Name: 纤维蛋白富集和 tPA 敏感的光血栓形成卒中模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 了解改良光血栓性卒中模型，通过联合注射凝血酶与孟加拉玫瑰红染料生成富含纤维蛋白的混合血栓，该模型对小鼠脑血流恢复及组织型纤溶酶原激活剂溶栓治疗具有高度敏感性，为临床前卒中研究提供可靠平台。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金（NS108763、NS100419、NS095064 和 HD080429 资助 C.Y. K.；NS106592 资助 Y.Y.S.）的支持。

本方案已获得弗吉尼亚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。图1A 概述了本方案的手术操作流程。
1. 手术准备
<ol>
	<li>在手术前至少15分钟，将设定温度为37 °C的加热垫放置于小动物适配器上。准备一个用于适配器的鼻夹卷，以允许动物头部旋转。准备好麻醉剂氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。</li>
	<li>使用高压灭菌器（121 °C、15 psi，持续60分钟）对包括剪刀、镊子、显微持针器、止血钳、棉签和缝合线在内的手术器械进行灭菌。准备组织胶和眼膏。为外科医生准备532 nm激光防护眼镜。 
	注意：本方案描述的是一种主要的存活手术操作，应采用无菌技术进行。</li>
	<li>设置配备532 nm激光光源的照明系统。准备牙科钻。</li>
	<li>用生理盐水配制玫瑰红溶液（10 mg/mL）。将一份牛凝血酶（0.1 U/µL）置于冰桶中保存。</li>
	<li>在手术前30分钟，皮下注射酮洛芬&#160;（4.0 mg/kg）作为小鼠镇痛用药，或按照当地机构推荐的镇痛方案执行。</li>
</ol>
2. 结扎同侧颈总动脉
<ol>
	<li>通过肌肉注射氯胺酮（60 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg），对体重为22至30 g的10至14周龄雄性C57BL/6NCrl小鼠进行麻醉。 
	注意：整个手术过程，包括同侧颈总动脉结扎至脑血流监测，预计持续约120分钟。该麻醉方案通常可覆盖整个手术时长，但应至少每15分钟重新评估一次麻醉深度。在学习这些操作技术时，可能需要追加麻醉剂量。</li>
	<li>通过夹捏脚趾确认动物已完全麻醉。使用脱毛膏去除左侧颈部用于颈总动脉结扎及头部用于颅骨变薄区域的毛发。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于小动物适配器上。用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭皮肤三次，对术区进行消毒。</li>
	<li>使用耳杆固定小鼠头部。在解剖显微镜下，使用显微剪刀和直镊在中线外侧约0.2 cm处做一长度为0.5 cm的左侧颈部切口。</li>
	<li>使用一对精细有齿镊分离软组织和筋膜，暴露左侧颈总动脉（LCCA）。使用一对精细无齿镊小心地将左侧颈总动脉与迷走神经分离。</li>
	<li>使用剪成20 mm长段的5-0丝线在LCCA周围打永久性双结缝合，随后使用无菌伤口夹闭合切口。</li>
</ol>
3. 大脑中动脉分支区域颅骨变薄及光激活
<ol>
	<li>将小鼠置于小型动物适配器上，使其呈俯卧位。将鼻夹滚轮旋转15°。用碘伏和70%乙醇交替擦拭皮肤三次，对术区进行消毒。</li>
	<li>使用显微剪刀和直镊沿左侧眼和耳之间做一条0.8 cm长的头皮切口，暴露位于眼与耳之间的颞肌（图1B）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用精细锯齿镊在左侧顶骨处沿颞肌边缘做一条0.5 cm长的切口，再用显微剪刀在颞肌上做第二条0.3 cm长的垂直切口。牵开颞肌以暴露顶骨和鳞状骨的边缘。确保能观察到额骨与顶骨之间的冠状缝解剖标志（图1B,C）。</li>
	<li>用无菌生理盐水湿润颅骨，以显露左侧大脑中动脉（MCA）。用记号笔在鳞状骨上标记大脑中动脉近端分支的位置。使用气动牙科钻（钻速设定为速度控制器的50%）在标记区域周围轻轻画一个直径约1 mm的圆圈，将颅骨磨薄至约0.2 mm深度，但不触及下方硬脑膜。持续钻磨直至仅剩一层极薄的骨层。</li>
	<li>根据小鼠体重配制凝血酶（T，0.1 U/μL，80 U/kg）和玫瑰红B（RB，10 mg/mL，50 mg/kg）溶液。例如，对于体重25 g的小鼠，混合20 μL凝血酶溶液（0.1 U/μL）和125 μL RB溶液（10 mg/mL）。</li>
	<li>使用胰岛素注射器（#31G针头）缓慢将T+RB混合溶液（每25 g体重145 µL）注入眶后窦。 
	注：在预实验中，检测了在标准剂量RB染料（50 mg/kg）基础上增加凝血酶剂量进行光激活后的死亡率。结果显示，80 U/kg凝血酶组死亡率为0%（n=13），120 U/kg组为43%（n=7），而160 U/kg（n=5）和200 U/kg（n=5）组死亡率均为100%。因此，本模型选择80 U/kg的凝血酶剂量。同时采用激光散斑对比成像技术排除T+RB经眶后窦注射后眶腔附近发生广泛性血栓形成的可能性（补充图1），以及对侧半球（未接受激光照射）出现广泛纤维蛋白沉积的情况（补充图2）。</li>
