MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

已开发出与RNA测序联用的MS2亲和纯化技术（MAPS），用于鉴定细菌中任意目标RNA的全部靶标组。该技术能够不依赖调控机制而鉴定各类小RNA（sRNA）的相互作用伙伴。对依赖sRNA的调控网络进行表征，将有助于更深入理解细菌毒力因子的产生、生物膜形成及其在宿主细胞内的存活机制，最终为抗击葡萄球菌感染提供支持。

该方案可应用于任何致病性或非致病性革兰氏阳性细菌。演示本实验操作的是来自 Pascal Romby 博士实验室的博士研究生 Noemie Mercier。首先，将携带 pCN51 P3 MS2 sRNA 或 pCN51 P3 MS2 质粒的菌株单菌落分别接种于 3 毫升 BHI 培养基中，该培养基需添加 10 微克/毫升红霉素，每组设两个重复。

将每种过夜培养物用50毫升新鲜的添加红霉素的BHI培养基稀释，使OD 600达到0.05。在37摄氏度、180 RPM振荡条件下培养6小时。将每种培养物转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以2,900 ×g离心15分钟，弃去上清液，将沉淀物在-80摄氏度冷冻保存，或置于冰上直接进行机械细胞裂解。

为进行机械细胞裂解，将沉淀重悬于5毫升缓冲液A中，并将重悬的细胞转移至含有3.5克玻璃珠的15毫升离心管中。将离心管放入机械细胞裂解仪中，以每秒4米的速度运行一个40秒的循环程序。随后在2,900 ×g下离心15分钟，收集上清液并置于冰上保存。

确保上清液澄清，若不澄清则重复离心。移除层析柱尖端，将层析柱放入柱架中，并用超纯水洗涤层析柱。加入 300 微升 amylose 树脂，并用 10 毫升缓冲液 A 洗涤层析柱。将 1,200 皮摩尔的 MBP-MS2 蛋白稀释于 6 毫升缓冲液 A 中，然后上样至层析柱中。

用10毫升缓冲液A洗涤层析柱。接下来，进行MS2亲和纯化。将细胞裂解液上样至层析柱中，并用干净的收集管收集穿流组分。用10毫升缓冲液A洗涤层析柱三次，并收集每次的洗涤组分，然后用1毫升缓冲液E洗脱层析柱，并用2毫升微量离心管收集洗脱组分。

收集的所有组分均需置于冰上，直至进行RNA提取。每个组分取1毫升用于RNA提取。向RNA中加入等体积的苯酚，剧烈混匀，然后在20摄氏度下以16,000 ×g离心10分钟。

将上层相转移至一个干净的2毫升微量离心管中。加入等体积的氯仿-异戊醇，再次离心，然后将上层相转移至新的离心管中。加入2.5倍体积的100%冷乙醇和0.1倍体积的3摩尔/升乙酸钠（pH 5.2），在-20摄氏度下沉淀过夜。

第二天，将离心管在4°C条件下以16,000 × g离心15分钟。用移液器缓慢吸出乙醇，注意不要扰动沉淀。加入500 µL预冷的80%乙醇，再以16,000 × g离心5分钟。

用移液器缓慢吸去乙醇，然后在运行模式下使用真空浓缩仪干燥沉淀5分钟。将沉淀重悬于适量超纯水中。本实验方案用于研究金黄色葡萄球菌（S.aureus）中RsaC的靶标组。

利用MAPS技术鉴定了多个直接与RsaC相互作用的mRNA，揭示了RsaC在氧化应激和金属相关反应中的关键作用。为验证MS2 sRNA构建体并观察其表达模式，在BHI培养基中培养2、4和6小时后收集细胞。提取RNA后，使用RsaC特异性的DIG探针进行Northern印迹分析。

内源性 RsaC 的水平在生长六小时后显著升高。重要的是，MS2-RsaC 544 和 MS2-RsaC 1,116 在六小时时的水平与内源性 RsaC 相当。随后进行了亲和纯化，并从仅表达 MS2 标签的野生型菌株以及表达 MS2-RsaC 544 构建体的 RsaC 突变菌株的粗提物、穿流组分和洗脱组分中提取了 RNA。

内源性RsaC长度为1,116个核苷酸，在洗脱组分中富集，但由于其长度和复杂的二级结构，与亲和柱发生了非特异性相互作用。MS2-RsaC 544在洗脱组分中高度富集，表明其被MS2-MBP融合蛋白成功捕获。生物信息学分析根据MS2 sRNA与MS2对照之间的倍数变化，预测了可能的mRNA靶标，结果显示sodA为首个潜在靶标。

在MS2亲和纯化后，使用sodA特异性的DIG探针进行的Northern印迹分析显示，与MS2对照相比，sodA能够被MS2-RsaC 544高效地共富集。在尝试本方案时，需注意MS2标签的添加可能会影响sRNA的构象、稳定性或功能，应对此进行仔细监测。

MAPS 可提供 sRNA-RNA 靶标配对的快照。进一步的实验验证将揭示其功能。该技术代表了一种强大的工具，可用于构建任何细菌中的 sRNA 调控网络。