Name: MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学习MS2亲和力纯化结合RNA测序技术，用于革兰阳性细菌中sRNA调控网络的鉴定与分析。该方法可识别RNA相互作用伙伴，助力研究细菌毒力因子和生物膜形成机制。

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本工作得到了“法国国家研究署”（ANR，项目编号 ANR-16-CE11-0007-01，RIBOSTAPH，以及 ANR-18-CE12-0025-04，CoNoCo，授予 PR）的支持。同时在实验室卓越计划（labEx NetRNA，项目编号 ANR-10-LABX-0036）和 ANR-17-EURE-0023（授予 PR）的框架下获得资助，资金由 ANR 管理，属于“未来投资计划”中的国家拨款。DL 获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议 No. 753137-SaRNAReg 的支持。E. Massé 实验室的工作获得了加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）以及美国国立卫生研究院（NIH）团队项目基金 R01 GM092830-06A1 的运行经费支持。

1. 缓冲液与培养基
<ol>
	<li>进行 MAPS 实验时，配制以下缓冲液和培养基： 
	- 缓冲液 A（150 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，1 mM MgCl2 和 1 mM DTT） 
	- 缓冲液 E（250 mM KCl，20 mM Tris-HCl pH 8，12 mM 麦芽糖，0.1% Triton，1 mM MgCl2 和 1 mM DTT） 
	- RNA 上样缓冲液（8 M 尿素中含 0.025% 桔黄 G 和 0.025% 溴酚蓝） 
	- 脑心浸出液（BHI）培养基（每升含小牛脑 12.5 g、蛋白胨 10 g、牛心 5 g、NaCl 5 g、Na2HPO4 2.5 g 和葡萄糖 2 g） 
	- 营养肉汤（LB）培养基（每升含蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g 和 NaCl 10 g）</li>
	<li>进行 Northern 印迹分析时，配制以下缓冲液： 
	- 封闭液（1× 马来酸缓冲液和 1% 封闭试剂） 
	- 杂交液（50% 甲酰胺，5× SSC，7% SDS，1% 封闭液，0.2% N-月桂酰肌氨酸钠，50 mM 磷酸钠）。加热并振荡至完全溶解。 
	注意：请严格遵守每种产品的安全使用注意事项。 
	- 1 M 磷酸钠溶液（58 mM 磷酸氢二钠和 42 mM 磷酸二氢钠） 
	- 氯化钠-柠檬酸钠（SSC）缓冲液，20× 浓缩液（3 M NaCl 和 300 mM 三钠柠檬酸盐）</li>
</ol>
2. 安全问题
<ol>
	<li>所有涉及活体致病菌的操作均须在二级生物安全实验室中进行。 
	注意：裂解后（步骤5）仅细胞提取物可移出实验室。</li>
	<li>穿戴实验服和手套。</li>
	<li>确保手腕部位被完全覆盖。</li>
	<li>使用消毒液清洁生物安全柜（II级）。</li>
	<li>将接触过细菌的固体废弃物丢弃至指定的生物医学废物容器中。</li>
	<li>用消毒液处理含有污染液体的烧瓶，随后倒入水槽中弃置。</li>
	<li>离开二级生物安全实验室前，须用肥皂仔细清洗手部和手腕，并脱下实验服。</li>
</ol>
3. 质粒构建
注意：出于克隆目的，首先确定内源性小RNA（sRNA）的边界至关重要。pCN51-P3 和 pCN51-P3-MS2 质粒的描述见 Tomasini 等（2017）27。P3 启动子可在细胞密度依赖的方式下实现 sRNA 的高水平表达（即当细菌进入生长的稳定期时）。许多葡萄球菌的小RNA在此生长阶段积累。
<ol>
	<li>使用高保真DNA聚合酶和PCR仪通过PCR扩增sRNA序列。请严格遵循制造商说明书，并阅读Garibyan和Avashia（2013）的相关内容31 详情请见。</li>
	<li>使用以下模板设计特异性引物： 
	<img alt="静力平衡示意图，ΣFx=0，展示用于物理分析的梁上受力与力矩。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61731/text12.png" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	和 5’-CGCGGATCC(N)-3’，分别用于正向和反向引物。 