	<li>在双眼涂抹眼膏，防止角膜干燥。</li>
	<li>将532 nm激光光源（能量0.5 mW）置于钻孔部位上方2英寸处，持续照射20分钟。通过激光防护眼镜观察大脑中动脉近端分支的照射情况（图1C,D）。 
	注：在防护眼镜下，接受532 nm照射的大脑中动脉呈现红色荧光。远端MCA血流在照射10分钟后消失。若照射20分钟后远端MCA血流仍存在，则剔除该动物。</li>
	<li>20分钟后停止激光照射，使用无菌伤口夹闭合切口。</li>
</ol>
4. 活体成像（可选）
注意：为了在体内表征血栓形成，可使用配备光激活系统的转盘共聚焦显微镜进行血管内成像23。
<ol>
	<li>在颅骨顶骨上制作一个直径约 3 mm 的颅窗。</li>
	<li>将盖玻片置于颅窗上，并在 20 倍水浸物镜下定位大脑中动脉远端（直径约 50 μm）。</li>
	<li>成像前 5 分钟，通过尾静脉注射 DyLight488 标记的抗 GPIbβ 抗体（0.1 mg/kg），标记循环中的血小板。</li>
	<li>成像前 5 分钟，通过眼眶后静脉注射凝血酶（80 U/kg）和玫瑰红（50 mg/kg）的混合溶液。</li>
	<li>使用 561 nm 激光系统（激光束直径为 10 μm）照射大脑中动脉进行光激活，并持续记录图像直至血栓形成。</li>
</ol>
5. tPA 给药
<ol>
	<li>将麻醉后的动物置于37 °C的保温垫上。在选定的光激活后时间点，用约45 °C的温水浸湿纱布，包裹动物尾巴1分钟。</li>
	<li>通过尾静脉注射重组人tPA（10 mg/kg），其中50%作为推注剂量，剩余50%通过输液泵在30分钟内持续输注。 
	注意：尽管重组人tPA在临床用于急性缺血性卒中治疗的剂量为0.9 mg/kg，但在啮齿类动物中通常使用较高剂量（10 mg/kg），以弥补跨物种tPA活性的降低。本实验同样遵循了临床前卒中模型中tPA给药的标准方案，即50%剂量推注，50%剂量在30分钟内通过尾静脉输注。24</li>
</ol>
6. 脑血流量（CBF）的监测
注意：为了确认tPA治疗后脑血流（CBF）的恢复情况，应使用二维激光散斑对比成像系统15，并在光化学血栓诱导后立即（步骤3.9）或tPA治疗后24小时进行记录。
<ol>
	<li>将麻醉后的动物置于俯卧位，在头皮上做正中切口，暴露颅骨。</li>
	<li>用无菌生理盐水湿润颅骨，然后在颅骨上轻轻涂抹超声耦合剂。避免耦合剂中混入毛发或气泡，以免干扰脑血流（CBF）信号。</li>
	<li>在激光散斑对比成像仪下监测双侧大脑半球的脑血流（CBF）持续10分钟。</li>
	<li>记录完CBF图像后，使用组织胶闭合头皮，并将动物放回笼中。</li>
	<li>分析选定区域的脑血流（CBF），并计算与对侧区域相比的CBF恢复百分比。</li>
	<li>随后将动物放回温暖的笼中以恢复。监测小鼠5–10分钟，直至其从麻醉中苏醒。在笼内放置湿润的食物，并将笼子送回动物饲养设施。 
	注意：根据当地机构指南推荐，提供术后镇痛。</li>
</ol>
7. 通过氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测量梗死体积
<ol>
	<li>光栓塞后24小时，根据当地机构关于非存活手术的指南，对动物进行深度麻醉。 
	注：我们通过腹腔（IP）注射给予三溴乙醇（avertin）250 mg/kg。</li>
	<li>用PBS进行心脏灌注，取出新鲜脑组织并包埋于3%琼脂凝胶中。</li>
	<li>使用振动切片机将脑组织切成1 mm厚的脑片，并在2% TTC溶液中孵育10分钟。</li>
	<li>使用ImageJ软件定量6个脑片的总梗死体积，以绝对体积表示。 
	注：脑水肿未被用作结局指标，原因有二。首先，TTC染色通过线粒体还原活性来评估组织存活性，其反映的损伤程度比水肿更为严重。其次，随着梗死进展，血管源性水肿和细胞毒性水肿均会发生，而标准的脑水肿检测方法难以明确区分两者。然而，我们已采用抗免疫球蛋白（IgG）标记来评估血脑屏障（BBB）的完整性，结果发现RB和T+RB卒中模型在光激活后6小时的IgG外渗程度相当（补充图3）。</li>
</ol>
8. 血栓形成测量
注意：为了测量血栓形成，分别在光化学血栓诱导后1小时和2小时收集脑组织，用于通过免疫组化（IHC）检测大脑中动脉（MCA）中的血栓形成，以及通过免疫印迹检测脑半球中的纤维蛋白含量。
<ol>
	<li>进行免疫组化（IHC）以表征血凝块的组成。用4%多聚甲醛固定脑组织过夜，然后用30%蔗糖脱水，进行OCT包埋。</li>
	<li>以矢状面方向将脑组织切成20 μm厚度的切片，并使用针对纤维蛋白原、血小板（糖蛋白IIb）、红细胞（TER119）和血管（异凝集素GS-IB4）的特异性抗体进行免疫组化染色。</li>
	<li>使用抗纤维蛋白原抗体通过免疫印迹法检测大脑半球中纤维蛋白的含量。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

