Name: 4D显微镜:使用Nomarski显微镜揭示 秀丽隐杆线虫 胚胎发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解使用4D显微镜和Nomarski光学技术对秀丽隐杆线虫胚胎进行细胞谱系追踪的方法。该技术可在单细胞水平重建发育过程，无需转基因或荧光标记，适用于发育生物学研究。

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作者希望感谢拉里奥哈健康基金会（Fondos FEDER）以及西班牙科学、创新与大学部（MCIU）（项目编号：PGC2018-094276-B-I00）提供的支持。Cristina Romero Aranda 由西班牙抗癌协会（AECC）提供的奖学金资助。

1. 在培养皿中培养秀丽隐杆线虫（C. elegans）
<ol>
	<li>制备 NGM 平板，并接种 E. coli OP50 作为食物来源（图 1）。按照文献所述方法培养和维持 C. elegans17。将已接种的平板在 4 °C 保存，最多可保存一个月。</li>
	<li>在添加线虫之前，将平板调整至所需温度。
	<ol>
		<li>转移线虫时，从旧平板上切下一小块含线虫的琼脂，转移到新平板上。</li>
		<li>或者，使用无菌线虫挑取工具（将一段1英寸长、32号规格的铂丝，其末端压扁，固定在巴斯德移液管尖端）捕获单个线虫个体，并将其转移至新平板上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在所需温度下培养线虫。
	<ol>
		<li>C. elegans 的标准培养温度为 20 °C。然而，若需分析温度敏感型突变体的发育情况，通常需在 25 °C 下进行过夜培养。根据具体突变体的特性，可相应调整培养的持续时间和温度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在固定胚胎前准备4D显微成像记录（图2）
<ol>
	<li>在准备胚胎之前，先设置好显微镜和温度控制系统。C. elegans 胚胎分裂非常迅速，因此在将胚胎装片后应立即开始记录。</li>
	<li>将记录温度调节至 15 °C、20 °C 或 25 °C。
	<ol>
		<li>通常在 25 °C 下记录胚胎。对于温度敏感型突变体，应在限制性温度下进行记录以展示其表型。若在不同样本中进行对照实验，野生型（WT）对照组应与突变体在相同温度下记录。 
		注意：野生型胚胎在 25 °C 下发育较快，在 15 °C 下较慢，但细胞谱系无其他额外差异。应将显微镜置于温度可控的房间内。通过冷却或加热载玻片来实现进一步的温度控制是十分理想的。可通过在显微镜物镜和聚光镜周围的金属环中循环特定温度的水来实现该控制。物镜与样品之间通过浸油直接接触，从而实现高效的温度传递。该系统可精确控制记录温度，并可在胚胎发育过程中实施温度转换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜软件中设定记录参数。
	<ol>
		<li>对于标准的 C. elegans 记录（不含荧光扫描），选择以下参数： 
		30 层焦平面的 z 层切，每层间距为 1 微米。 
		每组 z 层切开始之间间隔 30 秒。 
		共采集 1500 组 z 层切（记录时长为 12.5 小时）。 
		注意：可使用商业或开源的显微镜控制程序来设定此图像采集流程。现在显微镜已准备就绪，可以开始记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备并固定胚胎
<ol>
	<li>获得良好图像的第一步是制备一层薄而均匀的琼脂垫（图3）。
	<ol>
		<li>在50 ml去离子水中配制4.5%的琼脂溶液。用微波炉加热至沸腾，然后将0.5–1 ml溶液倒入3 ml玻璃试管中。</li>
		<li>用封口膜小心密封试管，防止干燥。密封后的琼脂试管可在室温下保存长达两个月。</li>
		<li>在实验台上准备一个80 °C的加热金属块，其中放置： 
		一支装有纯凡士林（已熔化）的试管，并在其中插入一把细毛刷。 
		一支装有蒸馏水的试管，内含一支巴斯德移液管。 
		注意：这可确保所有所需材料均处于高温状态，从而在制备琼脂垫过程中防止琼脂凝固。</li>
