原子力显微镜与红外光谱相结合，作为探测单一细菌化学的工具
September 15th, 2020
原子力显微镜-红外光谱学（AFM-IR）为细菌研究提供了一个强大的平台，能够实现纳米级分辨率。同时，可以绘制亚细胞变化图（例如，细胞分裂后）以及化学成分的比较研究（例如，耐药性引起的）可以在细菌的单个细胞水平上进行。
该方法允许对细菌进行纳米级研究。它为我们提供了有关抗菌素耐药性化学变化的详细见解。因此，它有助于我们了解 AMR 和药物开发。
细菌的纳米级大小极大地限制了能够探测其化学性质的可用研究工具。AFM-IR 使我们能够以非破坏性、独立于观察者的方式进行检测，即使在亚细胞水平上也是如此。通过深入了解抗菌素耐药性，该方法可以帮助识别和测试新型抗菌剂的分子靶标。
除了细菌，AFM-IR 还可以探测一系列细胞、组织甚至病毒。为了制备用于 AFM-IR 成像的样品，在适当的培养条件下在适当的培养基上培养感兴趣的细菌后，使用无菌环小心地从菌落顶部挑选细菌以转移到玻璃管中。向试管中加入 1 毫升超纯水并涡旋 1 至 2 分钟，直到收集的细菌沉淀在试管底部不再可见。
通过目视比较制备的溶液和 McFarland 标准品来估计溶液的粗略浊度。如果细菌悬浮液的浑浊度似乎很低，请继续添加更多细菌并涡旋，直到溶液的粗浊度与 0.5 和 1 McFarland 标准相当。通过离心沉淀细菌，并用移液管小心吸出上清液。
将细菌细胞沉淀重悬于一毫升超纯水中，涡旋，然后再次离心沉淀细菌。如前所述，将细菌再洗涤 3 次后，吸出上清液并涡旋沉淀至少 2 分钟，然后将 5 μL 细胞添加到实验底物上。如果所需的厚度是单层或单个细菌，则在沉积后立即向基质中加入 20 至 100 微升超纯水，然后用移液器吸头轻轻混合溶液。
当样品风干后，使用双面胶带将基板安装到 AFM 金属样品盘上。要准备 AFM-IR 光谱仪进行分析，请在打开软件和激光器后按 Initialize 并确认激光快门处于打开位置。在此过程中，将弹出 Stage Initialization 窗口。
初始化过程完成后，单击 Initialize 和 OK。如果可能，打开氮气流以用氮气吹扫仪器，并调整氮气吹扫以达到稳定的湿度水平。小心地将样品放入样品室中，不要损坏吸头，然后单击软件中的 Load（加载）。按照向导加载样品，在每个步骤中专注于吸头和样品。
然后单击 Approach （方法） 以接近示例而不参与。在使用示例之前，请选择 Tools （工具）、IR Background Calibration （红外背景校准） 和 New （新建）。在弹出窗口中，根据分析目标设置分辨率和光谱范围，并将共平均值和背景设置为平均值。
选择 Enable。在弹出窗口中，设置 start 和 end 参数，然后单击 Accept 和 Acquire。获取后台数据后，单击 Save 。
要将提示与示例接洽，请单击 Engage。系统将接近样品表面，直到检测到直接接触。单击扫描以收集初始更大区域、低空间分辨率的 AFM 图像，以便在将针尖移动到感兴趣的测量点之前可视化表面。
要将红外激光器与样品吸收的波数对齐，请在 Wave Number（波数）字段中输入样品吸收的波数，然后单击 Start（开始），IR.At Amplitude Versus Frequency （振幅与频率）图中至少观察到一个清晰的峰值。Deflection Versus Time 图表应显示周期性波形。单击 Optimize 选择常规红外细菌光谱来识别波段的位置，并使用该光谱优化来自各个光谱区域的各种波数值的热点。
优化所选波数值的红外点后，定义光谱分辨率和范围以及共平均数，然后单击 Acquire 以收集 AFM-IR 光谱。要收集所选波数值的强度分布图像，请在记录单个 AFM-IR 光谱后，记录所选样品区域的 AFM 图像并选择 AFM-IR 成像的波数值。确认激光的 IR 光斑已针对所选波数值进行了优化，并设置图像区域 X 和 Y 方向的数据点数。
在 General （常规） 窗口中，设置激光功率。在 AFM Scan （AFM 扫描） 窗口中，定义扫描速率。然后选中 IR Imaging Enable 框并单击 Scan 扫描开始成像。
所选波数处信号强度的 AFM-IR 将与来自该区域的 AFM 数据同时收集。该协议能够在基质上获取一系列类型的细菌细胞分布，从单细胞到单层和多层。该协议可用于监测活细菌的动态变化。
例如，在金黄色葡萄球菌细胞分裂过程中形成隔膜。与从细胞区域收集的 AFM-IR 光谱相比，隔膜的 AFM-IR 光谱的特点是 1、240 和 1、090 厘米处的条带相对强度更高，表明隔膜由细胞壁成分的碳水化合物和磷酸二酯基团组成。该方案还可用于研究由于耐药性的发展而引起的化学成分差异。
如本代表性分析中所观察到的，万古霉素间歇性耐药和万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌细胞之间未测量到形态学差异。然而，对 AFM-IR 光谱及其二阶衍生物的评估显示，与易感菌株相比，抗性菌株中细胞壁成分中与碳水化合物和磷酸二酯基团相关的条带的相对强度明显增加。制备干净的样品很重要，因此请注意从一开始就减少培养基的贡献，并从多次洗涤中将其完全去除。
由于 AFM-IR 是一种无损技术，因此稍后可以使用其他技术（例如染色或共聚焦离子光谱）来研究样品，这些技术可以提供有关其化学成分的补充信息。
概述
原子力显微镜-红外光谱（AFM-IR）实现了细菌的纳米尺度研究，为抗菌药物耐药性相关的化学变化提供了洞察。这种方法允许在亚细胞水平上进行非破坏性分析，提高了我们对药物耐药机制的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 生物物理学
背景
- AFM-IR为研究细菌提供了强大的平台。
- 细菌的纳米尺寸限制了可用的研究工具。
- 了解抗菌药物耐药性（AMR）对药物开发至关重要。
- AFM-IR可以探测各种生物样本，包括细胞和组织。
研究目的
- 调查与AMR相关的细菌化学变化。
- 识别新型抗菌药物的分子靶点。
- 监测活细菌的动态变化。
使用的方法
- 样品制备包括培养细菌和涡旋混合。
- 在样品沉积到基底上之后进行AFM-IR成像。
- 仪器校准和背景数据采集是必要步骤。
- 数据收集包括AFM图像和红外光谱。
主要结果
- AFM-IR可以区分耐药细菌的化学成分差异。
- 在细胞分裂期间，在隔膜处观察到更高强度的带。
- 在耐药菌株和敏感菌株之间未发现形态学差异。
- AFM-IR光谱揭示了细菌细胞壁成分的重要见解。
结论
- AFM-IR是研究细菌化学的有价值工具。
- 该方法增强了对AMR机制的理解。
- 它可以促进新型抗菌策略的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
AFM-IR enables nanoscale chemical analysis of single bacteria, addressing the critical need for phenotypic probing in antimicrobial resistance research. By providing simultaneous spatial and spectral data at sub-cellular resolution, the method supports target validation and mechanistic de-risking in early antibiotic discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying molecular targets and monitoring resistance mechanisms, directly impacting lead identification and preclinical decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking chemical composition changes to antimicrobial resistance phenotypes.
- Operational Value: Provides non-destructive, observer-independent chemical profiling at the single-cell level for functional target validation.