	注意：这些寡核苷酸可用于将MS2序列（加粗）连接至目标小RNA的5’端。 Pst我与 Bam在MS2-sRNA构建体的5’和3’末端添加了HI限制性酶切位点（下划线标出），以便将扩增产物克隆至pCN51-P3质粒中27(N) 对应于基因特异性序列（15-20 个核苷酸）。</li>
	<li>摘要 1 µg pCN51-P3 质粒的 1 µg MS2-sRNA PCR产物与2 U的 PstI 和 1 U 的 Bam根据制造商的建议，在适当的缓冲液中进行HI。</li>
	<li>37 °C孵育1小时 37 °C 并使用PCR纯化试剂盒纯化DNA（参见 材料表).</li>
	<li>将消化后的 pCN51-P3 质粒（300 ng）与 MS2-sRNA 扩增片段（载体与插入片段的摩尔比为 1:3）加入 1.5 mL 离心管中混匀。参见 Revie 等（1988）32 以最大化连接效率。添加 1 µL 加入连接酶缓冲液和10 U T4连接酶至各管中。将体积调整至 10 µL 用超纯水。</li>
	<li>孵育于 22 °C 至少 2 h。</li>
	<li>添加 5 µL 连接混合物的量 50 µL 冻存的DH5α化学感受态细胞 E. coli 细胞。参见 Seidman 等（2001）33 了解质粒转化和化学感受态细胞的更多信息。</li>
	<li>冰上孵育30分钟。</li>
	<li>热激（45 秒于 42 °C使用金属浴或水浴锅对转化管进行热激处理。</li>
	<li>添加 900 µL LB 培养基，并在 37 °C 30分钟</li>
	<li>培养皿 100 µL 在添加氨苄青霉素的LB琼脂平板上涂布细菌悬液100 µg/µL).   
	注意：pCN51-P3 载体编码氨苄青霉素抗性基因，可用于筛选仅含该载体的菌株 E. coli 携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒的克隆</li>
	<li>从含有氨苄青霉素的过夜细菌培养物（5 mL）中提取 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒100 µg/µL) 使用质粒DNA小量提取试剂盒（参见 材料列表).</li>
	<li>通过Sanger测序验证构建34 使用以下引物：5’-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3’。 </li>
	<li>将 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒转化至化学感受态 DC10B 中 E. coli 细胞。重复步骤 3.7 至 3.11。</li>
	<li>提取pCN51-P3-MS2-sRNA质粒（见步骤3.12），并转化1-5 µg 质粒DNA转入HG001 ΔsRNA电转感受态细胞 S. aureus 使用电穿孔仪对细胞进行电穿孔。请仔细遵循制造商的说明。参阅 Grosser 和 Richardson（2016）35 了解有关制备电转感受态细胞方法的更多信息 S. aureus. 
	警告：此步骤涉及病原菌的操作（参见步骤2）.</li>
	<li>添加 900 µL BHI 培养基中，于 37 °C 3小时。</li>
	<li>离心1分钟，16,000 x g弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀重悬于 100 µL BHI 培养基，并将细菌悬液涂布于添加红霉素的 BHI 琼脂平板上10 µg/µL).   
	注意：pCN51-P3 载体还编码一个红霉素抗性基因，可用于筛选 S. aureus 携带 pCN51-P3-MS2-sRNA 质粒的克隆</li>
</ol>
4. 细菌收获
注意：此步骤涉及病原菌的操作（参见步骤 2）。
<ol>
	<li>将含有 pCN51-P3-MS2-sRNA 或 pCN51-P3-MS227 质粒的菌株分别接种于 3 mL 添加红霉素（10 µg/µL）的 BHI 培养基中，每组设两个重复，培养至单菌落。</li>
	<li>将过夜培养物按约 1/100 的比例转接至 50 mL 新鲜的含红霉素（10 µg/µL）BHI 培养基中，调整初始 OD600nm 至 0.05。使用 250 mL 灭菌锥形瓶（培养液体积与瓶容量之比为 5:1）。 
