4D显微技术：揭示 秀丽隐杆线虫 使用微分干涉差显微镜观察胚胎发育

4D显微镜是一种有价值的工具，可用于在单细胞水平上重建秀丽隐杆线虫胚胎或任何其他样本的完整细胞谱系。利用微分干涉差（Nomarski）光学技术，仅需普通显微镜和透射光，无需转基因动物或荧光显微镜，即可凸显发育过程中细胞形态的变化。4D显微镜可用于研究秀丽隐杆线虫以及其他系统（如哺乳动物或组织细胞培养）中的细胞周期、增殖、分化和凋亡过程。

在DIC图像上进行细胞谱系追踪是手动完成的。该过程耗时较长，且需要一定练习才能完成整个胚胎的分析。本实验操作将由本实验室的技术员Begona Ezcurra进行演示。

在准备胚胎之前，将4D显微镜的记录温度调节至15、20或25摄氏度，并设置显微镜以每30秒为间隔，对间隔1微米的500层焦平面进行共1,500次z轴扫描记录。接下来，将500至1000微升液态4.5%琼脂分装至3毫米玻璃管中，并用封口膜小心密封管口，以防干燥。为制备用于记录的薄而均匀的琼脂垫，需在酒精灯上小心加热并分装琼脂，直至琼脂完全融化，随后将玻璃管置于80摄氏度的加热块中。

将一块玻璃载玻片放置在塑料片上，一手持巴斯德移液管，将一小滴融化的琼脂置于载玻片中央，然后立即用另一只手将第二块载玻片盖在琼脂液滴上，形成一层极薄的琼脂垫。为固定胚胎，首先使用挑针将5至10条产卵期的雌雄同体线虫转移至体视显微镜下盛有水的钟表匠玻璃皿中。用解剖刀切开雌雄同体线虫，从子宫中取出1至4个早期卵。

轻轻将盖玻片从琼脂垫上取下，用毛细管将一枚早期卵置于琼脂垫中央。必要时，使用粘在牙签末端的睫毛调整卵的位置，并用毛细移液管除去多余的水分。用手术刀将盖玻片缓慢且倾斜地覆盖在样品上，然后用微量移液器向琼脂垫周围的空间注入水，直至填充约四分之三的区域。

然后用凡士林密封盖玻片，以避免在长时间记录过程中发生干燥。密封后，将玻片置于4D显微镜载物台上，使用低倍物镜使胚胎对焦。选择100倍油浸物镜，并调节聚光镜对焦。

完全打开聚光镜的孔径光阑，并关闭视场光阑，以获得更高的数值孔径和更大的分辨率。旋转沃拉斯顿棱镜，使胚胎呈现一侧照明的三维图像，然后将棱镜向相反方向旋转，使胚胎的另一侧获得照明效果，并开始进行4D图像记录。对于已记录的4D影片胚胎进行细胞谱系重建时，打开谱系追踪软件，选择文件和新建项目。

根据记录温度选择合适的细胞谱系模板，并将扫描次数设置为1500。扫描间隔设置为30秒，层数设置为30，层间距离设置为1微米。选择图像文件、格式以及保存图像的目录。

选择图像保存为单个图像还是多图像z轴层叠堆栈，并设置文件命名方式和图像格式。然后点击启用通道处理，以检测并设置4D视频中相应的光学通道。对于细胞谱系追踪，请启动细胞谱系追踪软件。

将出现一个视频窗口和一个细胞谱系窗口。在谱系窗口中，选择谱系分支，并点击视频窗口中对应于此细胞的细胞核。播放4D影片，可向前、向后或上下切换层级，以随时间推移在空间上追踪目标细胞。

定期点击细胞核，以在谱系分支中生成一个点，并记录该细胞在特定时间的空间坐标。由此可实现细胞谱系的动态追踪及胚胎的三维重建。随后按回车键标记有丝分裂，并选择其中一个子代细胞，继续如上所述追踪其细胞发育过程。

对剩余的胚胎细胞重复上述分析，以追溯完整的细胞谱系或追踪特定的感兴趣细胞，例如正在经历凋亡的细胞。为便于将感兴趣的突变体谱系与典型的野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）细胞谱系进行比较，线虫培养板需置于纸板箱内孵育，以避免冷凝水的产生。

记录完成后，可使用谱系追踪软件重建细胞谱系，如本例所示。例如，在此代表性分析中，追踪的 gsr-1 突变体胚胎细胞谱系与秀丽隐杆线虫野生型谱系进行了比较，结果显示在胚胎发育过程中细胞周期出现渐进性延迟。

因此，突变体胚胎在中间阶段停止发育，而野生型胚胎则继续发育并最终孵化为幼虫。此外，利用4D显微镜可动态观察胚胎发育的其他重要特征，例如细胞凋亡。微分干涉差（DIC）图像的谱系追踪必须通过人工手动处理。

在发育早期，对可见光下未标记细胞进行的软件处理在胚胎分析中并不准确。将图像识别系统应用于可见光显微镜领域，将推动发育生物学领域取得重大进展。