		<li>取一支琼脂试管，移除顶部封口膜，并小心地在酒精灯上加热以熔化琼脂。操作时需谨慎，因高温琼脂可能从玻璃管中喷出并造成烫伤。</li>
		<li>琼脂完全熔化后，将其放入加热金属块中，以维持液态。</li>
		<li>或者，在实验开始前1小时将琼脂试管放入加热金属块中，无需使用酒精灯即可完成熔化。熔化的琼脂应在一天后丢弃。</li>
		<li>将一张载玻片（载玻片A）置于塑料片上，并用另外两张载玻片夹住固定。</li>
		<li>取另一张载玻片（载玻片B），用手握住。</li>
		<li>用另一只手使用预热的巴斯德移液管，在载玻片A中央滴加一小滴熔化的琼脂。</li>
		<li>立即用载玻片B压住琼脂液滴，使A、B载玻片之间形成一层极薄的琼脂垫。保持这两张载玻片夹合状态，直至步骤3.2.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定胚胎。
	<ol>
		<li>用挑虫针收集5–10条成年雌雄同体线虫，放入盛有水的钟表匠玻璃皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用解剖刀切开雌雄同体线虫，从子宫中取出早期卵（1–4细胞期）。</li>
		<li>取步骤3.1.10中的载玻片，轻轻滑动移下载玻片B，暴露出载玻片A上的琼脂垫。</li>
		<li>用毛细移液管将一个早期卵移至琼脂垫中央。</li>
		<li>或者，将含有多个胚胎的液滴移至琼脂垫上，然后在体视显微镜下寻找处于早期发育阶段的胚胎。</li>
		<li>如有必要，可用粘附在牙签末端的睫毛轻推卵，以调整其位置。</li>
		<li>用毛细移液管吸除多余水分。 
		注意：可通过在酒精灯上加热巴斯德移液管并从两端拉伸，轻松制备毛细移液管。</li>
		<li>小心地盖上盖玻片。为避免产生气泡，先将盖玻片的一边接触载玻片，再用解剖刀沿相邻边缘缓慢、倾斜地推动，使盖玻片逐渐覆盖样品。</li>
		<li>用移液管向琼脂垫周围空间注入水，填充约3/4体积，保留1/4为空气。</li>
		<li>用凡士林密封盖玻片边缘，防止长时间记录过程中样品干燥。</li>
		<li>用细毛刷将一层薄薄的熔化凡士林均匀涂抹于盖玻片四周。 
		注意：此时样品已准备就绪，可进行记录。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 调整微分干涉差（DIC）并开始4D显微成像记录
<ol>
	<li>将载玻片置于显微镜载物台上。使用低倍物镜（5x 或 10x）对胚胎进行聚焦。</li>
	<li>切换至 100x 油浸物镜。</li>
	<li>调节显微镜的光学组件以获得诺马尔斯基（Nomarski）图像。
	<ol>
		<li>聚焦聚光镜。</li>
		<li>完全打开聚光镜的孔径光阑，并关闭视场光阑（这将提供更高的数值孔径，从而获得更高的分辨率）。</li>
		<li>检查显微镜上的两个偏振器是否已调整至使光线衰减达到最大。</li>
		<li>旋转沃拉斯顿棱镜，以获得胚胎一侧照明的清晰三维图像；将棱镜向相反方向旋转，则可获得胚胎另一侧照明的效果。 
		注意：这些步骤可在正式记录前于测试样品上完成，以便在分析实际样本时仅需进行细微调节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动显微镜的图像采集功能。</li>
</ol>
5. 分析4D电影（图4）。
注意：记录完成后，使用细胞谱系追踪软件重建并分析细胞谱系。
细胞谱系追踪软件是一种强大的工具，可用于对胚胎发育过程或细胞培养物及组织碎片中的动态过程进行详细分析。该程序可提取并量化样本中细胞动态的多个数据集，包括记录的每一个细胞的完整细胞谱系，以及细胞分裂、细胞周期长度、迁移或凋亡过程及其动力学参数。此外，还可通过细胞形态变化或特定标记物的表达来评估细胞分化情况。软件界面通常包含两个窗口：左侧窗口可用于正向或反向播放4D影像，也可在不同层面（从顶部到底部）上下切换，从而在时间和空间上追踪每一个细胞。右侧窗口则用于生成细胞谱系。在4D影像中点击某个细胞核，会在谱系窗口中生成一个对应的数据点，记录该细胞的名称、命运及其空间坐标信息。通过在4D影像中正向播放并周期性点击特定细胞的细胞核，标记其随时间发生的有丝分裂事件，即可构建该细胞的谱系。对所有记录的细胞重复此操作，便可获得整个胚胎或样本的完整细胞谱系。每个细胞的空间坐标信息随后可用于重建三维胚胎模型及细胞迁移路径。
