低温样品加载到魔法角度旋转核磁共振光谱仪中，可保持细胞生存能力
September 1st, 2020
这里介绍了冷冻样品低温传输到动态核极化 （DNP） 神奇角度旋转 （MAS） 核磁共振 （NMR） 探测器的协议。该协议包括实验前转子存储方向和实验前后可行性测量方向。
DNP 辅助 MAS NMR 波谱的灵敏度使我们能够表征完整细胞内内内源性浓度的蛋白质。此应用需要仔细处理样品。当使用该方案将一些形态低温转移到光谱仪中时，它们保留了一些形态并且细胞是活的。
引入冷转子会导致水分和冰积聚，从而机械地阻止样品旋转。该演示将指导实验自信地进行低温转移。首先，将一张纸巾或纸巾制成的垫子放在盖子下方和低温小瓶底部。
将 3.2 毫米蓝宝石转子放入填充有薄纸的低温样品瓶中，标记端朝向样品瓶底部。将样品瓶放入受控速率冷却容器中，缓慢冷冻转子，并将容器放入 80 摄氏度的冰箱中至少三小时。将含有冷冻转子的冻存管转移至装满液氮的小真空瓶中。
使用真空瓶将样品运送到光谱仪设施。将干燥、隔热、广口泡沫真空瓶中加入 500 毫升至 1 升液氮。从转移瓶中取出冻存管，将其保持在液氮表面上方，以保护其免受大气影响。
握住冻存管，使冻存管口略微朝下，拧开瓶盖，让转子滑入液氮浴中。将 1.5 mL 微量离心管浸入液氮中，对其进行预冷。在液氮浴表面下，用镊子将转子转移到微量离心管中，驱动尖端朝向管底部，标记朝向开口。
使用镊子将装有转子的转子的管子的颈部固定在液氮下。用第二对镊子，将 NMR 样品捕集器保持在液氮表面上方，液氮相对于微量离心管呈锐角倾斜。要将转子从 NMR 样品捕集器转移到 NMR 波谱仪，请按 eject（弹出）将冷冻柜置于弹出模式。
将 NMR 样品捕集器的开口端插入微量离心管中，同时仍位于液氮表面下方。抬起微量离心管和 NMR 捕集器，使转子落入捕集器中。如果转子卡在边缘上，请摇晃样品捕集器和试管。
将空微量离心管留在 NMR 样品捕集器顶部，以保护转子免受空气的影响。从探头中取出另一个空的样品收集器，并将其放在地板上。将包含转子的 NMR 样品捕集器转移到另一只手上。
然后取出微量离心管并立即将其插入探针中。向作冷冻柜的人员发出信号，使其按下、停止、弹出和插入。通过调整轴承和驱动流压，将样品旋转至所需的旋转速率。
将 500 毫升至 1 升液氮倒入广口泡沫真空瓶中，并将浴槽置于光谱仪下方。将装有一张薄纸的空低温样品瓶浸入液氮浴中。通过降低驱动和轴承气流，将旋转速率降低到零 kHz，并通过切换到顶出模式来顶出转子。
在保持弹出模式开启的同时，从探针上取下样品捕集器，将转子直接放入含有液氮的广口泡沫瓶中。使用预冷的镊子，将转子转移到液氮表面下的预冷低温样品瓶中。将低温样品瓶盖浸入液氮中，使其预冷。
从浴中取出装有转子和液氮的小瓶，然后用预冷的盖子盖住试管。将冻存管重新浸入液氮中。样品可以转移到长期液氮储存中或立即打开包装以进行进一步分析。
将哺乳动物细胞的预冷冻样品低温插入 NMR 波谱仪中，支持整个 NMR 实验的活力。使用该方案，MAS NMR 后哺乳动物细胞的台盼蓝通透性与未暴露于任何温度变化的细胞相似。如果细胞缓慢冷冻，然后在插入前加热至室温，细胞活力将降至 10% 以下同时，在整个 NMR 实验中，哺乳动物细胞冷冻样品的低温插入支持细胞活力。
尝试执行方案时，请请求帮助按压弹出并旋转样品，以便样品可以在探头预热之前引入探头，确保没有水分进入探头，确保光谱仪将低温运行数周。该方案适用于温度波动可能损害样品完整性的任何系统，例如冷冻淬灭反应，或捕获反应中间体的表征、酶学和蛋白质折叠。
概览
该协议详细说明了将冷冻样品低温转移到魔角旋转（MAS）核磁共振（NMR）探头中的过程，重点是保持样品的完整性和活力。它针对的是在将转子引入光谱仪时水分积累的挑战，确保细胞在整个实验过程中保持其功能特性。
关键研究组成部分
研究领域
- 动态核极化（DNP）核磁共振光谱学
- 生物学研究中的样品处理
- 实验过程中的细胞活力
背景
- DNP对于研究完整细胞中的蛋白质的重要性
- 低温转移过程中水分和冰分积累的挑战
- 通过协议保持细胞活力的重要性
使用的方法
- 使用热绝缘系统进行冷冻样品的低温转移
- 哺乳动物细胞作为生物系统
- 核磁共振（NMR）技术
主要结果
- 在NMR实验中成功保持了细胞活力
- 特拉帕蓝透过性显示冷却和未冷却细胞的活力相似
- 该协议验证了低温方法在样品处理中的有效性
结论
- 该研究展示了将样品插入NMR探头的有效低温方法
- 该协议提高了涉及温度敏感样品的生物学实验的可靠性
常见问题
Executive Industry Relevance
Cryogenic sample handling enables preservation of cellular integrity for dynamic nuclear polarization NMR studies of intracellular proteins at endogenous concentrations. This approach supports target validation in native cellular environments by maintaining viability through low-temperature transfer. The protocol addresses a key bottleneck in applying high-sensitivity NMR to drug discovery workflows requiring mechanistic de-risking of therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by characterizing proteins inside intact cells at physiological concentrations.
- Operational Value: Preserves cellular viability during NMR experiments, reducing false negatives from sample degradation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through structural data obtained under near-native conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, atom-level readouts of protein-ligand interactions in cryopreserved cellular systems.