	注意：培养基及培养条件应根据所研究的小分子 RNA（sRNA）的表达模式进行相应设置。</li>
	<li>在 37 °C、180 rpm 振荡条件下培养 6 小时。</li>
	<li>将每份培养物转移至 50 mL 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 2,900 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将菌体沉淀置于冰上，立即进行机械裂解细胞（步骤 5），或于 -80 °C 冷冻保存。</li>
</ol>
5. 机械细胞裂解
注意：以下步骤必须在冰上进行，缓冲液温度应保持在 4 °C。操作时需佩戴手套，并采取所有预防措施以防止样品受到 RNase 污染。
<ol>
	<li>将沉淀物（步骤 4.6）重悬于 5 mL 缓冲液 A 中。</li>
	<li>将重悬的细胞转移至 15 mL 离心管中，加入 3.5 g 二氧化硅珠（0.1 mm）。</li>
	<li>将离心管放入机械细胞裂解仪中（见材料表），以 4.0 m/s 的速度运行 40 秒。 
	注意：如果一次循环不足以裂解细胞，可将仪器冷却 5 分钟，同时将样品置于冰上。然后重复一次 40 秒、4.0 m/s 的循环。可通过将上清液涂布于 BHI 琼脂平板来检测细胞裂解效率。</li>
	<li>在 15,700 × g 条件下离心 15 分钟，收集上清液并置于冰上保存。</li>
</ol>
6. 柱层析柱的制备
注意：请小心避免直链淀粉树脂变干。如有需要，可用端盖密封层析柱。在开始亲和纯化之前，准备好所有溶液。
<ol>
	<li>将层析柱放入层析柱支架中（参见材料表）。</li>
	<li>移除层析柱尖端，并用超纯水清洗层析柱。</li>
	<li>加入 300 µL 的淀粉树脂。</li>
	<li>用 10 mL 缓冲液 A 清洗层析柱。</li>
	<li>将 1,200 pmol 的 MBP-MS2 蛋白用 6 mL 缓冲液 A 稀释后上样至层析柱中。</li>
	<li>用 10 mL 缓冲液 A 清洗层析柱。</li>
</ol>
7. MS2亲和纯化（图1）
<ol>
	<li>将细胞裂解液加入层析柱中。 
	注意：保留 1 mL 细胞裂解液（粗提物，CE），用于提取总 RNA（步骤 8），并进行 Northern 印迹（步骤 9）和转录组学（步骤 10）分析。</li>
	<li>用干净的收集管收集穿流组分（FT）。</li>
	<li>用 10 mL 缓冲液 A 洗涤层析柱 3 次，收集洗涤组分（W）。</li>
	<li>用 1 mL 洗脱缓冲液 E 洗脱层析柱，并将洗脱组分（E）收集至 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>将所有收集的组分置于冰上保存，直至进行 RNA 提取（步骤 8），或于 -20 °C 冻存以备后续使用。</li>
</ol>
8. 收集组分（CE、FT、W 和 E）的 RNA 提取
<ol>
	<li>取1 mL每种组分（包括流穿组FT和洗涤组W）用于RNA提取。</li>
	<li>加入1体积酚，剧烈混匀。 
	注意：酚具有挥发性和腐蚀性，操作时需谨慎，并在通风橱内安全操作。</li>
	<li>在20 °C条件下，以16,000 × g 离心10分钟。</li>
	<li>将上层液体转移至洁净的2 mL微量离心管中。</li>
	<li>加入1体积氯仿/异戊醇（24:1），重复步骤8.3至8.4。 
	注意：请在通风橱内安全操作。</li>
	<li>加入2.5体积预冷的100%乙醇和1/10体积的3 M醋酸钠（NaOAc）pH 5.2。</li>
	<li>在-20 °C下沉淀过夜。 
	备注：也可在乙醇/干冰浴中沉淀20分钟，或在-80 °C下沉淀2小时。</li>
	<li>在4 °C条件下，以16,000 × g 离心15分钟，小心用移液器缓慢吸除乙醇，避免扰动沉淀。 
	注意：RNA沉淀并不总是可见，且在乙醇存在时有时较为松散。</li>
	<li>加入500 µL预冷的80%乙醇。</li>
	<li>在4 °C条件下，以16,000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>小心用移液器缓慢吸弃乙醇，使用真空浓缩仪在运行模式下干燥沉淀5分钟。</li>