<ol>
	<li>打开谱系追踪软件，通过点击顶部菜单栏并选择： 
	文件 | 新建项目，创建一个新项目。</li>
	<li>根据记录温度选择相应的细胞谱系模板：在 25 °C 下记录时选择 DB08，在 20 °C 下记录时选择 DB10，在 15 °C 下记录时选择 DB12。</li>
	<li>在弹出的窗口中设置记录参数：扫描次数（通常为 1500）、扫描间隔时间（30 秒）、层数（30）以及层间距离（1 微米）。</li>
	<li>选择图像文件和格式。
	<ol>
		<li>选择保存图像的目录路径。</li>
		<li>选择图像应保存为单张图像（每个层面和时间点单独一张图像）还是多图像 z 轴堆栈（multi-image z-stacks）。</li>
		<li>确定文件命名规则和图像格式。常规情况下，单张图像按以下方式命名： 
		X0000L00C1（表示第 0 次扫描，第 0 层，第 1 通道） 
		X0000L01C1（表示第 0 次扫描，第 1 层，第 1 通道） 
		X0000L02C1（表示第 0 次扫描，第 2 层，第 1 通道） 
		... 
		X0001L00C1（表示第 1 次扫描，第 0 层，第 1 通道） 
		X0001L01C1（表示第 1 次扫描，第 1 层，第 1 通道） 
		... 
		X0300L04C1（表示第 300 次扫描，第 4 层，第 1 通道） 
		... 
		注意：将图像以压缩格式保存可节省硬盘空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义光学通道：通道 1 用于 DIC 光学，通道 2 用于 GFP，通道 3 用于 RFP，依此类推。添加在 4D 记录中使用的所有通道，并勾选“启用通道处理”以实现检测。</li>
	<li>开始追踪胚胎的细胞谱系。此时屏幕包含两个主要窗口：视频窗口和细胞谱系窗口。
	<ol>
		<li>在谱系窗口中选择一个谱系分支，并使用鼠标在视频窗口中点击对应于此细胞的细胞核。</li>
		<li>通过使用光标键前后播放 4D 影像，或上下切换层面，实现对细胞在空间和时间上的追踪。</li>
		<li>周期性地点击细胞核。这将在谱系分支中生成一个点，并记录该时刻细胞的空间坐标。由此可推进细胞谱系构建，并实现胚胎的 3D 重建。</li>
		<li>通过按下回车键标记有丝分裂事件。然后选择其中一个子代细胞，并如前所述继续追踪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对剩余的胚胎细胞重复上述过程（步骤 5.6.1 至 5.6.4），以追踪完整的细胞谱系，或追踪特定感兴趣细胞（例如发生凋亡的细胞）。</li>
	<li>将突变体谱系与标准的野生型 C. elegans 细胞谱系进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

现代生物学的主要挑战之一是理解多细胞生物的发育过程。C. elegans 已成为研究胚胎发育过程中细胞增殖与细胞分化之间精细协调的最佳模型之一。从光学角度来看，其透明的身体和较小的体型使这种线虫成为微分干涉差显微镜（DIC显微镜）的理想样本。其他具有类似特征的生物也已用于4D显微镜分析11,12,13,14,15,16。
对于这些发育生物学研究而言，通过正向或反向遗传学方法使基因失活，可为基因在胚胎发生过程中的作用提供线索。一旦证实某个基因在发育过程中发挥作用，下一步便是明确其在正确体轴模式建立中的具体功能。免疫染色是大多数模式生物中首选的研究方法。该技术能够揭示细胞分化或特定标志物表达方面的问题。然而，这种方法的主要局限性在于，它仅能提供在发育某一固定时间点上单个或多个标志物表达的静态图像。要获得这些标志物在整个发育过程中动态变化的视图，只能通过在不同时间点对不同的胚胎进行染色来实现。此外，在此类固定样本中无法进行细胞谱系重建。
