原子力显微镜结合红外光谱作为探测单个细菌化学性质的工具
2020年9月15日
原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）为细菌研究提供了强大的平台，能够实现纳米级分辨率。该技术可在单细胞水平上对细菌进行亚细胞结构变化的成像（例如细胞分裂过程中）以及化学成分的比较研究（例如由药物耐药性引起的差异）。
该方法可实现对细菌的纳米级研究，为我们深入了解抗菌药物耐药性中的化学变化提供了详细信息。因此，该方法有助于推动我们对抗菌药物耐药性（AMR）的理解以及药物研发进程。
细菌的纳米级尺寸极大地限制了可用于研究其化学特性的工具。原子力显微镜-红外光谱联用技术（AFM-IR）使我们能够以非破坏性、不受观察者主观影响的方式，甚至在亚细胞水平上实现这一目标。该方法通过揭示抗菌耐药性的机制，有助于识别和验证新型抗菌药物的分子作用靶点。
除了细菌之外，原子力显微红外光谱（AFM-IR）还可用于检测多种细胞、组织甚至病毒。为进行AFM-IR成像而制备样品时，首先在适当的培养基和培养条件下培养目标细菌，然后使用无菌接种环从菌落表面小心挑取细菌并转移至玻璃离心管中。向管中加入1毫升超纯水，涡旋震荡1至2分钟，直至管底不再可见收集的细菌沉淀。
通过将制备的溶液与麦氏标准进行目视比较，估测溶液的大致浊度。如果细菌悬液的浊度看起来非常低，则继续添加更多细菌并涡旋混匀，直至溶液的大致浊度与0.5和1麦氏标准相当。通过离心沉淀细菌，并用移液器小心吸除上清液。
将细菌细胞沉淀物用1毫升超纯水重悬，并通过涡旋振荡混合，然后再次离心沉淀细菌。按照上述方法最多再洗涤细菌三次后，吸除上清液，涡旋振荡沉淀至少两分钟，然后取5微升细胞滴加到实验基底上。若所需厚度为单层或单个细菌，滴加后应立即向基底加入20至100微升超纯水，并用移液器枪头轻轻混合溶液。
样品空气干燥后，使用双面胶带将基底固定在原子力显微镜（AFM）金属样品盘上。准备进行AFM-IR光谱分析时，开启软件和激光器后，按下“初始化”按钮，并确认激光快门处于打开位置。在此过程中，将弹出“载物台初始化”窗口。
初始化过程完成后，单击“初始化”和“确定”。如有可能，打开氮气流以用氮气吹扫仪器，并调节氮气吹扫量以达到稳定的湿度水平。小心地将样品放入样品室中，避免损坏探针，然后在软件中单击“加载”。按照向导步骤加载样品，在每一步中均需关注探针和样品的对位。
然后点击“Approach”以在不接触样品的情况下接近样品。在接触样品之前，选择“Tools”（工具）、“IR Background Calibration”（红外背景校准），然后选择“New”（新建）。在弹出窗口中，根据分析目的设置分辨率和光谱范围，并设置累加次数以及用于平均的背景数值。
选择“启用”。在弹出窗口中设置起始和结束参数，然后单击“接受并采集”。背景数据采集完成后，单击“保存”。
为使探针接触样品，点击“Engage”。系统将自动接近样品表面，直至检测到直接接触。点击“Scan”以采集初始的大范围、低空间分辨率原子力显微镜（AFM）图像，用于在将探针移至目标测量位置前观察表面形貌。
为了将红外激光对准样品吸收的波数，请在“波数”字段中输入样品吸收的波数，然后点击“开始红外”。在“振幅随频率变化图”中应至少观察到一个清晰的峰。“时间-偏转图”应显示周期性波形。点击“优化”以选择常规的红外细菌光谱，用于确定各谱带的位置，并利用该光谱在不同光谱区域的多个波数值下优化热点位置。
当所选波数的红外光斑已优化后，设定光谱分辨率、范围以及累加次数，然后点击“采集”以获取AFM-IR光谱。为获取特定波数下的强度分布图像，在记录单点AFM-IR光谱后，需记录所选样品区域的AFM图像，并选择用于AFM-IR成像的波数。确认激光的红外光斑已针对所选波数优化，并设置图像区域X和Y方向的数据点数。
在“常规”窗口中设置激光功率。在AFM扫描窗口中，设定扫描速率。然后勾选“红外成像启用”复选框，点击“扫描”以开始成像。
将同时采集所选波数下信号强度的原子力显微-红外光谱（AFM-IR）数据以及该区域的原子力显微镜（AFM）数据。本方案可用于获取细菌细胞在基底上多种分布形态，从单个细胞到单层及多层结构。该方案可用于监测活体细菌的动态变化。
例如，在金黄色葡萄球菌（S. aureus）细胞分裂过程中隔膜的形成阶段。与从细胞区域采集的AFM-IR谱图相比，隔膜的AFM-IR谱图在1,240和1,090厘米处的谱带相对强度更高，表明隔膜主要由细胞壁组分中的碳水化合物和磷酸二酯基团构成。该方案还可用于研究因耐药性发展而引起的化学成分差异。
如本代表性分析所示，万古霉素间歇性耐药金黄色葡萄球菌与万古霉素敏感金黄色葡萄球菌细胞之间未观察到形态学差异。然而，对AFM-IR光谱及其二阶导数的评估显示，与敏感菌株相比，耐药菌株中与细胞壁组分相关的碳水化合物和磷酸二酯基团的谱带相对强度明显增加。样品制备过程中需确保清洁，因此应从初始步骤起尽量减少培养基的干扰，并通过多次洗涤彻底去除残留。
由于AFM-IR是一种非破坏性技术，因此样品后续可使用其他技术（如染色或共聚焦离子光谱）进行研究，从而获得有关其化学性质的互补信息。
概述
原子力显微镜-红外光谱法（AFM-IR）可实现对细菌的纳米尺度研究，揭示与抗菌药物耐药性相关的化学变化。该方法能够在亚细胞水平进行无损分析，有助于深入理解药物耐药机制。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 生物物理学
背景
- 原子力显微红外光谱技术（AFM-IR）为研究细菌提供了强大的平台。
- 细菌的纳米级尺寸限制了可用的研究工具。
- 理解抗菌素耐药性（AMR）对药物开发至关重要。
