Name: 腰椎不稳定的鼠标模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 了解通过手术切除棘突和韧带建立小鼠腰椎不稳定模型的方法。该模型使用C57BL/6小鼠，可高效诱导椎间盘退变，适用于脊柱退行性疾病机制研究和治疗策略开发。

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本工作由国家自然科学基金（81973607）和中国科学技术部重大新药创制专项（2019ZX09201004-003-032）资助。

所描述的研究符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求，并经上海中医药大学动物护理与使用委员会批准。所有手术操作均在深度麻醉下进行，动物在实验过程的任何阶段均未感受到疼痛。
1. 术前准备
<ol>
	<li>器械灭菌：手术前将手术器械放入高压灭菌器中进行蒸汽灭菌（121 °C，15 分钟）。将器械装入金属容器中，并保持无菌状态直至手术使用。</li>
	<li>手术平台设置：分配至少 60 cm × 60 cm 的台面区域用于手术操作。用 75% 酒精清洁台面，并覆盖一次性医用毛巾。在台面上部 1/3 区域放置无菌手术器械包、试剂和手术用品。下部 2/3 区域保持洁净，用于手术操作。&#160;在手术垫下方放置加热垫以提供保温支持。</li>
	<li>动物准备
	<ol>
		<li>将动物（C57BL/6J 小鼠，雄性，8 周龄）放入诱导室中。开启麻醉蒸发器，异氟烷浓度设为 4%，氧气流速为 4 L/min 进行诱导麻醉。动物完全麻醉后，通过鼻罩维持麻醉，术中异氟烷浓度为 1.5%，氧气流速为 0.4 L/min。术中持续监测动物呼吸情况。</li>
		<li>涂抹盐酸氯四环素眼膏，防止手术期间角膜干燥。</li>
		<li>使用小型动物剃毛器，剃除小鼠背部从下胸部至骶部顶端的手术区域毛发。用纸巾擦拭清除剃除的毛发。</li>
		<li>在剃毛区域涂抹脱毛膏，停留时间不超过 3 分钟。用纱布擦去脱毛膏，并用 2 mL 0.9% 无菌生理盐水冲洗。</li>
		<li>在小鼠腹部下方放置定制的圆柱形手术垫（图 2A），以抬高腰椎，便于手术操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 暴露腰椎第三至腰椎第五（L3–L5）棘突
<ol>
	<li>用食指触诊腰椎的皮下棘突，其位置相对更靠外侧，并与胸椎和骶椎进行比较，以确定腰椎区域。</li>
	<li>使用75%酒精清洗皮肤。用手术刀在腰部区域沿正中线做一长度为3–4 cm的切口，从胸中段延伸至髋部，以暴露筋膜。</li>
	<li>通过附着于棘突尖端的后侧筋膜形态来识别腰椎。具体而言，第三腰椎（L3）至第一骶椎（S1）的筋膜因其呈“V”形而与其他筋膜相区别。最后一个“V”形尖端连接第一骶椎（S1）筋膜，第一个“V”形尖端对应于L3棘突（图2B）。</li>
	<li>用手术刀沿L3至L5棘突两侧向外做后侧椎旁肌切口（图2C）。控制切口深度至关节突水平，以减少出血。</li>
	<li>使用两把眼科镊子分离肌肉层，暴露L3至L5的棘突及棘上韧带。</li>
</ol>
3. 切除L3–L5棘突及附着韧带
<ol>
	<li>使用Venus剪刀切断棘间韧带，分离单个棘突（图2D）。</li>
	<li>使用Venus剪刀将L3–L5棘突连同棘间韧带一并切除（图2E）。</li>
	<li>用无菌编织丝线（缝合线规格5.0）缝合皮肤切口，无需重新附着椎旁肌。</li>
	<li>在手术部位涂抹盐酸氯四环素眼膏。</li>
	<li>LSI手术后立即给予缓释布托啡诺（每克小鼠体重25 uL）以镇痛。</li>
	<li>将动物置于保温箱中，并在麻醉恢复期间进行监测。在将动物放回饲养笼前，监测其食物和水的摄入情况。</li>
	<li>术后前3天每天监测动物一次。动物应具有正常食欲，伤口愈合过程中无脓液、出血或肿胀迹象。可能出现轻微运动功能障碍。</li>
	<li>假手术组仅需将L3–L5椎骨的后侧椎旁肌剥离即可。</li>
</ol>