4D显微镜技术是研究胚胎发育的一种互补方法。该技术能够在细胞水平分辨率下揭示发育的动态过程。胚胎中的任何缺陷，例如纺锤体取向异常、细胞迁移障碍、细胞凋亡、细胞命运决定等问题，都会在可正向和反向播放的4D录像中显现出来，研究人员可对其进行定量分析和评分。利用该技术，几乎可以追踪胚胎中每一个细胞，直至胚胎开始运动为止。仅使用可见光和诺马尔斯基光学系统进行4D显微观察的胚胎不会产生光损伤。在记录过程中也可插入荧光扫描，以检测基因表达的时间和空间位置。因细胞周期延长而表现出显著光损伤的胚胎，通常是由强紫外照射所致，与标准野生型谱系胚胎相比可被识别。在此情况下，可通过降低紫外灯强度并提高相机灵敏度或曝光时间来减少光损伤。形态学特征和分子标记有助于阐明任何突变体的胚胎发育过程。
在实验室中搭建4D显微成像系统易于实现，经过一定练习后，可对细胞培养物及活体透明样本进行无与伦比的细胞动态分析和细胞谱系追踪，分辨率达到显微镜视野中每一个单细胞的水平。目前基于微分干涉差（DIC）图像的细胞谱系追踪仍主要依赖人工完成，耗时较长，尽管软件能够检测出某些谱系错误（例如不同谱系分支标记了同一个细胞），但仍可能存在人为误差。虽然针对GFP标记细胞的自动识别技术已较为成熟2，但基于无标记细胞和可见光图像的互补性谱系追踪软件仍处于早期发展阶段，尚无法真正有效地用于完整胚胎的分析。毫无疑问，将图像识别系统应用于可见光显微镜领域，将极大推动该领域的进步。

4D显微镜是一种多焦点延时记录系统，可使研究人员在空间上以及随时间变化的过程中，记录并量化生物样本的细胞动态。细胞培养物、酵母或活体组织均可进行4D分析，但该技术特别适用于活体胚胎发育过程的分析。该分析的分辨率可达到胚胎中每一个单细胞的水平。每一次细胞分裂均可被检测，细胞的运动也可随时间被追踪。细胞命运的判断依据是细胞所获得的位置和形态。使用诺马尔斯基光学系统可通过正交偏振光束在焦平面处的干涉，增强未染色透明样本的对比度。所获得的图像呈现三维效果，并从一侧受光照明。
已开发出其他基于共聚焦显微镜和GFP转基因动物的方法，用于细胞核的自动检测及细胞谱系的构建1,2。这些系统的优势显而易见：软件大大减少了长时间内手动标记每个细胞核的需求（尽管在后期阶段仍需一定程度的人工监督）。然而，涉及细胞形态变化或膜动力学的细胞过程，例如细胞分化、迁移、凋亡或凋亡细胞的吞噬过程，在荧光标记的细胞核图像中仍隐藏于黑色背景之下，无法被观察到。
相比之下，4D Nomarski显微镜技术（也称为微分干涉差显微镜，DIC显微镜）能够显示野生型或突变型动物发育过程中发生的细胞核和细胞形态变化。该方法仅需使用透射光，借助常规显微镜即可实现细胞谱系追踪。通常无需使用转基因动物，除非需要展示特定的表达模式，此时可插入荧光扫描图像。因此，对于研究胚胎发生或细胞凋亡等可在DIC显微镜下清晰观察的动态细胞过程的许多实验室而言，这可能是一种最佳方法3,4,5,6,7。
目前有多种灵活且用户友好的程序可用于捕获显微图像，并对记录样本中的细胞谱系、三维模型、细胞迁移路径等进行重建。在标准实验中，图像以一系列焦平面采集，各平面间距离恒定，焦平面数量取决于样本厚度。通过提高扫描频率，可优化分析的时间分辨率。记录时长几乎不受限制，仅受计算机存储容量制约。例如，在对C. elegans胚胎发育进行分析时，我们通常每30秒采集一次图像，共采集30个焦平面（每个步进1微米），持续12小时。
这些系统已被应用于多种动物胚胎的分析，例如 秀丽隐杆线虫8,9,10, 黑腹果蝇11, 其他线虫胚胎12,13，缓步动物14,15 甚至早期小鼠胚胎16唯一的条件是拥有一个透明的胚胎，能够在显微镜下的载玻片标本上正常发育。
总之，基于微分干涉差（DIC）的4D显微技术特别适用于以下研究：1）分析小型透明动物的胚胎发育过程，如细胞谱系追踪、细胞迁移路径记录、三维模型构建等；2）确定基因表达模式；3）研究从酵母到人类细胞的细胞培养动态；4）分析组织动态或胚胎片段行为；5）定量分析细胞死亡动力学及细胞残骸的吞噬过程；以及6）基于胚胎发育特征进行比较系统发育分析。如果对上述任一主题（或类似主题）感兴趣，均可采用4D显微技术进行研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG（秀丽隐杆线虫遗传中心）</td><td>N2</td><td>野生型 C. elegans 菌株。可通过 GCG（秀丽隐杆线虫遗传中心）申请：https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG（秀丽隐杆线虫遗传中心）</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans 突变菌株。