可视化大鼠颅顶硬脑膜中降钙素基因相关肽免疫反应性神经支配：免疫荧光与神经示踪技术

该方案可能为理解颅骨硬脑膜在生理或病理状态下复杂的神经血管结构提供一种可变的方法学参考。利用透明化的硬脑膜全层铺片，可在三维视角下展示硬脑膜内降钙素基因相关肽（CGRP）免疫反应性神经纤维与血管之间的空间关系。处死大鼠后，先经心脏灌注100毫升0.9%生理盐水，随后灌注250至300毫升含4%多聚甲醛的0.1摩尔磷酸盐缓冲液。

操作完成后，去除头部皮肤并打开颅骨，暴露硬脑膜及大脑背侧。沿脑干至嗅球以整体染色法解剖颅部硬脑膜。将颅部硬脑膜置于0.1 mol磷酸盐缓冲液中冲洗约1分钟，随后放入封闭液中孵育。

将硬脑膜转移至小鼠抗CGRP抗体中，4℃孵育过夜。次日，用0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤硬脑膜三次。将硬脑膜在0.1摩尔磷酸盐缓冲液中与驴抗小鼠Alexa Fluor 488二抗和phalloidin 568混合溶液共同孵育。

在室温下，将硬脑膜置于含有1%正常驴血清和0.5%Triton X-100的1摩尔磷酸盐缓冲液中孵育1.5小时。然后用0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤硬脑膜3次，修整边缘，并将其贴附于显微镜载玻片上。观察前用50%甘油封片。

使用荧光显微镜对完整脑膜进行成像，然后使用共聚焦显微镜拍摄硬脑膜中CGRP免疫反应性神经纤维和鬼笔环肽标记的血管的图像。使用电动剃须刀剃除大鼠头部毛发，随后将钝性耳棒插入大鼠耳部，并将其固定于立体定位仪上。调整口腔固定器，并在大鼠眼睛上涂抹眼用软膏。

使用75%乙醇清洁头部手术侧的皮肤，并沿头皮正中线做切口。使用无菌棉签钝性剥离颅骨上的骨膜和肌肉组织。在左侧顶骨和颞骨位于脑膜中动脉上方的区域，使用带圆头钻头的磨钻钻一个小孔。

用牙科硅酸盐水泥在孔周围筑起围堰，使用10微升微量注射器向中脑膜动脉周围的孔内加入2微升氟金。用一小块止血海绵覆盖该孔，再在孔上放置一片石蜡膜，并用骨蜡密封边缘。

用无菌缝合线缝合伤口。将大鼠置于温暖环境中，直至其完全恢复，然后将其放回笼中。

经过7天存活期后，用0.9%生理盐水灌注这些大鼠，随后用0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛灌注。解剖取出三叉神经节（TG）及颈段1至4的背根神经节（DRGs），然后在恒冷切片机系统上以30微米厚度进行矢状面切片。将切片贴附于硅烷涂层的载玻片上。

用组织化学笔圈出组织区域，并在封闭液中孵育30分钟。将样本转移至兔抗氟金抗体和小鼠抗CGRP抗体溶液中，于4°C孵育过夜。次日，用0.1摩尔磷酸缓冲液洗涤组织片三次。

将洗涤后的切片在驴抗兔Alexa Fluor 594和驴抗鼠Alexa Fluor 488二抗混合溶液中孵育。随后用0.1摩尔磷酸缓冲液洗涤三次，滴加50%甘油封片，进行观察。使用荧光显微镜在紫外光照下采集三叉神经节（TG）和背根神经节（DRGs）中荧光金标记神经元的图像。

然后，采集三叉神经节（TG）和背根神经节（DRGs）中荧光金和CGRP标记神经元的图像。经CGRP免疫荧光和鬼笔环肽荧光组织化学染色后，颅脑硬脑膜全层标本中CGRP免疫反应性神经纤维以及鬼笔环肽标记的硬脑膜小动脉和结缔组织均以三维模式清晰可见。粗细不等的CGRP免疫反应性神经纤维与血管壁周围的小动脉平行走行，或位于血管之间。

在向大鼠中脑膜动脉区域及颅部硬脑膜施加氟金7天后，通过荧光显微镜的紫外光照直接观察，在示踪剂施加同侧的三叉神经节（TG）和颈段背根神经节（DRG）中检测到被氟金标记的神经元。在TG的三个分支中均发现氟金标记的神经元，其中眼支和上颌支分布浓度较高，下颌支分布浓度较低。此外，在颈段第2至第3节的DRG中也观察到部分氟金标记的神经元。

这些双重免疫荧光代表性照片显示了三叉神经节（TG）和背根神经节（DRG）中的感觉神经元。通过双重免疫荧光可观察到被荧光金（FG）、降钙素基因相关肽（CGRP）以及同时被FG和CGRP标记的神经元。在实施本方案时，请务必彻底剥离颅部硬脑膜，并将其完整地贴附在载玻片上进行整体封片。