- Scientific Value: Supports predictive confidence through direct observation of cell wall component alterations in resistant strains.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated bacterial systems for downstream workflows by removing medium contributions through standardized washing protocols.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via controlled sample deposition and substrate preparation for consistent AFM-IR data acquisition.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by capturing intensity distribution images at specific wave numbers to map chemical alterations.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by probing chemical composition arising from resistance development in clinically relevant strains like S. aureus.
- Operational Value: Supports translational continuity from discovery through preclinical validation by allowing post-AFM-IR analysis with complementary techniques such as staining or confocal spectroscopy.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by distinguishing resistant and susceptible strains via spectral biomarkers without relying on morphological differences.
Pipeline & Workflow Integration
AFM-IR fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, enabling iterative design-make-test cycles in antibiotic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by detecting chemical alterations in septum formation and cell wall components during bacterial division and resistance development.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized bacterial suspension preparation using McFarland turbidity standards and sequential washing steps.
- Analytics: Generates quantitative infrared spectra and second-derivative analysis to compare resistant and susceptible strains based on band intensity at 1,240 and 1,090 cm⁻¹.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling non-destructive sampling for follow-up validation with orthogonal methods.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing diverse biological samples including cells, tissues, and viruses beyond bacterial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target identification, reduction of mechanistic ambiguity in resistance mechanisms, and phenotypic de-risking of antibiotic candidates.
- Operational Value: Standardization via vortex-based sample preparation, reproducibility through co-averaged background calibration, and scalability from single-cell to monolayer mapping.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via direct chemical biomarker detection, capital efficiency in early target screening, and reduced late-stage failure due to unanticipated resistance mechanisms.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of leads by identifying cell wall biosynthesis as a resistance-associated pathway, enabling mechanism-informed advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology for sterile bacterial handling and AFM-IR instrumentation for laser alignment and spectral optimization.
- Depends on AFM-IR spectrometer with nitrogen purge capability, ultrapure water systems, and substrates compatible with adhesive mounting.
- Necessitates cross-team standardization of sample washing protocols to minimize medium interference and ensure spectral fidelity.
- Involves adaptation considerations for varying bacterial species, growth phases, and substrate types to maintain signal-to-noise ratio.
- Limited by the need for spectral reference libraries to assign peaks to specific biomolecules and the time required for point-by-point mapping versus bulk IR.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Atomic Force Microscopy-Infrared (AFM-IR) Spectroscopy Sample Preparation
2:50
Instrument Preparation
3:50
Single Spectrum Data Collection
5:42
Imaging Approach Data Collection
6:41
Results: Representative AFM-IR Analyses of Single Bacterium Chemistry
8:11
Conclusion