	<li>将沉淀溶于适量体积（15–50 µL）的超纯水中，于-20 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>使用分光光度计/荧光计（见材料表）测定RNA浓度（260 nm）和纯度（260/280和260/230波长比值），并严格遵循仪器制造商的操作说明。 
	备注：通常在洗脱组分（E）中可获得3–4 µg RNA，具体产量主要取决于实验条件。</li>
</ol>
9. 通过Northern印迹分析MS2亲和纯化36
<ol>
	<li>将CE、FT、W组分的5 µg RNA以及E组分的500 ng RNA溶于10 µL超纯水中，再与10 µL RNA上样缓冲液混合。</li>
	<li>在90 °C下孵育3分钟。</li>
	<li>将样品加入含有20 mM硫氰酸胍的1%琼脂糖凝胶孔中，在4 °C条件下以100–150 V电压在1× TBE缓冲液中电泳。更多细节请参见Koontz (2013)37。</li>
	<li>通过真空转移1小时或毛细管转移过夜，将RNA转移至硝酸纤维素膜上。 
	注意：对于较大的RNA，毛细管转移法效率更高。</li>
	<li>使用紫外交联仪在254 nm波长、120 mJ强度下对膜上的RNA进行紫外交联。</li>
	<li>将膜放入杂交瓶中，RNA面朝上。</li>
	<li>加入10–20 mL预热的杂交液，在68 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>弃去溶液，加入10–20 mL新鲜杂交液，并添加1 µL特异性sRNA探针。在68 °C下过夜孵育。 
	注意：地高辛（DIG）标记的RNA探针使用DIG RNA标记试剂盒并按照制造商说明合成。也可使用放射性标记探针。</li>
	<li>用10–20 mL洗涤液1（2× SSC和0.1% SDS）在20 °C下洗涤膜5分钟，重复一次。</li>
	<li>用10–20 mL洗涤液2（0.2× SSC和0.1% SDS）在68 °C下洗涤膜15分钟，重复一次。</li>
	<li>加入10–20 mL封闭液，在20 °C下孵育至少30分钟。</li>
	<li>弃去封闭液，加入10–20 mL含有辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗地高辛抗体（1/1000稀释）的封闭液，在20 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>用10–20 mL洗涤液3（1×马来酸缓冲液和0.3% Tween 20）在20 °C下洗涤膜15分钟，重复一次。</li>
	<li>加入10–20 mL检测缓冲液（0.1 M Tris HCl和0.1 M NaCl，pH 9.5），在20 °C下孵育5分钟。</li>
	<li>将膜置于塑料膜上，滴加底物（见材料表），避光孵育5分钟。</li>
	<li>用塑料膜密封膜，放入放射自显影暗盒中。</li>
	<li>在专用暗室中将膜与放射自显影胶片接触曝光。 
	注意：曝光时间取决于信号强度，从几秒到数分钟不等。</li>
	<li>使用自动显影仪显影曝光后的胶片。</li>
</ol>
10. RNA测序样品的制备
注意：此步骤仅适用于从 E 和 CE 组分中提取的 RNA。
<ol>
	<li>向每个样品中加入 10 µL 10x DNase 缓冲液和 DNase I（1 U/µg 处理后的RNA）加水至终体积 100 µL.</li>
	<li>37 °C孵育1小时 37 °C.</li>
	<li>按照先前所述方法提取和纯化RNA（步骤8.2至8.11）。</li>
	<li>将RNA沉淀重悬于 20 µL 超纯水。 
	注意：可使用 PCR 和特异性引物（如 16S 基因）检测残留 DNA 的存在。</li>
	<li>使用基于微流控电泳分析系统评估RNA的浓度和质量（参见 材料清单). 
	注意： 1 µg 通常在DNase处理后的洗脱组分（E）中获得。</li>
	<li>使用细菌rRNA去除试剂盒去除核糖体RNA。 
	注意：大量且丰度较高的RNA（如rRNA）倾向于与亲和层析柱发生非特异性相互作用。此步骤需要500 ng提取的RNA。</li>
	<li>再次使用基于微流控电泳分析系统评估RNA的产量和质量。</li>
	<li>使用 cDNA 文库构建试剂盒，按照制造商说明书，以 10–20 ng 去除核糖体 RNA 的 RNA 制备 cDNA 文库。</li>
	<li>使用测序仪器对获得的文库进行测序（例如，单端测序，150 bp；参见 材料表). 
