将低温样品装入魔角旋转核磁共振波谱仪并保持细胞活性的方法

DNP 辅助的魔角旋转核磁共振波谱技术的灵敏度使我们能够在天然浓度下对完整细胞内的蛋白质进行表征。该应用需要谨慎的样品处理。采用本方案将样品低温转移至波谱仪时，可保持某些形态结构，并维持细胞活性。

引入冷转子可能导致水分和冰的积聚，从而在机械上阻碍样品的旋转。本演示将指导实验人员自信地进行低温转移操作。首先，在低温小瓶的瓶盖下方和底部放置由一小块纸巾或餐巾纸制成的垫片。

将标记端朝向管底的3.2毫米蓝宝石转子放入垫有纸巾的低温冻存管中。将冻存管置于可控降温容器中，于-80 °C超低温冰箱中缓慢冷冻至少三小时。将装有已冷冻转子的低温冻存管转移至装有液氮的小型真空保温瓶中。

使用真空瓶将样品运送至光谱仪设施。用500毫升至1升液氮填充一个干燥、隔热、宽口的泡沫真空瓶。从转运瓶中取出低温冻存管，并将其保持在液氮表面略上方，以防止其接触空气。

手持冷冻管，管口略向下倾斜，拧开管盖，使转子滑入液氮浴中。将一个1.5毫升微量离心管浸入液氮中进行预冷。在液氮浴液面以下，用镊子将转子转移至预冷的微量离心管中，确保驱动端朝向管底，标记面朝向管口。

使用镊子夹住装有转子的离心管管颈，将其置于液氮中。用另一对镊子将核磁共振样品捕集器置于液氮表面之上，并使其相对于微型离心管呈锐角倾斜。为将转子从核磁共振样品捕集器转移至核磁共振波谱仪，请按下弹出按钮，将低温柜设置为弹出模式。

将核磁共振样品捕集器的开口端插入微量离心管中，同时保持其处于液氮液面以下。提起微量离心管和核磁共振样品捕集器，使转子落入样品捕集器中。若转子卡在管口边缘，可轻轻晃动样品捕集器和离心管。

将空的微量离心管放在核磁共振样品捕集器顶部，以遮挡转子免受空气影响。取下探头上另一个空的样品捕集器，并将其放置在地面上。将装有转子的核磁共振样品捕集器转移到另一只手中。

然后取出微量离心管，立即插入探头中。示意操作冷冻柜的人员按下停止喷出并插入按钮。通过调节轴承和驱动气流压力，将样品加速至所需的旋转速度。

将500毫升至1升液氮倒入宽口泡沫真空瓶中，并将该冷却浴置于波谱仪下方。将装有滤纸片的空低温小瓶浸入液氮浴中。通过逐步降低驱动气和轴承气流量，将转速降至0千赫兹，然后切换至弹出模式以弹出转子。

保持弹射模式的同时，将样品收集器从探头中取出，并将转子直接放入装有液氮的宽口泡沫瓶中。使用预冷的镊子，在液氮液面下将转子转移至预冷的低温冻存管中。通过将低温冻存管盖浸入液氮中，对其进行预冷。

从液氮浴中取出含有转子和液氮的小瓶，并用预冷的盖子盖紧试管。将冷冻小瓶重新浸入液氮中。样品可转移至长期液氮储存环境中，或立即取出进行后续分析。

将哺乳动物细胞的预冷冻样品以低温插入方式置入核磁共振（NMR）波谱仪，可在整个NMR实验过程中维持细胞活性。采用本方案，经魔角旋转（MAS）NMR处理后，哺乳动物细胞的台盼蓝通透性与未经历任何温度变化的细胞相似。若细胞经缓慢冷冻后再升温至室温再插入，则细胞活性会下降至不足10%。相比之下，将哺乳动物细胞的冷冻样品以低温插入方式处理，可在整个NMR实验过程中保持细胞活性。

在执行该方案时，应请求协助，及时按下弹出按钮并快速离心样品，以便在样品升温前将其引入探头中，同时确保无水分进入探头，以保证波谱仪在接下来数周内保持低温运行。该方案适用于任何因温度波动可能影响样品完整性的体系，例如冷冻淬灭反应、被捕获的反应中间体的表征、酶学研究以及蛋白质折叠实验。