1985年提出的传统玫瑰红B（RB）光化学诱导脑卒中模型，因其手术操作简便、死亡率低以及脑梗死结果高度可重复，成为局灶性脑缺血研究中广受欢迎的模型。5 在该模型中，光敏染料RB在光照激发后迅速激活血小板，形成致密的血小板聚集体，导致血管闭塞。5,8,23 然而，RB诱导形成的血栓中纤维蛋白含量较少（图2），这与急性缺血性脑卒中患者体内取出的血栓中血小板与纤维蛋白相互混杂为主的结构特征存在差异。21,22 RB诱导血栓中纤维蛋白含量低的特点可能也是其对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）溶栓治疗抵抗的原因之一。7,8<su...

血管内取栓术和tPA介导的溶栓治疗是目前仅有的两种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于急性缺血性卒中的治疗方法，该疾病每年在美国影响约70万名患者1。由于取栓术的应用仅限于大血管闭塞（LVO），而tPA溶栓可能缓解小血管闭塞，因此这两种疗法在急性缺血性卒中的治疗中均具有重要价值2。此外，联合使用这两种疗法（例如，在卒中发病后4.5小时内启动tPA溶栓，随后进行取栓术）可改善脑血流再灌注及患者的功能预后3。因此，即使在取栓术广泛应用的时代，优化溶栓治疗仍是卒中研究的重要目标。
血栓栓塞性模型是旨在改进溶栓治疗的临床前卒中研究中的重要工具。这是因为机械性血管闭塞模型（例如，经腔内缝线法闭塞大脑中动脉）不会形成血凝块，且在机械性阻塞解除后脑血流迅速恢复，这种情况过于理想化4,5。迄今为止，主要的血栓栓塞性模型包括光化学法血栓形成6,7,8、局部应用三氯化铁（FeCl3）9、向大脑中动脉分支微量注射凝血酶10,11、将体外形成的（微）栓子注入大脑中动脉或颈总动脉（CCA）12,13,14，以及短暂性低氧缺血（tHI）15,16,17,18。这些卒中模型在继发血凝块的组织学组成以及对tPA介导的溶栓治疗的敏感性方面存在差异（表1）。此外，它们在是否需要开颅手术（原位注射凝血酶和局部应用FeCl3需要开颅）、梗死体积和位置的一致性（例如，通过CCA输注微栓子导致的结果变异较大），以及对心血管系统的整体影响方面也有所不同（例如，tHI会增加心率和心输出量，以代偿低氧引起的外周血管扩张）。
基于RB染料的光化学血栓性卒中（PTS）模型具有多种优势，包括无需开颅的简便手术操作、低死亡率（通常&#60; 5%），以及可预测的梗死范围和位置（位于大脑中动脉供血区域），但该模型也存在两个主要局限性。8 第一个局限是其对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）介导的溶栓治疗反应微弱甚至无反应，这一点也是FeCl3模型的缺点之一7,19,20。PTS模型和FeCl3卒中模型的第二个局限在于，所形成的血栓主要由致密聚集的血小板构成，纤维蛋白含量较少，这不仅导致其对tPA溶栓治疗具有较强抗性，而且与急性缺血性卒中患者体内血小板与纤维蛋白混合构成的血栓模式存在差异21,22。相比之下，原位凝血酶微量注射模型形成的血栓主要由聚合的纤维蛋白构成，血小板含量尚不明确10。
基于上述推理，我们假设通过颅骨变薄区域对大脑中动脉（MCA）靶向光激活时，联合使用亚血栓剂量的凝血酶（thrombin）和玫瑰红（RB），可增加所形成血栓中的纤维蛋白成分，从而提高对tPA介导的溶栓治疗的敏感性。我们已证实了这一假设23，本文中我们将详细描述经改良的（T+RB）光化学诱导血栓性脑卒中模型的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>梗死</td></tr><tr><td>4-0 尼龙单丝缝线</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>5-0 丝线缝线</td><td>Harvard Apparatus</td><td>624143</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>543 nm 激光束</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>光化学血栓形成</td></tr><tr><td>成年雄性小鼠</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14 周龄（22~30 g）</td></tr><tr><td>小鼠适配器用麻醉杆</td><td>machine