	注意：每个样本通常需要 500 万至 1000 万条读段。</li>
</ol>
11. RNA测序数据分析（图2）
<ol>
	<li>从测序平台下载 FastQ 测序文件。</li>
	<li>访问罗斯科夫生物站的 Galaxy 实例（https://galaxy.sb-roscoff.fr/）并登录。 
	注意：所有提及的算法均可通过搜索栏轻松找到。每个工具均提供用户指南。 
	警告：所需工具的版本可能与公共 Galaxy 服务器上的版本不同38。</li>
	<li>点击 获取数据 图标，然后选择 从您的计算机上传文件。上传每个 MS2 对照样本和 MS2-sRNA 样本的 FastQ 测序文件。同时上传 FASTA 参考基因组文件和 GFF 注释文件。</li>
	<li>运行 FastQC 读段质量报告（Galaxy 版本 0.69）。 
	注意：该工具提供对原始序列的质量评估（例如，质量值、接头序列的存在情况）。</li>
	<li>运行 Trimmomatic 灵活读段修剪工具（Galaxy 版本 0.36.6），主要用于去除接头序列和低质量读段。指定文库构建中使用的接头序列（例如，TruSeq 3，单端）。添加以下 Trimmomatic 操作：SLIDINGWINDOW（碱基数=4；平均质量=20）和 MINLEN（最小读段长度=20）。</li>
	<li>再次运行 FastQC 读段质量报告（Galaxy 版本 0.69）。</li>
	<li>运行 Bowtie2 — 将读段比对至参考基因组（Galaxy 版本 2.3.2.2）。使用历史记录中的参考基因组 FASTA 文件，采用默认设置（高灵敏度局部比对）进行读段比对。 
	注意：Bowtie2 工具生成的 BAM 文件可使用 Integrative Genomics Viewer（IGV）进行可视化。同时需要关联的 BAI 文件。</li>
	<li>可选：运行 Flagstat，用于汇总 BAM 数据集的统计信息（Galaxy 版本 2.0）。</li>
	<li>运行 htseq-count — 计数（Galaxy 版本 0.6.1），将读段与 GFF 注释文件中的特征重叠区域进行比对。使用“交集（非空）”模式。</li>
	<li>将所有来自 htseq-count 分析的原始计数文件归档为一个 Zip 压缩文件。</li>
	<li>运行 SARTools DESeq2 以比较数据（Galaxy 版本 1.6.3.0）。提供包含原始计数文件的 Zip 文件以及设计文件（一个制表符分隔的文件，用于描述实验设计）。请严格按照提供的说明生成设计文件。</li>
</ol>

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<li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li>
<li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li>
<li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10(2007).</li>
<li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone%2C+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li>
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<li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li>
<li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
<li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA%3A+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li>
<li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li>
<li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li>
<li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Reseaerch%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li>
<li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li>
<li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IntaRNA+2.0%3A+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li>
<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

一种适用于革兰氏阳性菌的改良方案 
MAPS 的初始方案旨在研究模式生物 E. coli20,30 中的小RNA相互作用组。本文中，我们描述了一种改良后的方案，适用于机会性人类病原体 S. aureus 中依赖小RNA的调控网络的表征，且该方案无疑可推广至其他革兰氏阳性菌，无论其是否具有致病性。
特别关注了细胞裂解步骤。已使用机械细胞裂解仪替代法式高压破碎仪。该方法能有效裂解革兰氏阳性菌细胞，并降低操作致病菌株相关的风险。为了提高MS2亲和纯化的得率，已大幅增加固定在直链淀粉树脂上的MS2-MBP的量。这需要调整洗涤的严格程度和洗涤次数。
与初始方案不同，MAPS 从两个生物学重复样本中分别进行，每个样本重复操作一次。已开发出一套工作流程以实施统计分析（图2），从而显著提高...

在大多数细菌基因组中已鉴定出数百个甚至数千个小调控RNA（sRNA），但其中绝大多数的功能尚未明确。总体而言，sRNA是一类短的非编码分子，在细菌生理功能及适应不断变化的环境过程中发挥着重要作用1,2,3。事实上，这些大分子处于众多复杂调控网络的核心，影响着代谢通路、应激反应，以及毒力和抗生素耐药性。逻辑上，它们的合成由特定的环境刺激触发（例如营养缺乏、氧化应激或膜应激）。大多数sRNA通过短而间断的碱基配对，在转录后水平调控多个靶标mRNA。它们通常通过与核糖体竞争翻译起始区来抑制翻译起始4。sRNA与mRNA形成双链结构后，还常常通过招募特定的核糖核酸酶，导致靶标mRNA被主动降解。