<ol><li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+disc+degeneration+progression+in+young+women+in+their+20%27s%3A+a+prospective+ten-year+follow+up%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Science%3A+Official+Journal+of+the+Japanese+Orthopaedic+Association%22%5BJournal%5D)">Lumbar disc degeneration progression in young women in their 20's: a prospective ten-year follow up.</a> Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 22 (4), 635-640 (2017).</li>
<li>Lee, Y. C., Zotti, M. G. T., Osti, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+management+of+lumbar+degenerative+disc+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Operative management of lumbar degenerative disc disease.</a> Asian Spine Journal. 10 (4), 801-819 (2016).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+experimental+intervertebral+disc+degeneration+induced+by+bleomycin+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Musculoskeletal+Disorders%22%5BJournal%5D)">In vivo experimental intervertebral disc degeneration induced by bleomycin in the rhesus monkey.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15, 340(2014).</li>
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<li>Liu, S., Cheng, Y., Tan, Y., Dong, J., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligustrazine+prevents+intervertebral+disc+degeneration+via+suppression+of+aberrant+tgf%CE%B2+activation+in+nucleus+pulposus+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Ligustrazine prevents intervertebral disc degeneration via suppression of aberrant tgfβ activation in nucleus pulposus cells.</a> BioMed Research International. 2019, 5601734(2019).</li>
<li>Boos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+age-related+changes+in+lumbar+intervertebral+discs%3A+2002+Volvo+Award+in+basic+science%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in basic science.</a> Spine. 27 (23), 2631-2644 (2002).</li>
<li>Miyamoto, S., Yonenobu, K., Ono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cervical+spondylosis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Experimental cervical spondylosis in the mouse.</a> Spine. 16, 10 Suppl 495-500 (1991).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们基于颈椎病小鼠模型建立了腰椎不稳小鼠模型，在该模型中，椎骨的后侧椎旁肌被剥离，同时切除棘突以及棘上和棘间韧带25。我们将类似的手术操作应用于腰椎，该区域的棘突更为显著。所建立的腰椎不稳小鼠模型在腰椎区域出现了类似的椎间盘退变（IDD）。
LSI模型的优点包括操作性强、无需特殊设备、可重复性好以及椎间盘退变（IDD）形成周期相对较短。
以下是一些关键要点，有助于提高手术操作的成功率，这些也是关键步骤。第一，尽可能彻底清除下背部区域的毛发，因为伤口中残留的任何剃除毛发都可能引发过敏反应。第二，建议使用圆柱形垫片或其他垫片抬高腰椎。第三，使用显微剪刀控制切口深度和出血情况；若术中发现血肿，应立即停止手术并处死小鼠，因为小鼠在术中或术后无法存活。第四，不建议重新附着椎旁肌，因为重新附着可能导致脊柱不稳定。第五，完全切除整个L3–L5棘突可减少个体模型之间的变异性。第六，避免损伤周围神经和血管，否则小鼠可能出现非典型的病理改变。如果模型未表现...