可通过 GCG（秀丽隐杆线虫遗传中心）申请：https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>细胞谱系追踪软件</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>该软件用于重建胚胎细胞谱系。详细说明请访问：http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>适用于透射光和紫外光的显微镜相机</td></tr><tr><td>显微镜控制软件</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>该软件用于控制显微镜进行4D图像采集。可通过以下地址申请：Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, 电话：++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>显微镜控制软件</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>该软件用于控制显微镜进行4D图像采集。可从以下网址下载：https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>电动显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>用于进行4D显微成像的电动正置显微镜</td></tr><tr><td>分子生物学实验室的标准设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>用于操作线虫和制备胚胎的体视显微镜。</td></tr></tbody></table>

4d显微技术：揭示 秀丽隐杆线虫 使用微分干涉差显微镜观察胚胎发育

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D显微镜是解析不同动物胚胎发育过程的宝贵工具。在过去的几十年中，Caenorhabditis elegans 已成为研究发育生物学的最佳模型之一。从光学角度来看，其体型小且身体透明，使这种线虫成为微分干涉差（DIC，又称诺马尔斯基）显微镜观察的理想样本。本文介绍了一种培养 C. elegans 线虫、制备和封片其胚胎、进行4D显微成像以及细胞谱系追踪的实验方案。该方法基于多焦平面的时间序列诺马尔斯基图像记录，并利用特定软件进行分析。该技术可在细胞水平上揭示胚胎发育的动态过程。任何突变体中的胚胎缺陷，例如纺锤体取向异常、细胞迁移障碍、细胞凋亡或细胞命运决定问题，均可被高效地检测和量化。几乎可以追踪胚胎中每一个单个细胞，直至胚胎开始运动为止。通过4D DIC显微镜追踪 C. elegans 胚胎的完整细胞谱系虽然工作量较大，但借助专用软件可极大简化这一过程。此外，该技术易于在实验室中实施。4D显微镜是一种多功能工具，为胚胎发育的无与伦比的分析提供了可能。

表征胚胎发育过程 秀丽隐杆线虫 基因突变体 gsr-1，该基因编码谷胱甘肽还原酶，这种酶负责再生还原型谷胱甘肽（GSH），并在维持线虫氧化还原稳态中起作用，我们对一个进行了4D显微成像 gsr-1 (tm3574缺失突变体，该突变等位基因为功能丧失型，导致早期胚胎发育停滞表型18. 野生型和平衡的 gsr-1 (tm3574）突变体 秀丽隐杆线虫 线虫在接种有细菌的NGM平板上培养 E. coli 以OP50作为食物来源17. gsr-1 (tm3574) 蠕虫以杂合子形式培养 20 °C 经过两代培养后，将分离出的纯合子线虫（依赖母源负载得以发育至成虫）转移至 25 °C 在胚胎分析前进行过夜孵育。线虫培养板置于纸板箱中孵育，以避免冷凝水形成。图1将怀卵的线虫切开以提取早期胚胎。
为了在相同条件下比较突变体与典型野生型（WT）的胚胎发育，将一个野生型（作为对照）和一个gsr-1 (tm3574) 胚胎并列放置在同一制片上。使用配备微分干涉差（DIC）光学系统的标准电动正置显微镜进行4D显微成像。显微镜控制程序中设置的记录参数如下：每个z层扫描包含30个焦平面，层间距离为1微米，每组z层扫描之间间隔30秒，共采集1500组z层扫描（记录时长为12.5小时）。记录过程中温度控制在25 °C（实验室环境及显微镜载物台温度均保持一致）（图2）。
