来自母鸡蛋的外层和内围线子层的机械分离和蛋白质溶解

该议定书提供了一个分步程序，从禽蛋中抽取围网膜亚层，以进一步研究它们在鸟类繁殖中的生理作用。每一步都优化了围膜的采样，以限制任何结构和分子损伤。该议定书是为深入的蛋白组学而进一步发展的。

首先从刚下放的未受精卵中取样围线层或PL。打碎鸡蛋，用鸡蛋分离器将蛋黄和白蛋分开。用小剪刀取出粉笔，将蛋黄卷过滤纸，以去除看似透明但可见的结构的粘附白蛋白。

将蛋黄浸入含有 10 毫摩尔 Tris HCL 的结晶器中，该晶体在 pH8 时已冷却到 4 摄氏度，并使用钝剪刀将细菌盘上的 PL 区域移除一厘米区域内。在缓冲区内用小剪刀将 PL 破裂，然后用钳子握住破裂的 PL 的两个边缘，然后将其剥下蛋黄。在10毫摩尔三叶草HCL的浴池中多次冲洗PL，直到看不到蛋黄的痕迹。

确保 PL 清洁、白色且漂浮在缓冲区中。处理分层分离的 PL 或直接进行生化分析。要将 OPL 和 IPL 分开，请将整个样品与 OPL 面朝上，放入装满 10 毫摩尔三氯和 50 毫摩尔氯化钠的塑料培养皿中，并尽可能少的皱纹将其保持平整。

确定仅连接到 OPL 的剩余查拉扎的位置。然后用小剪刀将整个PL切成大约两到三厘米的碎片。在解剖显微镜下用超精确的尖钳机械地分离两层。

将产生的 IPL 和 OPL 样品单独存放在 80 摄氏度的微管中，直到进一步使用。要执行原蛋白溶解，请单独冷冻干燥 IPL 和 OPL 样本以去除剩余的水，然后从每个样品中切出大约一毫克，并将其放置在带防漏螺丝帽的清洁微管中。将剩余样品存放在紧密封闭的管子中，以在负 20 或负 80 摄氏度下长时间储存。

将每层嗜血杆菌的1毫克与400微升的50毫摩尔三叶草混合，在pH7和500毫摩尔氯化钠。在赫兹30时使用搅拌机磨机两次，每次5分钟，将结构分解成微颗粒，促进蛋白质溶解。将400微升样品收集到两个干净的微管中。

要为电光化准备样品，在每个 400 微升样品中添加 5X SDS-PAGE 样品缓冲区，并将样品加热到 100 摄氏度，加热 5 分钟。将最多 20 微克的蛋白质加载到 4-20% 梯度 SDS 聚丙烯酰胺凝胶的每个通道中，并在 120 伏特下进行电磷化。电磷化后，从玻璃板上取出凝胶，用 Coomassie 亮蓝色溶液污渍 30 分钟，然后用 50% 水、40% 乙醇和 10% 醋酸组成的溶液去污，直到凝胶背景出现浅蓝色。

将凝胶转移到含有去离子水的培养皿中，用于去污和再水化。蛋白质应显示为具有透明背景的蓝色带。PL 受到各种缓冲，以确定允许最小蛋白质损失和最佳亚层分离的条件。

此处显示了以不同三聚氰胺浓度、pH 和氯化钠浓度释放的蛋白质。在解剖显微镜下观察到由此产生的两个子层。IPL是半透明的，而OPL是密集的，多云的，白色的。

分离后，OPL和IPL独立溶解，其蛋白质含量完全溶解，使用机械研磨、离子洗涤剂、还原剂和煮沸的组合。样品在聚丙烯酰胺凝胶上表现出独特的电光剖面。在尝试此协议时，请记住，分层分离是程序的关键步骤，必须在含有最小盐浓度的缓冲区使用双筒显微镜进行。

为了进一步阐明它们各自的生理功能，可以使用电子显微镜分析腹膜亚层样品进行组织学特征分析，并利用成像测定和细胞迁移进行功能研究。