shop, UVA</td><td></td><td>手术装置</td></tr><tr><td>Avertin（2,2,2-三溴乙醇）</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>安乐死</td></tr><tr><td>牙科钻</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>手术装置</td></tr><tr><td>数码显微镜</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>脑成像</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>手术装置</td></tr><tr><td>精细弯头镊子（带齿）</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>精细弯头镊子（光滑）</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito 止血钳</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>带加热垫的热泵</td><td>Gaymar</td><td>TP700</td><td>手术装置</td></tr><tr><td>输注泵</td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>溶栓治疗</td></tr><tr><td>带31G针头的胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>328291</td><td>光化学血栓形成</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>麻醉</td></tr><tr><td>532 nm 激光防护眼镜</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>光化学血栓形成</td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>非甾体抗炎镇痛药</td></tr><tr><td>微型持针器</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>微型剪刀</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 血流成像仪</td><td>Moor</td><td>780-nm 激光源</td><td>激光散斑对比成像</td></tr><tr><td>小鼠适配器</td><td>RWD</td><td>68014</td><td>手术装置</td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>预防眼干燥</td></tr><tr><td>牵开器头端</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>手术装置</td></tr><tr><td>玫瑰红</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>光化学血栓形成</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>光化学血栓形成</td></tr><tr><td>组织胶</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>手术用品</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo activase 2mg</td><td>溶栓治疗</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC 梗死</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>麻醉</td></tr></tbody></table>

一种富含纤维蛋白且对tpa敏感的光化学血栓性卒中模型

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

理想的血栓栓塞性卒中模型需具备若干特性，包括手术操作相对简便且死亡率低、梗死灶大小和位置稳定、形成的血栓为血小板与纤维蛋白混合结构，类似于患者体内的血栓，并且对溶栓治疗具有足够的敏感性。基于玫瑰红B（rose bengal, RB）染料的光化学诱导血栓模型满足前两项要求，但其血栓对组织型纤溶酶原激活剂（tPA）介导的溶栓治疗高度抵抗，这可能与其富含血小板但纤维蛋白含量较低的血栓成分有关。我们推测，在大脑中动脉（MCA）近端分支区域进行光激活时，联合使用RB染料（50 mg/kg）和亚致血栓剂量的凝血酶（80 U/kg）可能形成富含纤维蛋白且对tPA敏感的血栓。事实上，凝血酶与RB（T+RB）联合的光化学血栓模型确实诱导出混合型血小板-纤维蛋白血栓，免疫染色和免疫印迹结果均证实了这一点，同时该模型保持了稳定的梗死灶大小和位置，并具有较低的死亡率。此外，在光激活后2小时内静脉注射tPA（阿替普酶，10 mg/kg）可显著减小T+RB光化学血栓模型中的梗死灶体积。因此，凝血酶增强型光化学诱导血栓卒中模型可能是一种用于评估新型溶栓疗法的有效实验模型。