记录完成后，打开图像文件，并通过点击视频窗口中显示的细胞核，使用谱系追踪软件重建细胞谱系（图4）。将追踪得到的gsr-1 (tm3574)突变体胚胎细胞谱系与背景中所示的C. elegans野生型谱系进行比较。主要结果之一是在胚胎发育过程中细胞周期出现进行性延迟。因此，突变体胚胎在中间阶段停止发育，而野生型胚胎则继续发育并最终孵化为幼虫。
通过显微镜下直接观察胚胎，或使用针对晚期胚胎标志物的抗体进行免疫染色，可揭示突变体中年轻胚胎的比例显著高于野生型（WT）。据此可推断，胚胎停滞是最可能的解释。然而，对于细胞周期延迟的直接证据及其精确量化，唯有通过4D显微成像实验才能优雅且简便地实现可视化与定量分析。其他重要的胚胎发育特征，如细胞分化或细胞凋亡（图5），也可借助4D显微成像以动态方式呈现，从而在单次实验中对发育的多个方面进行详尽分析。
<img alt="用于微生物学研究的培养皿储存盒，内含琼脂平板和实验样品。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：C. elegans 线虫在实验室条件下的生长情况。线虫在接种了E. coli的NGM平板上培养，存放于纸板盒中，并在15 °C、20 °C或25 °C条件下进行培养。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎成像装置；光学分析软件；显微镜；实验数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：4D 显微成像记录软件的截图。 两种不同显微镜控制软件程序的示例（A 和 B）。这些程序可创建工作流程，以在 4D 显微成像记录过程中控制显微镜和图像采集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PDMS微流控装置的制备，包括混合、分层、固化步骤；实验室设置流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：C. elegans胚胎琼脂垫制备及固定过程的系列照片。 A. 已制备的琼脂管。 B-C. 琼脂垫的制备。 D. 载玻片部分加水。 E. 用凡士林密封载玻片。 F. 最终制备完成的样品。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分析示意图；软件界面显示细胞膜结构比较数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：细胞谱系追踪软件的连续截图。 该程序可重建细胞周期延迟突变体（左）和野生型（右）的胚胎细胞谱系 秀丽隐杆线虫 胚胎。A. 发育的早期阶段。B-C. 两个胚胎的发育随时间推移而进展。D. 野生型（WT）胚胎正常发育并开始伸长，而突变体胚胎发育停滞。在所有情况下，程序均显示视频窗口和谱系窗口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构显微观察，箭头指示特征部位，比例尺为10 µm，细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：凋亡细胞中透镜状折射形态 秀丽隐杆线虫 野生型胚胎 细胞命运，由形态学特征定义，可通过4D显微镜进行评估。图像显示了一个 秀丽隐杆线虫 豆状胚胎。活细胞呈现由颗粒状细胞质包围的光滑核形态。相比之下，凋亡细胞（黄色箭头）发生浓缩，呈现透光的透镜状形态。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种制备和固定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎、在4D显微镜下记录其发育过程以及追踪细胞谱系的实验方案。

4D显微技术：揭示 秀丽隐杆线虫 使用微分干涉差显微镜观察胚胎发育

4D显微镜技术是解析不同动物胚胎发育过程的宝贵工具。在过去的几十年中，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）……