椎间盘退变（IDD）由多种因素引起，在老年人甚至年轻人中均较为常见1。对于因IDD导致腰痛和运动功能受损的患者，手术治疗通常仅在疾病晚期或严重情况下实施，且存在骨不连或感染等潜在风险2。理想的非手术治疗需要对IDD的发病机制有全面的理解。IDD动物模型是研究IDD机制及评估IDD治疗方法的重要工具。
由于灵长类动物、绵羊、山羊、狗和兔子等较大动物在解剖结构上与人类具有较高的相似性，并且椎间盘（IVD）尺寸较大而具有较强的操作性，因此常被选为椎间盘退变（IDD）模型3,4,5,6,7,8。然而，这些动物模型耗时较长且成本较高9。根据长宽比、髓核占椎间盘面积的比例以及标准化高度等几何测量指标，小鼠椎间盘在形态上并不能很好地模拟人类椎间盘10。尽管存在尺寸差异，小鼠腰椎椎间盘节段在力学性能方面与人类椎间盘相似，例如压缩刚度和扭转刚度11。此外，小鼠IDD模型具有成本低、IDD发展周期相对较短，以及可用于进一步机制研究的基因修饰动物和抗体种类更多等优势12,13,14,15。
实验诱导的椎间盘退变（IDD）模型因诱导方法和应用方式的不同而有所差异。例如，胶原酶诱导的细胞外基质（ECM）退变适用于ECM再生研究16。基因修饰表型模型适用于研究基因在IDD过程中的功能以及基因治疗相关研究17。纤维环切开术和烟雾暴露模型则可模拟创伤性和非炎症性诱导的IDD12,18。
脊柱不稳（SI）会导致脊柱处于非最佳平衡状态。它可能是由于腰椎运动节段异常活动所致，而异常活动的原因是周围支持组织（如韧带和肌肉）薄弱。脊柱融合术后也常出现脊柱不稳19。脊柱不稳被认为是椎间盘退变（IDD）的主要原因。因此，我们旨在建立一种模拟人类椎间盘退变过程的脊柱不稳小鼠模型（重点在腰椎）20,21。
在本实验方案中，我们介绍了通过切除腰椎第三（L3）至腰椎第五（L5）棘突以及相应的棘上韧带和棘间韧带，建立腰椎脊柱不稳（LSI）小鼠模型的操作步骤（图1A,B）。该动物模型术后1周即可出现椎间盘退变（IDD）表现，表现为终板（EPs）的肥厚和多孔性改变。术后2周起至16周，椎间盘（IVD）体积开始减小，同时IVD评分升高，提示IDD程度加重。我们认为，这一详细且可视化的操作流程将有助于研究人员在各自实验室中成功建立LSI小鼠模型，并根据需要应用于椎间盘退变相关研究。

<table><tbody><tr><td>盐酸金霉素眼膏</td><td>上海信谊药厂有限公司</td><td>H31021931</td><td>预防眼部干燥，预防伤口感染</td></tr><tr><td>C57BL/6J 雄性小鼠</td><td>天江药业有限公司（江苏，中国）</td><td>SCXK2018-0004</td><td>动物模型</td></tr><tr><td>一次性医用垫巾</td><td>河南华昱医疗器械有限公司</td><td>20160090</td><td>手术操作平台</td></tr><tr><td>吸入麻醉设备</td><td>MIDMARK</td><td>Matrx 3000</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>深圳瑞沃德生命科技有限公司</td><td>1903715</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因</td><td>山东华鲁制药有限公司</td><td>H37022839</td><td>镇痛</td></tr><tr><td>医用缝合针</td><td>上海浦东金环医疗用品有限公司</td><td>20S0401J</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>眼科镊</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>JD1050</td><td>夹持皮肤</td></tr><tr><td>眼科剪刀（10 cm）</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂</td><td>Y00030</td><td>皮肤切口</td></tr><tr><td>编织丝线</td><td>上海浦东金环医疗用品有限公司</td><td>11V0820</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>小型动物剃毛器</td><td>上海飞科电器有限公司</td><td>FC5910</td><td>脱毛</td></tr><tr><td>无菌手术刀片（12#）</td><td>上海浦东金环医疗用品有限公司</td><td>35T0707</td><td>肌肉切口</td></tr><tr><td>薇婷脱毛膏</td><td>利洁时家化（印度）有限公司</td><td>NA</td><td>脱毛</td></tr><tr><td>维纳斯剪刀</td><td>明仁医疗设备</td><td>长度：12.5 cm</td><td>剪切肌肉和棘突</td></tr></tbody></table>