首先，我们比较了RB与T+RB光诱导血栓形成中纤维蛋白的含量。在光激活后2小时，通过心脏灌注固定剂处死小鼠，并取出脑组织，对大脑中动脉（MCA）分支进行纵向和横向的免疫荧光染色。在RB光诱导血栓模型中，MCA分支被CD41密集填充+ 血小板和少量纤维蛋白（图2A，C）。相比之下，T+RB光血栓模型中的MCA分支被随机混合的血小板：纤维蛋白血栓阻塞图2B，D，n&gt;每组3只）。我们还在光激活后2小时经心脏灌注生理盐水，通过免疫印迹法比较两种模型大脑皮层中纤维蛋白（原）的水平。该分析显示 &gt; T+RB光血栓形成中同侧半球纤维蛋白沉积比RB光血栓形成增加两倍图 2E，p=0.027（非配对检验） t-检验；每组 n=3)。在我们的原始报告中，还使用共聚焦显微镜结合单血管光激活和活体成像技术，比较了FITC标记的抗GP1bβ抗体标记血小板的行为。<su...

传统的光化学血栓性卒中（PTS）模型主要诱导形成对组织型纤溶酶原激活物（tPA）溶栓治疗具有高度抵抗性的致密血小板聚集体。本文介绍了一种通过共注射凝血酶和光敏染料进行光激活的改良小鼠PTS模型。该凝血酶增强型PTS模型可形成血小板与纤维蛋白混合的血栓，且对tPA溶栓治疗高度敏感。