对sRNA靶标组（即其全部靶标RNA的集合）进行表征，有助于识别其参与的代谢通路及其可能响应的信号分子，从而通常可依据靶标组推断特定sRNA的功能。为此，已开发出多种基于计算机的预测工具，例如IntaRNA和CopraRNA5,6,7。这些工具主要依赖序列互补性、配对能量以及潜在相互作用位点的可及性，以确定可能的sRNA靶标。然而，预测算法并未整合所有影响体内碱基配对的因素，例如RNA伴侣蛋白8可能促进非最优相互作用，或两个分子是否共表达。由于存在固有局限性，预测工具的假阳性率仍然较高。大多数实验性的高通量方法依赖于使用带标签的RNA结合蛋白（RBP）共纯化相互作用的sRNA:mRNA复合物6,9。例如，RNA相互作用连接测序法（RIL-seq）鉴定了与大肠杆菌（Escherichia coli）中的RNA伴侣蛋白Hfq和ProQ共纯化的RNA双链体10,11。一种类似的技术称为杂交体紫外线交联、连接与测序法（CLASH），已被应用于纯化与大肠杆菌（E. coli）中RNase E和Hfq相关的sRNA12,13。尽管Hfq和ProQ在多种细菌中介导sRNA调控的作用已被广泛报道8,14,15，但在金黄色葡萄球菌（S. aureus）等若干生物体中，sRNA介导的调控似乎不依赖RNA伴侣蛋白16,17,18。尽管Waters及其同事已证明与RNase共同纯化RNA双链体是可行的13，但该方法仍具挑战性，因为RNase会迅速降解RNA。因此，在此类生物体中，MS2亲和纯化联合RNA测序（MAPS）方法19,20提供了一种可靠的替代方案。
与上述方法不同，MAPS 利用特定的小RNA（sRNA）作为诱饵来捕获所有与其相互作用的RNA，因此不依赖于RNA结合蛋白（RBP）的参与。整个流程如图1所示。简而言之，sRNA在其5’端标记有MS2 RNA适配体，该适配体可被MS2外壳蛋白特异性识别。该蛋白与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合，从而能够固定在淀粉样树脂上。因此，MS2-sRNA及其RNA互作伙伴将保留在亲和层析柱中。经麦芽糖洗脱后，通过高通量RNA测序结合生物信息学分析鉴定共纯化的RNA（图2）。MAPS技术最终可绘制出体内所有潜在RNA相互作用的互作图谱。
MAPS 技术最初在非致病性革兰氏阴性细菌 E. coli21 中得以实现。值得注意的是，MAPS 帮助鉴定出一种源自 tRNA 的片段，该片段可特异性地与 RyhB 和 RybB 两种 sRNA 相互作用，并在非诱导条件下阻止任何 sRNA 的转录噪声对 mRNA 靶标的调控。此后，MAPS 已成功应用于其他 E. coli sRNA，如 DsrA22、RprA23、CyaR23 和 GcvB24（表 1）。除了验证先前已知的靶标外，MAPS 还扩展了这些著名 sRNA 的靶标组。最近，MAPS 在鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）中也得以应用，揭示了 SraL sRNA 可结合编码转录终止因子的 rho mRNA25。通过这种配对，SraL 可保护 rho mRNA 免受 Rho 蛋白自身引发的过早转录终止。有趣的是，该技术不仅限于 sRNA，还可应用于其他类型的细胞 RNA，例如 tRNA 衍生片段26 和 mRNA 的 5’-非翻译区22（表 1）。
MAPS 方法也已适用于致病性革兰氏阳性菌 S. aureus19。 具体而言，由于革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌更厚，为有效裂解细胞并保持 RNA 完整性，裂解方案已进行了大幅修改。该优化后的方案已成功解析了 RsaA27、RsaI28 和 RsaC29 的相互作用组。该方法揭示了这些小 RNA（sRNAs）在调控细胞表面特性、葡萄糖摄取以及氧化应激反应等机制中的关键作用。
2015年在E. coli中开发并实施的实验方案最近已有详细描述30。本文提供了经过修改的MAPS实验方案，该方案特别适用于研究革兰氏阳性菌（细胞壁较厚）中的小RNA调控网络，无论其为非致病性或致病性细菌（需采取安全防护措施）。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNA 定量与质量检测</td></tr><tr><td>250 mL 培养瓶</td><td>Dominique Dutscher</td><td>2515074</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352051</td><td>培养物离心</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>Allegra X-12R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>细菌沉淀</td></tr><tr><td>氨苄青霉素（amp）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>培养基</td></tr><tr><td>淀粉树脂</td><td>New England BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2 亲和纯化</td></tr><tr><td>抗地高辛碱性磷酸酶 Fab 片段</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>自显影胶片盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>BHI（脑心浸液）肉汤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286</td><td>培养基</td></tr><tr><td>封闭试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>Northern 印迹分析（底物）</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Dominique Dutscher</td><td>508320-CER</td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>DIG-RNA 标记混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11277073910</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>DNase 处理</td></tr><tr><td>红霉素（ery）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Fluka 45673</td><td>培养基</td></tr><tr><td>FastPrep 