4D显微镜是一种有价值的工具，可用于在单细胞水平上重建秀丽隐杆线虫胚胎或任何其他样本的完整细胞谱系。利用微分干涉差（Nomarski）光学技术，仅需普通显微镜和透射光，无需转基因动物或荧光显微镜，即可凸显发育过程中细胞形态的变化。4D显微镜可用于研究秀丽隐杆线虫以及其他系统（如哺乳动物或组织细胞培养）中的细胞周期、增殖、分化和凋亡过程。在DIC图像上进行细胞谱系追踪是手动完成的。该过程耗时较长，且需要一定练习才能完成整个胚胎的分析。本实验操作将由本实验室的技术员Begona Ezcurra进行演示。在准备胚胎之前，将4D显微镜的记录温度调节至15、20或25摄氏度，并设置显微镜以每30秒为间隔，对间隔1微米的500层焦平面进行共1,500次z轴扫描记录。接下来，将500至1000微升液态4.5%琼脂分装至3毫米玻璃管中，并用封口膜小心密封管口，以防干燥。为制备用于记录的薄而均匀的琼脂垫，需在酒精灯上小心加热并分装琼脂，直至琼脂完全融化，随后将玻璃管置于80摄氏度的加热块中。将一块玻璃载玻片放置在塑料片上，一手持巴斯德移液管，将一小滴融化的琼脂置于载玻片中央，然后立即用另一只手将第二块载玻片盖在琼脂液滴上，形成一层极薄的琼脂垫。为固定胚胎，首先使用挑针将5至10条产卵期的雌雄同体线虫转移至体视显微镜下盛有水的钟表匠玻璃皿中。用解剖刀切开雌雄同体线虫，从子宫中取出1至4个早期卵。轻轻将盖玻片从琼脂垫上取下，用毛细管将一枚早期卵置于琼脂垫中央。必要时，使用粘在牙签末端的睫毛调整卵的位置，并用毛细移液管除去多余的水分。用手术刀将盖玻片缓慢且倾斜地覆盖在样品上，然后用微量移液器向琼脂垫周围的空间注入水，直至填充约四分之三的区域。然后用凡士林密封盖玻片，以避免在长时间记录过程中发生干燥。密封后，将玻片置于4D显微镜载物台上，使用低倍物镜使胚胎对焦。选择100倍油浸物镜，并调节聚光镜对焦。完全打开聚光镜的孔径光阑，并关闭视场光阑，以获得更高的数值孔径和更大的分辨率。旋转沃拉斯顿棱镜，使胚胎呈现一侧照明的三维图像，然后将棱镜向相反方向旋转，使胚胎的另一侧获得照明效果，并开始进行4D图像记录。对于已记录的4D影片胚胎进行细胞谱系重建时，打开谱系追踪软件，选择文件和新建项目。根据记录温度选择合适的细胞谱系模板，并将扫描次数设置为1500。扫描间隔设置为30秒，层数设置为30，层间距离设置为1微米。选择图像文件、格式以及保存图像的目录。选择图像保存为单个图像还是多图像z轴层叠堆栈，并设置文件命名方式和图像格式。然后点击启用通道处理，以检测并设置4D视频中相应的光学通道。对于细胞谱系追踪，请启动细胞谱系追踪软件。将出现一个视频窗口和一个细胞谱系窗口。在谱系窗口中，选择谱系分支，并点击视频窗口中对应于此细胞的细胞核。播放4D影片，可向前、向后或上下切换层级，以随时间推移在空间上追踪目标细胞。定期点击细胞核，以在谱系分支中生成一个点，并记录该细胞在特定时间的空间坐标。由此可实现细胞谱系的动态追踪及胚胎的三维重建。随后按回车键标记有丝分裂，并选择其中一个子代细胞，继续如上所述追踪其细胞发育过程。对剩余的胚胎细胞重复上述分析，以追溯完整的细胞谱系或追踪特定的感兴趣细胞，例如正在经历凋亡的细胞。为便于将感兴趣的突变体谱系与典型的野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞谱系进行比较，线虫培养板需置于纸板箱内孵育，以避免冷凝水的产生。记录完成后，可使用谱系追踪软件重建细胞谱系，如本例所示。例如，在此代表性分析中，追踪的 gsr-1 突变体胚胎细胞谱系与秀丽隐杆线虫野生型谱系进行了比较，结果显示在胚胎发育过程中细胞周期出现渐进性延迟。因此，突变体胚胎在中间阶段停止发育，而野生型胚胎则继续发育并最终孵化为幼虫。此外，利用4D显微镜可动态观察胚胎发育的其他重要特征，例如细胞凋亡。微分干涉差（DIC）图像的谱系追踪必须通过人工手动处理。在发育早期，对可见光下未标记细胞进行的软件处理在胚胎分析中并不准确。将图像识别系统应用于可见光显微镜领域，将推动发育生物学领域取得重大进展。

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4D显微镜:使用Nomarski显微镜揭示 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

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