使用四维（x, y, z 和 λ）高光谱FRET成像与分析技术测量活细胞中三维cAMP分布
2020年10月27日
由于基于 Förster 共振能量转移（FRET）的传感器本身信噪比（SNR）较低，cAMP 信号的测量一直具有挑战性，尤其是在三维空间中。本文介绍了一种高光谱 FRET 成像与分析方法，可实现三维空间内 cAMP 分布的测量。
该方案具有重要意义，因为它提供了一种在单个细胞的三维空间中测量和可视化FRET或环磷酸腺苷（cyclic AMP）信号的方法。环磷酸腺苷的分布可能不仅发生在侧向，也可能发生在轴向，因此以三维方式获取FRET环磷酸腺苷图像数据以采样这些分布至关重要。成像当天，将Tyrodes缓冲液在水浴中预热至37摄氏度，并将载有转染目标细胞的盖玻片安装到细胞腔室中。
使用安装垫圈密封腔室顶部，以防止泄漏，并用精细擦拭纸清除盖玻片底部多余的培养基或贴壁细胞。向细胞腔室中加入 800 µL 工作缓冲液和 4 µL 5 mM 细胞核染料，轻轻摇动腔室 5 到 10 秒。然后用铝箔包裹细胞腔室，在室温下孵育 10 分钟。
为了成像细胞，选择配备光谱检测器的共聚焦显微镜上的 60X 水浸物镜，并在物镜上加一滴水。将加样后的细胞腔室置于显微镜载物台上，调节滤光片旋钮以选择合适的滤光片组。选择荧光宽场模式，通过目镜选择一个含有表达 FRET 环磷酸腺苷传感器细胞的视野。
打开成像软件，选择共聚焦模式，并解锁激光联锁按钮。打开A1设置菜单。勾选对应405和561纳米激光线的选项，并将这些光谱检测设置为SD，分辨率为10，通道数为32。
选择起始和结束波长值以设定波长范围。打开 A1 设置菜单，选择二进制跳过图标。选中数字 15 的选项框，然后点击确定。将 405 纳米激光器的激光强度设置为百分之八，将 561 纳米激光器的激光强度设置为百分之二。
将检测器增益设为149，针孔半径设为2.4艾里斑单位。扫描速度设为每秒25个光谱帧，选择单向扫描模式。扫描次数设为4，扫描尺寸设为1024×1024。
为定义z轴层扫描采集参数，请点击“View”（视图）、“Acquisition Control”（采集控制）和“ND Acquisition”（多维采集），在弹出窗口中输入文件保存路径和文件名，以保存ND文件。勾选z-series（z轴序列）选项框，在A1 Plus设置窗口中点击“Live”（实时），打开实时预览窗口。在预览窗口中观察的同时，调节聚焦旋钮以对细胞进行聚焦。
调节显微镜上的调焦旋钮以选中细胞的顶部，然后在 ND 采集窗口中点击“顶部”，将当前位置设为顶部。调节显微镜上的调焦旋钮以选中细胞的底部，然后点击“底部”将当前位置设为底部。输入1微米作为步长。
选择“Top Bottom”作为z扫描方向，然后单击运行以获取z层扫描图像。当z层扫描图像采集完成后，使用移液器轻轻将目标试剂加入腔室中，注意不要扰动细胞。10分钟后，更改文件名并采集第二组z层扫描图像。
成像后，创建与光谱z轴层叠图像同名的新文件夹，并打开感兴趣的光谱图像文件。点击文件，导入/导出，导出ND文档。在弹出窗口中，选择新创建的文件夹，文件类型选择TIFF，每个通道选择单色图像，并保留位深度。
单击“导出”以将各个文件导出到文件夹，并打开线性光谱解混软件。打开 Linear Unmixing.m 文件，然后单击“运行”。
浏览并选择包含导出的 TIFF 文件序列的文件夹，然后单击“确定”以打开波长和 z 层切片窗口。从文件夹中复制第一个文件的文件名（不含 z 层切片和通道编号），将其粘贴到“输入图像名称”框的第一步中，在“输入波长带数量”框中输入通道数，在“输入 Z 层切片数量”框中输入 z 层切片数，然后单击“确定”。随后在弹出的窗口中，浏览并选择 Wavelength.mat 文件，然后单击“打开”。
在新弹出的窗口中浏览并选择 Library.mat 文件，然后再次单击“打开”以启动切片解混。为计算 FRET 效率，请打开 multiFRRCF。
在编程脚本中输入要分析的实验次数，并在“要重新切片的文件夹数量”框中输入数值，然后点击“确定”。浏览并选择未混合的文件夹，再次点击“确定”。在新弹出的窗口中，将缩放因子设置为12.4，阈值设置为56，X、Y和Z频率分别设置为5、5和1，平滑算法选择高斯（Gaussian）。
然后点击“运行”以执行FRET测量和重新切片。为将FRET效率映射至环磷酸腺苷（cAMP）水平，请打开Mapping_FRET.Efficiency_to_cAMP_concentration.m文件并点击“运行”。
导航并选择第一张灰度FRET图像，然后点击“确定”。接着打开cAMP的FRET图像，以检查cAMP信号在三维空间中的分布情况。在这些图像中，可观察到使用共聚焦显微镜在基础状态以及佛司可林处理10分钟后获取的伪彩原始高光谱图像数据的三维视图。在此分析中，受体荧光团被完全光漂白，从而获得具有1:1化学计量比的供体与受体的光谱特征。