裂解仪</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>机械裂解</td></tr><tr><td>硫氰酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>Hybridization Hoven Hybrigene 杂交炉</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>杂交管</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/6960/08</td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>LB（溶菌肉汤）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Lysing Matrix B 散装</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>机械裂解</td></tr><tr><td>MicroPulser 电穿孔仪</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td><td>超纯水</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>RNA/DNA 定量与质量检测</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Dominique Dutsher</td><td>10600002</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>清洁与去污染</td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Carl Roth</td><td>38.2</td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>MS2-MBP 蛋白表达</td></tr><tr><td>Poly-Prep 层析柱</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2 亲和纯化</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>Qubit 3 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>RNAPro 溶液</td><td>MP Biomedicals</td><td>6055050</td><td>机械裂解</td></tr><tr><td>ScriptSeq Complete 试剂盒</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>cDNA 文库制备</td></tr><tr><td>Spectrophotometer Genesys 20 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>SpeedVac Savant 真空浓缩仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DNA120</td><td>RNA 提取与纯化</td></tr><tr><td>Stratalinker UV 交联仪 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>TBE（Tris-硼酸-EDTA）缓冲液</td><td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100 梯度PCR仪</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>质粒构建</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>X射线胶片处理器</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>Northern 印迹分析</td></tr><tr><td>X射线胶片 Super RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>Northern 印迹分析</td></tr></tbody></table>

ms2亲和纯化联合rna测序在革兰氏阳性菌中的应用

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

尽管小调控RNA（sRNA）在细菌生命域中广泛存在，但由于难以鉴定其mRNA靶标，许多sRNA的功能仍表征不足。本文介绍了一种改良的MS2亲和纯化结合RNA测序（MAPS）技术方案，旨在体内揭示特定sRNA的所有RNA互作伙伴。总体而言，将MS2适配体融合至目标sRNA的5'末端，构建该融合表达系统并在体内表达，使MS2-sRNA能够与其细胞内互作分子结合。细菌收获后，通过机械裂解细胞获得裂解液。将粗提物加载至预先包被MS2蛋白（与麦芽糖结合蛋白融合）的淀粉样亲和层析柱中，从而特异性捕获MS2-sRNA及其相互作用的RNAs。洗脱后，通过高通量RNA测序及后续生物信息学分析鉴定共纯化的RNA。该方案已在革兰氏阳性人类病原体Staphylococcus aureus中成功实施，原则上可推广至其他任何革兰氏阳性细菌。综上所述，MAPS技术是一种深入探索特定sRNA调控网络的有效方法，可提供其完整靶标组（targetome）的快照。然而需注意的是，MAPS鉴定出的潜在靶标仍需通过其他互补的实验手段加以验证。

代表性结果来源于对S. aureus29中RsaC靶标组的研究。RsaC是一种非常规的长1,116 nt的小RNA，其5’端包含多个重复区域，而其3’端（544 nt）在结构上独立，并包含所有预测的与mRNA靶标相互作用的位点。当锰（Mn）缺乏时，该小RNA的表达被诱导，这种情况常出现在宿主免疫反应的背景下。利用MAPS技术，我们鉴定了多个与RsaC直接相互作用的mRNA，揭示了RsaC在氧化应激（sodA、ldh1和sarA）以及金属相关（znuBC-zur和sufCDSUB）应答中的关键作用。
MS2-sRNA 构建体及实验条件的验证 
在进行 MAPS 实验之前，确定所研究 sRNA 表达的最佳条件至关重要。如果使用非天然启动子，将有助于在靶标存在时有效表达 MS2-sRNA 构建体。此外，应从大小、稳定性、表达水平和功能等方面对 MS2-sRNA 构建体进行严格验证。MS2 适配体...

MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA 测序对其进行鉴定。该改进后的实验方案特别适用于革兰氏阳性细菌。&#160;

MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

尽管小调控RNA（sRNAs）在细菌生命域中广泛存在，但其中许多sRNAs的功能仍缺乏充分表征。

已开发出与RNA测序联用的MS2亲和纯化技术（MAPS），用于鉴定细菌中任意目标RNA的全部靶标组。该技术能够不依赖调控机制而鉴定各类小RNA（sRNA）的相互作用伙伴。对依赖sRNA的调控网络进行表征，将有助于更深入理解细菌毒力因子的产生、生物膜形成及其在宿主细胞内的存活机制，最终为抗击葡萄球菌感染提供支持。该方案可应用于任何致病性或非致病性革兰氏阳性细菌。演示本实验操作的是来自 Pascal Romby 博士实验室的博士研究生 Noemie Mercier。首先，将携带 pCN51 P3 MS2 sRNA 或 pCN51 P3 MS2 质粒的菌株单菌落分别接种于 3 毫升 BHI 培养基中，该培养基需添加 10 微克/毫升红霉素，每组设两个重复。将每种过夜培养物用50毫升新鲜的添加红霉素的BHI培养基稀释，使OD 600达到0.05。在37摄氏度、180 RPM振荡条件下培养6小时。将每种培养物转移至50毫升离心管中，在4摄氏度下以2,900 ×g离心15分钟，弃去上清液，将沉淀物在-80摄氏度冷冻保存，或置于冰上直接进行机械细胞裂解。为进行机械细胞裂解，将沉淀重悬于5毫升缓冲液A中，并将重悬的细胞转移至含有3.5克玻璃珠的15毫升离心管中。将离心管放入机械细胞裂解仪中，以每秒4米的速度运行一个40秒的循环程序。随后在2,900 ×g下离心15分钟，收集上清液并置于冰上保存。确保上清液澄清，若不澄清则重复离心。移除层析柱尖端，将层析柱放入柱架中，并用超纯水洗涤层析柱。加入 300 微升 amylose 树脂，并用 10 毫升缓冲液 A 洗涤层析柱。将 1,200 皮摩尔的 MBP-MS2 蛋白稀释于 6 毫升缓冲液 A 中，然后上样至层析柱中。用10毫升缓冲液A洗涤层析柱。接下来，进行MS2亲和纯化。将细胞裂解液上样至层析柱中，并用干净的收集管收集穿流组分。用10毫升缓冲液A洗涤层析柱三次，并收集每次的洗涤组分，然后用1毫升缓冲液E洗脱层析柱，并用2毫升微量离心管收集洗脱组分。收集的所有组分均需置于冰上，直至进行RNA提取。每个组分取1毫升用于RNA提取。向RNA中加入等体积的苯酚，剧烈混匀，然后在20摄氏度下以16,000 ×g离心10分钟。将上层相转移至一个干净的2毫升微量离心管中。加入等体积的氯仿-异戊醇，再次离心，然后将上层相转移至新的离心管中。加入2.5倍体积的100%冷乙醇和0.1倍体积的3摩尔/升乙酸钠（pH 5.2），在-20摄氏度下沉淀过夜。第二天，将离心管在4°C条件下以16,000 × g离心15分钟。用移液器缓慢吸出乙醇，注意不要扰动沉淀。加入500 µL预冷的80%乙醇，再以16,000 × g离心5分钟。用移液器缓慢吸去乙醇，然后在运行模式下使用真空浓缩仪干燥沉淀5分钟。将沉淀重悬于适量超纯水中。本实验方案用于研究金黄色葡萄球菌（S.aureus）中RsaC的靶标组。利用MAPS技术鉴定了多个直接与RsaC相互作用的mRNA，揭示了RsaC在氧化应激和金属相关反应中的关键作用。为验证MS2 sRNA构建体并观察其表达模式，在BHI培养基中培养2、4和6小时后收集细胞。提取RNA后，使用RsaC特异性的DIG探针进行Northern印迹分析。内源性 RsaC 的水平在生长六小时后显著升高。重要的是，MS2-RsaC 544 和 MS2-RsaC 1,116 在六小时时的水平与内源性 RsaC 相当。随后进行了亲和纯化，并从仅表达 MS2 标签的野生型菌株以及表达 MS2-RsaC 544 构建体的 RsaC 突变菌株的粗提物、穿流组分和洗脱组分中提取了 RNA。内源性RsaC长度为1,116个核苷酸，在洗脱组分中富集，但由于其长度和复杂的二级结构，与亲和柱发生了非特异性相互作用。MS2-RsaC 544在洗脱组分中高度富集，表明其被MS2-MBP融合蛋白成功捕获。生物信息学分析根据MS2 sRNA与MS2对照之间的倍数变化，预测了可能的mRNA靶标，结果显示sodA为首个潜在靶标。在MS2亲和纯化后，使用sodA特异性的DIG探针进行的Northern印迹分析显示，与MS2对照相比，sodA能够被MS2-RsaC 544高效地共富集。在尝试本方案时，需注意MS2标签的添加可能会影响sRNA的构象、稳定性或功能，应对此进行仔细监测。MAPS 可提供 sRNA-RNA 靶标配对的快照。进一步的实验验证将揭示其功能。该技术代表了一种强大的工具，可用于构建任何细菌中的 sRNA 调控网络。

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