原子力显微镜结合红外光谱作为探测单个细菌化学特性的工具

该方法可实现对细菌的纳米尺度研究，为我们深入了解抗菌药物耐药中的化学变化提供详细信息。因此，该方法有助于增进我们对抗菌药物耐药性（AMR）的理解，并推动药物研发。

细菌的纳米级尺寸极大地限制了可用于研究其化学特性的工具。原子力显微镜-红外光谱联用技术（AFM-IR）使我们能够以非破坏性、不受观察者主观影响的方式，甚至在亚细胞水平上进行检测。该方法通过揭示抗菌耐药性机制，有助于识别和验证新型抗菌药物的分子靶点。

除了细菌之外，AFM-IR 还可以检测多种细胞、组织甚至病毒。为了制备用于 AFM-IR 成像的样品，首先在适当的培养基和培养条件下培养目标细菌，然后使用无菌接种环小心地从菌落顶部挑取细菌并转移至玻璃试管中。向试管中加入 1 毫升超纯水，涡旋震荡 1 至 2 分钟，直至试管底部不再可见收集的细菌沉淀。

通过将制备的溶液与麦氏标准进行目视比较，估测溶液的大致浊度。如果细菌悬液的浊度似乎很低，则继续添加更多细菌并涡旋混匀，直至溶液的大致浊度与0.5和1麦氏标准相当。通过离心沉淀细菌，并用移液器小心吸除上清液。

将细菌细胞沉淀物用1毫升超纯水通过涡旋重新悬浮，并再次离心沉淀细菌。按照上述方法最多再洗涤细菌三次后，吸除上清液，涡旋沉淀物至少两分钟，然后将5微升细胞滴加到实验基底上。如果所需厚度为单层或单个细菌，在滴加后立即向基底加入20至100微升超纯水，并用移液器枪头轻轻混合溶液。

样品空气干燥后，使用双面胶带将基底固定在原子力显微镜（AFM）金属样品盘上。准备进行AFM-IR光谱分析时，开启软件和激光器后按下“初始化”按钮，并确认激光快门处于打开位置。在此过程中，将弹出“载物台初始化”窗口。

初始化过程完成后，单击“初始化”和“确定”。如果可能，打开氮气流以用氮气吹扫仪器，并调节氮气吹扫以达到稳定的湿度水平。小心地将样品放入样品室中，避免损坏探针，然后在软件中单击“加载”。按照向导步骤加载样品，在每一步中均需关注探针和样品的对焦情况。

然后点击“Approach”以在不接触样品的情况下接近样品。在接触样品之前，选择“Tools”（工具）、“IR Background Calibration”（红外背景校准）和“New”（新建）。在弹出窗口中，根据分析目的设置分辨率和光谱范围，并设置累加次数以及用于平均的背景次数。

选择启用。在弹出窗口中设置起始和结束参数，然后单击接受并采集。背景数据采集完成后，单击保存。

为使探针接触样品，点击“Engage”（接触）。系统将自动接近样品表面，直至检测到直接接触。点击“Scan”（扫描）以采集初始的大范围、低空间分辨率原子力显微镜（AFM）图像，用于在将探针移至目标测量位置前观察样品表面形貌。

为了将红外激光对准样品吸收的波数，请在“波数”字段中输入样品将吸收的波数值，然后点击“开始红外”。在“振幅随频率变化图”中至少应观察到一个清晰的峰。在“偏转随时间变化图”中应显示一个周期性波形。点击“优化”以选择一个常规的红外细菌光谱，用于确定各谱带的位置，并利用该光谱在不同波数范围内优化不同波数值下的热点。

当所选波数的红外光斑已优化后，设定光谱分辨率、范围以及累加次数，然后点击“采集”以获取AFM-IR光谱。为获取特定波数下的强度分布图像，在记录单个AFM-IR光谱后，需记录所选样品区域的AFM图像，并选择用于AFM-IR成像的波数。确认激光的红外光斑已针对所选波数优化，并设置图像区域X和Y方向的数据点数。

在“常规”窗口中设置激光功率。在“AFM 扫描”窗口中定义扫描速率。然后勾选“红外成像启用”复选框，点击“扫描”以开始成像。

将在选定波数下同时采集该区域的AFM-IR信号强度和AFM数据。本方案可用于获取基底上多种类型的细菌细胞分布，从单个细胞到单层及多层结构均可实现。该方案可用于监测活体细菌的动态变化。

例如，在金黄色葡萄球菌（S.aureus）细胞分裂过程中隔膜的形成阶段。与从细胞其他区域采集的AFM-IR谱图相比，隔膜区域的AFM-IR谱图在1,240和1,090厘米处的吸收峰相对强度更高，表明隔膜主要由细胞壁组分中的碳水化合物和磷酸二酯基团构成。该方案还可用于研究因耐药性发展而引起的化学成分差异。

如本代表性分析所示，万古霉素间歇性耐药金黄色葡萄球菌与万古霉素敏感金黄色葡萄球菌细胞之间未检测到形态学差异。然而，对AFM-IR光谱及其二阶导数的评估显示，与敏感菌株相比，耐药菌株中与细胞壁组分相关的碳水化合物和磷酸二酯基团的谱带相对强度明显增加。样品制备时需确保清洁，因此应从初始步骤起尽量减少培养基的干扰，并通过多次洗涤彻底将其去除。

由于AFM-IR是一种非破坏性技术，样品后续可采用其他技术进一步研究，例如染色或共聚焦离子光谱，这些技术可提供有关其化学性质的补充信息。