使用核染料标记的非转染细胞以获得该染料荧光团的纯光谱。结合供体、受体和核染料荧光团的光谱，可构建一个包含三个组分的光谱库。此处可观察到三种背景光谱特征的来源。
尽管这些信号在样品内的分布不均匀，无法简单地通过相减去除，但将这些信号的光谱特征加入光谱库中，并利用线性解混方法分离信号，可提供一种在计算供体与受体之间的FRET效率之前，去除这些干扰信号的方法。随后，可使用包含六个组分的光谱库对轴向图像中的每一层进行线性光谱解混。在此，可观察不同XY平面切片中FRET效率与环磷酸腺苷（cyclic AMP）水平的变化，从而比较基础状态与佛司可林处理10分钟后的状态。
该技术还可用于在细胞和组织中三维量化其他报告分子的FRET效率。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本研究解决了利用基于 Förster 偿能共振转移（FRET）的传感器在三维空间中测量 cAMP 信号所面临的挑战。提出了一种新型的高光谱 FRET 成像方法，可实现对单个细胞内 cAMP 分布的可视化与定量检测。
关键研究组成部分
研究领域
- 环磷酸腺苷信号通路
- FRET成像技术
- 三维细胞动态
背景
- 传统FRET传感器中的低信噪比（SNR）
- 三维cAMP测量的重要性
- 在细胞信号通路中的应用
使用的方法
- 用于FRET分析的高光谱成像
- 用于成像的共聚焦显微镜
- 线性光谱解混技术
主要结果
- 成功实现cAMP在三维空间中的分布测量
- 可视化细胞对佛司可林处理的响应
- 展示了线性解混技术在信号分离中的有效性
结论
- 该方法为高分辨率研究cAMP动态提供了可靠的框架。
- 它有助于加深对细胞生物学中信号通路的理解。
常见问题
行业重要性概述
第二信使动态的精确空间定位对于降低G蛋白偶联受体和腺苷酸环化酶通路中靶点验证的风险至关重要。这种高光谱FRET方法可实现cAMP信号的三维解析，减少了亚细胞区室化研究中的机制模糊性。该方法通过将空间cAMP模式与功能性细胞反应相关联，提高了早期发现阶段的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过解析三维空间中 cAMP 的区室化，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：通过可视化活细胞中通路特异性的信号模式，提供功能性靶点验证。
- 预测价值：通过关联药理学干扰后空间 cAMP 分布与表型结果，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成适用于高内涵筛选模式的定量、空间分辨的FRET效率读数。
- 可重复性：采用线性光谱解混技术，以最小化自发荧光和光谱串扰，增强重复样本间信号的可靠性。
- 可扩展性：兼容多孔板适配，可用于筛选化合物对细胞内cAMP动态的影响。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：适用于肺微血管内皮细胞，支持血管信号通路的转化研究。
- 机制性风险排除：明确观察到的cAMP变化是源于真实通路调控，还是由光谱重叠引起的成像伪影。
- 临床前连续性：可在与疾病相关的系统中，实现从发现到功能验证全过程的cAMP动态长期追踪。
流程与工作流整合
该方法通过提供空间分辨的第二信使活性定量读数，适用于从靶点假设验证到先导化合物优化的整个发现过程。
- 发现生物学：通过绘制cAMP在GPCR激动剂或腺苷酸环化酶调节剂作用下的动态变化图谱，支持假设验证。
- 筛选：提供即用型三维cAMP数据，减少光谱干扰带来的假阳性结果。
- 分析：输出FRET效率和cAMP浓度图谱，支持在不同处理条件和基因扰动之间进行比较。
- 转化研究：通过在原代内皮细胞中的应用及对疾病模型的适应性，连接临床前研究。
- 企业级复用：建立可重复使用的成像核心能力，用于研究多种第二信使系统中的空间信号传导。
运营与企业影响
- 科学价值：通过解析cAMP信号的轴向和侧向分布，减少其作用机制的模糊性。
- 操作价值：通过基于光谱库的解混和可重复的采集参数，标准化FRET测量。
- 战略价值：提供具有空间背景的靶点结合数据，从而优化“进行/终止”决策。
- 项目组合影响：根据化合物在亚细胞水平上的信号保真度，实现基于风险调整的化合物优先排序。
实施注意事项
- 需要具备高光谱成像、光谱解混以及FRET生物传感器验证方面的专业知识。
- 依赖于配备光谱探测器和32通道检测能力的共聚焦显微镜。
- 需要跨团队在光谱库构建和解混参数方面进行标准化。
- 应用于其他细胞类型时，可能需要优化标记密度和z轴扫描参数。
- 实际限制包括在长时间z轴扫描采集过程中存在的光漂白风险，以及光谱处理带来的计算负荷。
