室封口膜覆盖载玻片，在4摄氏度的湿盒中过夜孵育。第二天早晨，用 PBS 每次清洗载玻片一小时，共清洗三次，并按照前述方法用相应的二抗溶液标记样品。孵育结束后，用 PBS 每次清洗两小时，共清洗两次，然后用含抗荧光淬灭封片剂中稀释的 DAPI 复染，再为每张载玻片加盖盖玻片。随后在共聚焦显微镜下分析每个腺泡的荧光信号分布。为了进行非贴壁依赖性实验，首先在六孔板相应数量的孔底部各加入1.5毫升含0.6%琼脂的培养基溶液，并在室温下静置使其凝固。接着，按示例制备浓度为每毫升5 × 10⁴个细胞的细胞悬液，并通过40微米细胞筛网过滤至无菌的50毫升离心管中。将离心管倾斜45度角，沿管壁缓慢加入等体积的含0.6%琼脂的培养基溶液。充分混匀后，将一毫升细胞琼脂悬浮液加入预先制备的六孔板的每个孔中。使用倒置显微镜确认细胞已在琼脂中均匀分散。待琼脂完全凝固后，小心向每孔加入一毫升新鲜培养基，避免扰动琼脂层，随后将细胞培养三周，每周更换培养基两次。菌落形成阶段结束后，将培养基更换为每孔1毫升含1毫克/毫升MTT的溶液，在细胞培养箱中孵育24小时。次日，从每孔中移除MTT溶液，并在倒置显微镜下对每孔进行成像。待所有图像采集完成后，在ImageJ中打开图像，依次点击图像、调整、阈值，然后应用，通过对原始图像进行阈值处理获得二值化掩膜。当获得边界清晰的克隆后，选择插件和BioVoxxel，启动扩展粒子分析器以识别MTT阳性的克隆。在特定时间段内，部分转化和完全转化的细胞相比未转化细胞可实现更多次的群体倍增，表明细胞分裂速率随着转化过程而增加。在为期两周的三维细胞培养期间，细胞发生聚集并增殖，导致腺泡尺寸增大。通过共聚焦显微镜结合蛋白质免疫荧光检测与三维信号定位，可准确评估每个腺泡的正常极性。非转化乳腺细胞形成的腺泡均具有正常的结构组织，而部分转化和完全转化细胞形成的腺泡则表现出极性丧失。在琼脂包埋培养三周后，具有锚定非依赖性生长能力的细胞会形成由多个细胞组成的克隆集落。只有代谢活跃的细胞才能裂解四唑盐 MTT 环，在培养 24 小时后生成紫色的 MTT 甲臜结晶。通过自动图像分析测量克隆直径，可筛选出增殖能力较低的克隆或单个细胞。与部分和完全转化的细胞相比，未转化细胞形成的克隆数量可忽略不计。菌落大小也可用于区分不同转化程度的细胞。这些检测方法可用于在接种前筛选细胞系，只有在体外检测呈阳性的细胞系才应接种至小鼠体内。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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本文描述了一种处理人类乳腺手术废弃组织的方法。经过处理的组织以类器官形式存在，可无限期冷冻保存，也可用于长期培养。该方法可用于对正常人类上皮细胞生物学特性以及外源性干扰因素的影响进行实验研究。...

人乳房缩小成形术和乳房切除术组织的细胞培养处理

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

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焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

利用完整的组织类器官进行原代细胞培养，提供了一种模拟多细胞体内微环境的模型系统。我们建立了一种无血清的原代乳腺上皮组织培养模型，该模型可在不进行酶解组织解离的情况下长期维持混合细胞谱系，并表现出分化形态。乳腺类器官的存活时间可超过&gt;6个月。...

非侵袭性乳腺病变的非酶解、无血清组织培养以自发生成乳腺球

悬浮乳腺球实验可用于研究在悬浮条件下存活并在植入小鼠后表现出增强致瘤能力的具有干细胞特性的乳腺癌细胞亚群。本方案提供了一种便捷的方法 体外 球体形成能力的检测，作为替代指标 体内...

人乳腺癌组织和细胞系的乳腺球形成实验

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通过细胞外囊泡/外泌体在乳腺基底上皮细胞与乳腺腔上皮细胞之间转移乳腺腺体形成能力

体外细胞侵袭实验通过使用含有蛋白质基质的细胞培养小室，定量检测细胞的侵袭和迁移能力，以评估癌症转移的潜能。细胞在趋化因子的诱导下，需穿过蛋白质基质和多孔膜，随后通过光学显微镜进行定量分析。...

利用小鼠乳腺肿瘤细胞进行体外侵袭实验以评估癌细胞行为

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。...

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

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体内 通过乳腺导管内注射将基因递送至小鼠乳腺上皮细胞

本研究报道了一种更简便、省时且经济的方案，可从少量乳腺组织中高效分离和培养原代人乳腺上皮细胞（HMECs）。该方案适用于快速制备原代HMECs，可用于实验室和临床应用。...

原代人乳腺上皮细胞的分离与培养

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人乳腺上皮细胞中癌基因转化的体外评估

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