一种富含纤维蛋白且对tPA敏感的光化学血栓性卒中模型

理想的血栓栓塞性卒中模型需具备若干特性，包括手术操作相对简便且死亡率低、梗死体积稳定一致……

我们希望创建一种卒中模型，能够产生与患者样本相似的血栓，并对临床相关的溶栓治疗产生响应。因此，我们对经典的光化学诱导卒中模型进行了改良，在光激活前将凝血酶与光敏染料玫瑰红（rose bengal）混合。令人欣喜的是，该方法确实形成了对tPA介导溶栓高度敏感的血栓。这种改良的光血栓性中风模型采用非常简单的外科手术，具有较低的死亡率，并能产生高度一致的梗死范围和位置。该模型还能形成由纤维蛋白和血小板混合组成的血栓，与急性中风患者体内的血栓相似。因此，我们认为该模型在临床前中风研究中非常有用，有助于开发更有效的溶栓疗法。我们希望有更多人使用我们的模型。本实验操作将由本课题组的研究助理教授孙宇曜博士进行演示。术前30分钟，通过注射镇痛剂对小鼠进行麻醉处理。麻醉小鼠后，进行足趾夹捏以确认其已完全麻醉。随后使用脱毛膏去除小鼠左侧颈部和头部的毛发。将小鼠仰卧位固定于小动物适配器上，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次，对术区皮肤进行消毒。在解剖显微镜下，使用显微剪刀和直镊子，在中线外侧约0.2厘米处做一条0.5厘米长的左侧颈部切口。接着，使用一对精细有齿镊子分开软组织和筋膜，暴露左颈总动脉（LCCA）。然后使用一对精细无齿镊子，小心地将左颈总动脉（LCCA）与迷走神经分离。使用5-0丝线在左侧颈总动脉（LCCA）周围放置永久性双结缝线。将小鼠翻转至俯卧位，并将鼻夹滚轮旋转15度。随后用碘伏和70%乙醇交替擦拭皮肤三次，对手术区域进行消毒。使用显微剪刀和直镊子沿左侧眼睛和耳朵在头皮上做一个0.8厘米的切口，以暴露颞肌。接着，在左侧顶骨的颞肌边缘做一个0.5厘米的切口。然后在颞肌上做第二个0.3厘米的垂直切口，并将肌肉牵开，以暴露顶骨和鳞状骨的边缘。务必观察位于额骨与顶骨之间的冠状缝这一解剖标志。接着，用无菌生理盐水润湿颅骨以暴露左侧大脑中动脉（MCA），并在鳞状骨上用标记笔标出大脑中动脉近端分支的位置。随后，使用气动牙科钻在该标记区域周围轻轻画出一个直径一毫米的圆形。然后在不接触下方硬脑膜的情况下，将颅骨磨薄至约 0.2 毫米深度。当仅剩一层极薄的骨层时，停止钻孔。接下来，根据小鼠的体重配制凝血酶和玫瑰红溶液，并使用 31 号针头将混合液缓慢注入眶后窦。在双眼上涂抹眼膏以防止干燥。将波长为532纳米的激光光源置于钻孔部位两英寸距离内，照射20分钟。通过激光投影护目镜观察大脑中动脉（MCA）近端分支的照射情况。20分钟后，停止激光照射。在颅骨顶骨上制作一个直径为三毫米的颅窗，并在其上放置盖玻片。然后在20倍水浸物镜下定位大脑中动脉远端。成像前5分钟，通过尾静脉注射DyLight 488标记的抗GP1b-β抗体以标记循环血小板。随后经眼后静脉注射凝血酶与玫瑰红（rose bengal）溶液混合物。使用波长为532纳米的激光系统，以直径10微米的激光束对大脑中动脉（MCA）进行光激活，并持续记录图像直至血栓形成。进行tPA给药时，将麻醉后的动物置于37摄氏度的保温垫上。在选定的光激活后时间点，用45摄氏度的温热湿纱布包裹其尾部一分钟。随后，通过尾静脉注射重组人tPA。以推注方式注入50%，然后使用输液泵在30分钟内输注剩余的50%。为监测脑血流，于头皮做正中切口并暴露颅骨。用无菌生理盐水湿润颅骨，然后轻轻涂抹超声耦合剂，注意避免毛发或气泡混入耦合剂中。在激光散斑对比成像仪下监测双侧大脑半球的脑血流，持续10分钟。免疫荧光标记显示，在基于玫瑰红染料的光诱导血栓模型中，大脑中动脉分支被大量CD41阳性血小板紧密填充，纤维蛋白较少。相比之下，在凝血酶联合玫瑰红染料诱导的光血栓模型中，大脑中动脉分支被随机混合的血小板和纤维蛋白血栓所阻塞。免疫印迹分析显示，在凝血酶联合玫瑰红光诱导血栓形成组中，同侧半球的纤维蛋白沉积量较单独使用玫瑰红组增加了两倍以上。基于共聚焦显微镜的活体成像显示，即使在激光照射下，静脉注射凝血酶也无法诱导血小板聚集。在玫瑰红光诱导血栓模型中，血小板形成均一的血栓，而在凝血酶联合玫瑰红模型中则形成不均匀的聚集体，并伴有多个弱荧光区域。通过激光散斑对比成像技术测量同一只小鼠在tPA治疗与溶剂对照治疗前及治疗后24小时的脑血流量（CBF），并将其标准化至对侧半球。在玫瑰红介导的光化学血栓模型中，与溶剂对照组小鼠相比，tPA治疗组小鼠的CBF呈现出恢复趋势，尤其是在缺血边缘区域。在凝血酶联合玫瑰红介导的光化学血栓模型中，tPA治疗组小鼠的CBF恢复更为显著，且在24小时时常可观察到大脑中动脉（MCA）近端分支的显影。在玫瑰红B光化学血栓形成模型中，溶媒处理组与tPA处理组小鼠检测到的梗死面积相似。相比之下，在凝血酶联合玫瑰红B光化学血栓形成模型中，与溶媒处理组小鼠相比，tPA溶栓治疗在光激活后0.5小时、1小时或2小时显著减少了梗死面积，但在6小时时无显著差异。该方法中，凝血酶介导的纤维蛋白生成对血栓形成至关重要。该模型可用于研究血凝块的组成，并进一步探索溶栓治疗方法。采用此方法后，可进一步应用其他溶栓治疗方法，并评估其后续疗效。通过添加凝血酶，可调节血凝块的组成，使其从纤维蛋白含量低转变为纤维蛋白含量高，从而帮助研究人员开发具有临床相关性的治疗策略。

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