腰椎不稳的小鼠模型

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

椎间盘退变（IDD）是一种导致腰痛的常见病理改变。为了深入理解其病理过程并评估新药疗效，亟需建立合适的动物模型。本文介绍了一种通过手术诱导腰椎不稳（LSI）的小鼠模型，该模型在术后1周即开始出现椎间盘退变。具体操作步骤如下：在麻醉状态下，对小鼠进行腰部皮肤切口，暴露L3–L5棘突，分离椎旁肌肉，切除棘突及相关韧带，最后缝合皮肤。观察部位选定为L4–L5椎间盘。该LSI模型的退变过程表现为早期终板出现多孔性和肥厚性改变，中期椎间盘体积减小、髓核缩小，晚期则出现腰椎椎体（L5）骨量丢失。LSI小鼠模型具有操作性强、无需特殊设备、可重复性高、成本低廉以及IDD发展周期相对较短等优点。然而，LSI手术本身仍属于创伤性操作，术后第一周内可引发炎症反应。因此，该动物模型适用于腰椎椎间盘退变的研究。

LSI 小鼠模型被应用于椎间盘退变（IDD）机制、IDD 治疗、终板（EP）退变（如硬化）以及终板感觉神经支配的研究20,21,22,23。LSI 小鼠会出现 IDD 和终板退行性改变，其特征表现为椎间盘体积和高度减小、终板体积增大，以及椎间盘和终板评分升高。
如先前所述20,21，采用高分辨率显微计算机断层扫描（μCT）对解剖并固定的下胸段及腰椎脊柱进行检测。包含下胸段及肋骨的部分用于识别L3–L5椎体（图3A）。L3–L5脊柱的侧位X射线图像显示假手术组（Sham...

我们通过切除L3–L5棘突以及棘上和棘间韧带，并剥离椎旁肌，建立了一种腰椎间盘退变的小鼠模型。

椎间盘退变（IDD）是一种导致腰痛的常见病理改变。为了深入理解……

这是一种用于建立小鼠腰椎间盘退变模型的手术方法，为相关研究提供了替代方案。该稳定的腰椎融合（LSI）模型无需特殊设备，具有良好的可重复性，且可在相对较短的时间内诱导椎间盘退变。控制切口深度、止血以及对每个棘突间进行切除是成功实施本实验植入手术的两个关键步骤。确认动物对足底反射无反应后，将一只8周龄、雄性C57 black six小鼠仰卧位放置于手术垫上，并在其眼睛上涂抹眼膏。使用小型动物剃毛器剃除从下胸部至骶骨顶部区域的毛发，并用纸巾擦拭清除剃除的毛发。使用纱布将脱毛膏涂抹于剃毛区域，最多三分钟后去除脱毛膏，并用2毫升0.9%无菌生理盐水冲洗暴露的皮肤。然后将定制的圆柱形外科垫置于腹部下方，以抬高腰椎。为暴露L3和L5椎骨，用食指触摸腰椎皮下棘突，并通过触诊比较其与胸椎及骶椎棘突的差异，从而确定腰椎区域。用75%酒精冲洗皮肤，借助解剖显微镜，使用手术刀在腰部区域沿中线从胸中部至髋部做一条3至4厘米长的皮肤切口。通过观察后方筋膜插入处呈V形的棘突尖端来辨认腰椎，然后使用手术刀沿棘突两侧L3至L5节段做浅表的后侧椎旁肌切口。接着使用两把眼科镊子分离肌肉层，暴露L3至L5的棘突及棘上韧带。使用静脉剪分离各个棘突，切断棘间韧带，并切除L3至L5的棘突及棘间韧带。然后使用无菌5号编织丝线缝合皮肤切口，无需重新附着椎旁肌，并在手术部位涂抹盐酸氯四环素软膏。三维组织形态计量学分析可用于椎间盘的测量，而三维结构分析则可对总组织体积进行定量。术后一周椎间盘体积显著增加，随后在术后2至16周逐渐减小，这与同一时间段内测得的椎间盘高度降低趋势一致。在LSI小鼠中还观察到颅侧终板内空腔增加，表现为骨小梁分离值大于或等于0.089的百分比升高，以及术后终板体积显著增大。模型终板表现出类似的表型，表明LSI可导致终板肥厚及空腔数量增加。术后L5椎体体积略有增加，在术后16周观察到统计学差异。术后16周骨组织体积与总组织体积的比值也显著降低，表明腰椎不稳定模型（LSI）在后期引起椎体骨量丢失。此外，在LSI动物模型中，髓核细胞内空泡减少的现象加快，同时在LSI终板中观察到破骨细胞数量增加。可以通过连接不同数量的椎骨来修改该模型，例如仅连接第五腰椎，或从第一腰椎到第五腰椎。

