恒河猴脂肪源性干细胞的分离、增殖与分化

脂肪来源干细胞的分离与扩增可产生大量干细胞，可用于多种后续应用和实验技术。本方案中分化脂肪细胞的主要预期用途是代谢检测，例如胰岛素刺激的葡萄糖摄取、脂质生成以及刺激性脂解。首先，通过消毒生物安全柜及所有工具，建立无菌工作环境。

用移液器将约10毫升的5倍PBS缓冲液加入四个100毫米细胞培养皿中。将50克脂肪组织样本放入其中一个培养皿中，并通过依次将其转移至其他含有5倍PBS的培养皿中清洗四次。然后将清洗后的脂肪组织转移至一个洁净的100毫米培养皿中，使用剪刀或无菌镊子充分剪碎。

取一到三厘米的剪碎组织，转移至含有13毫升胶原酶消化缓冲液的50毫升锥形管中。用2毫升胶原酶消化缓冲液冲洗培养皿中残留的组织，确保总体积为15毫升。使用25毫升血清移液管充分混匀样品，然后将锥形管置于37摄氏度摇床中孵育30至60分钟。

为了中和酶活性，在孵育后向管中加入 10 毫升 ADSC 增殖培养基，并用移液器充分混匀，以分离任何组织团块。将液体部分转移至新的无菌 50 毫升锥形管中，留下固体组织。用 7 毫升 PBS 缓冲液洗涤组织三次，并将每次洗涤后的液体转移至新管中。

接下来，将离心管在500 × g条件下离心5分钟，然后小心地尽可能去除上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于1毫升1倍浓度的红细胞（RBC）裂解缓冲液中，在室温下孵育10分钟。随后，向离心管中加入5毫升ADSC生长培养基，通过离心去除上清液，重复洗涤细胞两次。

最后一次洗涤后，将沉淀重悬于2毫升ADSC生长培养基中，经70微米细胞滤网过滤至无菌的50毫升锥形管中。用额外2毫升培养基冲洗滤网，然后将4毫升细胞悬液转移至无菌的100毫升培养皿中。再用每份3毫升的培养基冲洗锥形管两次，将冲洗液一并加入培养皿，使培养皿中总体积达到10毫升。

在倒置显微镜下以10倍物镜观察收集的细胞，检查是否有悬浮细胞。将细胞置于二氧化碳培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳和100%相对湿度条件下培养24小时。为确保培养基的无菌性，需设置仅含培养基的对照孔板。

24小时后，在倒置显微镜下观察细胞，检查细胞贴壁情况。每48小时更换一次培养基，使用预热的培养基，直至细胞融合度达到80%至90%。进行增殖实验时，移除融合的ADSC细胞的生长培养基，用两毫升无菌室温PBS洗涤细胞两次。

吸去 PBS，向每块培养板中加入 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶 EDTA，使其覆盖整个培养板表面。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 7 分钟，然后通过强力吹打使消化后的细胞脱落。加入 2 毫升 ADSC 增殖培养基，轻轻混匀细胞。

将细胞转移至一个50毫升的锥形管中，用额外的2毫升培养基冲洗培养皿，以确保从培养板中最大程度地回收细胞。接下来，在室温下以500 × g离心5分钟，弃去上清液以获得细胞沉淀。按每百万细胞加入5至6毫升ADSC生长培养基重悬细胞沉淀。

使用血细胞计数板对细胞进行计数，并按照文稿中所述方法进行接种。当细胞融合度达到80%至90%时，吸除生长培养基，用无菌室温PBS洗涤细胞，然后加入10毫升ADSC成脂分化培养基。每3天更换一次培养基，持续约14至21天。

在倒置显微镜下以 40 倍放大观察细胞中脂滴的存在情况。通常在培养 14 天后可观察到成熟的脂肪细胞。接种当天，脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）呈非贴壁状态，在培养液中漂浮。

72小时后，细胞融合度达到80%，可进行脂肪细胞分化。在ADSC分化14天后，成熟的脂肪细胞表现出明显的成脂特征，在40倍放大倍数下可见。第14天，细胞经油红O和BODIPY染色和固定，以观察脂滴。

在20倍放大倍数下可观察到已分化的脂肪细胞。在尝试本方案时，需牢记无菌工作环境对于脂肪来源干细胞的健康分离、充分扩增及高效分化至关重要。按照本方法处理后，这些细胞可用于多种代谢检测，例如葡萄糖摄取、脂质生成和脂解作用，这些正是我们研究的主要重点。

该技术可用于研究慢性酒精摄入和SIV感染对脂肪细胞代谢能力的影响。