- Operational Value: Standardizes sample introduction to minimize variability from ice accumulation or moisture interference.
- Assay Readiness: Enables reproducible preparation of frozen rotor samples for high-sensitivity DNP-MAS NMR screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural biology with preclinical validation by maintaining sample integrity across workflows.
- Disease-Relevant System: Applicable to mammalian cell models used in target validation and pathway elucidation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on structural data from viable, endogenous-state samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling structural characterization after target identification and before lead optimization, particularly for intracellular targets requiring native-cell context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing atomic-resolution data on proteins in viable cells.
- Screening: Ensures assay reproducibility through controlled cryogenic transfer that prevents moisture-related spinning failures.
- Analytics: Generates quantitative structural and dynamic measurements that inform target confidence and ligand-binding assessments.
- Translational Research: Maintains continuity from cellular target validation to preclinical models by preserving sample integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for cryogenic handling of temperature-sensitive biological samples across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation via structural data from intact, viable cells.
- Operational Value: Standardization and reproducibility in sample transfer, reducing experimental failure from moisture or ice buildup.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions through reliable mechanistic data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural feasibility in native cellular environments.
Implementation Considerations
- Expertise in cryogenic sample handling and NMR probe operation.
- Access to controlled-rate cooling equipment, liquid nitrogen dewars, and thermally insulated transfer flasks.
- Standardization of transfer procedures across teams to ensure consistent sample integrity.
- Adaptation considerations for different rotor types or cell lines while maintaining low-temperature chain.
- Practical limitation: Requires rapid execution to prevent warming during transfer, necessitating trained personnel coordination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Cryopreservation of Mammalian Cells in an NMR Rotor
1:25
Cryogenic Transfer of a Frozen Sample into the NMR Spectrometer
3:48
Cryogenic Removal of the Sample from the NMR Spectrometer
5:02
Results: Cryogenic Insertion of a Pre-frozen Sample of Mammalian Cells Results in Cellular Intactness Similar to Never-frozen Mammalian Cell Samples
5:47
Conclusion