- AFM-IR 可用于探测多种生物样品，包括细胞和组织。
研究目的
- 研究与抗菌耐药性（AMR）相关的细菌化学变化。
- 鉴定新型抗菌药物的分子靶点。
- 监测活体细菌的动态变化。
使用的方法
- 样品制备包括细菌培养和涡旋处理。
- 将样品沉积到基底后进行原子力显微红外成像。
- 仪器校准和背景数据采集是关键步骤。
- 数据采集包括原子力显微图像和红外光谱。
主要结果
- 原子力显微红外光谱法（AFM-IR）可区分耐药细菌的化学成分差异。
- 在细胞分裂过程中，隔膜区域观察到更强的吸收峰。
- 耐药菌株与敏感菌株之间未观察到形态学差异。
- AFM-IR光谱揭示了细菌细胞壁组分的重要信息。
结论
- 原子力显微红外光谱（AFM-IR）是研究细菌化学性质的有力工具。
- 该方法有助于深入理解抗菌耐药性（AMR）的作用机制。
- 它可促进新型抗菌策略的开发。
常见问题
行业高管相关性
原子力显微镜-红外光谱（AFM-IR）可实现对单个细菌的纳米级化学分析，满足了抗菌药物耐药性研究中对表型探测的关键需求。该方法能够在亚细胞分辨率下同时提供空间和光谱数据，有助于在早期抗生素发现过程中验证靶点并降低机制风险。这一能力增强了对分子靶点识别和耐药机制监测的预测可靠性，直接影响先导化合物的筛选和临床前决策。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过将化学成分变化与抗菌耐药表型相关联，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：在单细胞水平上提供非破坏性、不受观察者主观影响的化学图谱分析，用于功能靶点的验证。
- 科学价值：通过直接观察耐药菌株细胞壁组分的改变，支持预测结果的可信度。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过标准化洗涤程序去除培养基成分的干扰，制备可用于后续实验的经验证细菌体系。
- 操作价值：通过受控的样品沉积和基底制备，实现检测标准化与可重复性，确保AFM-IR数据采集的一致性。
- 科学价值：通过在特定波数下获取强度分布图像，实现化学变化的映射，从而支持对化合物的可靠评估。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过检测临床相关菌株（如金黄色葡萄球菌）在耐药性发展过程中产生的化学成分变化，保持与疾病的相关性。
- 操作价值：支持从发现到临床前验证的转化连续性，可在AFM-IR分析后继续使用染色或共聚焦光谱等互补技术进行后续分析。
- 科学价值：通过光谱生物标志物区分耐药与敏感菌株，无需依赖形态学差异，从而促进基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
原子力显微镜红外光谱技术（AFM-IR）贯穿从早期生物学中的假设验证到先导化合物筛选及临床前验证的整个发现过程，能够在抗生素研发中实现设计-合成-测试的迭代循环。
- 发现生物学：通过检测细菌分裂和耐药性发展过程中隔膜形成及细胞壁组分的化学变化，支持假设验证。
- 筛选：采用麦氏比浊标准和连续洗涤步骤制备标准化的细菌悬液，实现检测就绪。
- 分析：生成定量红外光谱并进行二阶导数分析，通过比较1,240和1,090 cm⁻¹处的谱带强度来区分耐药株与敏感株。
- 转化研究：支持非破坏性取样，便于采用正交方法进行后续验证，从而衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：可作为可重复使用的平台，用于探测除细菌研究外的多种生物样本，包括细胞、组织和病毒。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点鉴定的预测可信度，降低耐药机制中机理上的模糊性，并减少抗生素候选物的表型风险。
- 操作价值：通过基于涡旋的样本制备实现标准化，通过共平均背景校准提高可重复性，以及从单细胞到单层成像的可扩展性。
- 战略价值：通过直接化学生物标志物检测改善决策流程，提升早期靶点筛选的资本效率，并因发现意外耐药机制而降低后期研发失败风险。
- 项目组合影响：通过识别细胞壁生物合成作为与耐药相关的通路，实现基于风险的先导化合物优先排序，推动机制明确的后续开发。
实施注意事项
- 需要具备微生物学方面的专业知识，以进行无菌细菌操作，以及掌握原子力显微红外（AFM-IR）仪器的激光对准和光谱优化技术。
- 依赖配备氮气吹扫功能的AFM-IR光谱仪、超纯水系统以及适用于粘附固定的基底材料。
- 需要跨团队统一标准化样品洗涤流程，以最大限度减少培养基干扰并确保光谱保真度。
- 需根据不同的细菌种类、生长阶段和基底类型进行方法调整，以维持信噪比。
- 受限于需要建立光谱参考数据库以将特征峰归属至特定生物分子，以及逐点成像所需时间相较于整体红外光谱更长。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Atomic Force Microscopy-Infrared (AFM-IR) Spectroscopy Sample Preparation
2:50
Instrument Preparation
3:50
Single Spectrum Data Collection
5:42
Imaging Approach Data Collection
6:41
Results: Representative AFM-IR Analyses of Single Bacterium Chemistry
8:11
Conclusion