a-mouse-model-of-lumbar-spine-instability

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

腰椎不稳定的鼠标模型

采用连续低剂量X射线扫描，对成年小鼠脊髓损伤后股骨和胫骨的骨量流失进行了纵向检测。在整个研究期间均可检测到胫骨骨量流失，而股骨的骨量流失直至损伤后40天才被检测到。...

脊髓损伤后利用新型方法对小鼠后肢骨丢失进行纵向评估 体内方法学

在本视频中，我们描述了一种通过切除腰椎L3至L5棘突以及棘上韧带和棘间韧带，在小鼠模型中诱导腰椎不稳的手术方法。...

小鼠腰椎不稳模型的外科诱导：小鼠腰椎棘突及其连接韧带切除手术操作

来源：Kumar, S.，等. 脊髓损伤后压疮的小鼠模型。J. Vis. Exp.

构建脊髓损伤小鼠模型

一种可重复的新型技术 体内 描述了一种小鼠颈段脊髓切割损伤模型。该技术基于通过固定颈椎关节突实现脊柱稳定，并使用振荡刀片对脊髓进行切割，切割精度为±0.01...

小鼠可控性宫颈撕裂损伤模型

本文介绍了一种在新生小鼠中建立可重复性脊髓压迫损伤（SCI）的方法。该模型为研究自发性功能恢复背后的适应性可塑性机制提供了一个有利的平台。...

一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

我们介绍一种基于组织位移的挫伤性脊髓损伤模型，可在成年小鼠中产生一致的挫伤性脊髓损伤。...

一种基于组织位移的挫伤性小鼠脊髓损伤模型

该方案描述了一种新型的体内小鼠脊柱植入物感染模型，其中不锈钢克氏针植入物被生物发光的Staphylococcus aureus...

体内小鼠脊柱植入物感染模型

踝-距下复合关节（ASCJ）是足部的核心结构，在日常活动中对平衡控制起着关键作用。运动损伤常导致该关节不稳定。本文介绍一种通过韧带横断诱导ASCJ不稳定的...

踝-距下复合关节不稳的小鼠模型

微创技术与简易实验装置通过减少对实验动物的手术损伤并维持解剖形态，提高了脊髓损伤模型的可重复性。该方法具有重要价值，因为可靠的结果和可重复的操作流程有助于深入研究疾病修复的机制。...

基于微创技术建立小鼠挫伤性脊髓损伤模型

本方案中介绍了两种使小鼠腰椎单轴压缩测试更易实现的方法。首先，描述了将三点弯曲试验机改装为压缩试验机的方法。其次，采用了一种使用骨水泥制备加载面的包埋方法，并将其适用于小鼠腰椎。...

小鼠腰椎椎体加载面嵌入式单轴压缩测试

本文展示了一种用于小鼠的新型自动化脊髓损伤挫伤装置，该装置能够精确地制备不同程度的脊髓损伤挫伤模型。...

用于小鼠脊髓挫伤模型的自动化撞击器

了解通过手术切除棘突和韧带建立小鼠腰椎不稳定模型的方法。该模型使用C57BL/6小鼠，可高效诱导椎间盘退变，适用于脊柱退行性疾病机制研究和治疗策略开发。

腰椎不稳的小鼠模型

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