细菌性心内膜炎小鼠模型中感染参数的内注射与定量
2021年2月6日
在这里，我们描述了一种细菌性心内膜炎小鼠模型中的内注射和随后的细菌定量方法。该协议可以扩展用于测量宿主免疫反应和细菌和宿主基因表达。
我们的协议允许将微生物和治疗剂可重复引入小鼠眼部，以研究眼内感染的发病机制和新颖的治疗效果。我们的技术允许在小鼠模型中建立眼内感染，并有助于微生物的定量、宿主免疫反应、感染相关的宿主和病原体基因表达以及新颖的治疗效果。注射部位、针角和分娩的可视化对于成功执行此技术至关重要，适当的眼部收获对于感染参数的量化至关重要。
在生物安全二级设施中，将五毫升 BHI 肉汤添加到 10 毫升的扣盖管中，并使用无菌回路将单个 B.cereus 菌落从螺旋板培养物转移到 5 毫升肉汤中。短暂涡旋后，在37摄氏度的旋转培养箱中孵育样品，每分钟200圈，孵育18小时。在孵化结束时，将培养物稀释为每微升浓度200个聚落形成单位，形成10毫升新鲜BHI，并在涡旋后，将新鲜稀释的培养物的1毫升添加到冰上1.5毫升微离心管中。
对于内注射，打开微注入器并打开连接到微注入器的压缩空气罐上的气体阀。按微控制器上的"模式"，直到屏幕显示"平衡"。按"平衡"，将计算机鼠标放在操作台上。
将不锈钢移液器支架连接到连接到喷油器上填充输出的管材上，并紧密拧紧移液器支架接头，围绕斜面玻璃毛细管移液器尖端针，以便将毛细管针插入移液器支架的另一端。打开眼科显微镜，将光强设置为 50% 将显微镜置于手术现场，然后将显微镜调整到所需对焦。在确认对踏板反射缺乏反应后，将麻醉鼠标放在其左侧的医用垫上，鼻子指向右侧。
通过眼科显微镜定位右眼，将反向作用钳的钳子放在眼睛的两侧，以暴露注射部位。左键将鼠标连接到微注射器，用稀释的细菌溶液填充准备好的毛细管针，用左手固定头部，将针头尖向上，斜面向上，放在眼睛的肢体上。用针在45度角，刺穿眼睛，注意只插入0.5毫米的针尖。
插入针尖后，使用从左到右单击鼠标垫，注射 0.5 微升的 B.cereus 溶液。为防止泄漏，在取出之前将针尖留在鼠标眼内两到三秒钟，然后松开钳子，眼睛将自行返回插座。将鼠标转移到加热垫上的恢复笼，并监控直至完全恢复。
在适当的实验终点点，在一个标记的、自动处理的收获管中加入400微升PBS，并辅以蛋白酶抑制剂，并在受感染的眼睛两侧放置开细尖钳。向下推尖朝头部，以支撑眼睛。一旦钳子在眼球后面，将钳子挤压在一起，将钳子从头部拉出，以分离眼球。
然后立即将眼球放入标记适当的收获管中。在样品采集的 60 分钟内，将封闭的收获管放入组织均质器中，将样品均质化两分钟，同时在两者之间休息 30 秒。均质化后，将样品放在冰上，使用20微升的同质质等同，每稀释180微升PBS，直到达到1倍10至负8的因子。
接下来，用适当的稀释浓度标记每一排正方形预热 BHI 板，并在板以 45 度角倾斜时，将每一个稀释的 10 微升添加到板顶部的单独行中。让每个样品运行，直到它几乎到达板的底部，然后铺设板平。当样品被吸收到加糖中时，将板转移到37摄氏度的培养箱中。
孵化8小时后，殖民地应开始可见。要准确表示样品中的浓度，请计算具有 10 到 100 个菌落的行。斜面玻璃针尖的构造对于将细菌传递到小鼠眼睛的中层至关重要。
在这些图像中，在血脂板和肉汤培养管中生长的杆菌。如图所示，从感染后10小时从5个不同的小鼠眼睛到10倍到第5次和第10次到第七组形成细菌的单位的内膜细菌计数通常可以从一只受感染的眼睛中恢复。尝试此过程时，要记住的最重要的事情是将适当体积的细菌注射到小鼠眼睛中。
按照这个程序，我们可以研究炎症组织学，炎症中介通过ELISA，基因表达通过高通量RNA测序，以促进更好地了解这种疾病的发病机制。
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概述
本文介绍了一种用于小鼠细菌性葡萄膜炎模型的玻璃体腔注射和细菌定量的方法。该协议旨在研究眼内感染并评估新型治疗的有效性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 传染病学
- 免疫学
背景
- 眼内感染可能导致严重视力丧失。
- 了解宿主免疫反应对于开发治疗方法至关重要。
- 小鼠模型常用于研究眼部疾病。
- 微生物定量有助于评估感染严重程度。
研究目的
- 建立一种可重复的方法将微生物引入小鼠眼内。
- 测量与感染相关的宿主免疫反应和基因表达。
- 评估新型治疗剂的有效性。
使用的方法
- 微生物引入的玻璃体腔注射技术。
- 使用BHI培养基培养细菌。
- 感染参数的定量评估。
- 注射部位的可视化和正确技术执行。
主要结果
- 成功在小鼠模型中建立眼内感染。
- 获得微生物负荷和免疫反应的定量数据。
- 感染期间宿主和病原基因表达的洞察。
- 治疗效果评估得以展示。
结论
- 该协议提供了一种研究眼内感染的可靠方法。
- 有助于理解宿主-病原体相互作用。
- 支持眼部感染新型治疗策略的开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reproducible intravitreal injection and quantitative infection assessment in mouse models enable rigorous evaluation of intraocular infection mechanisms and therapeutic interventions. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular anti-infective drug discovery. Quantitative outputs and standardized procedures facilitate translational continuity and portfolio triage in ophthalmic R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response pathways in a controlled in vivo system.
- Supports functional validation of therapeutic targets by quantifying infection and immune parameters.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking bacterial load to host gene expression and inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo platform for evaluating anti-infective compounds and delivery strategies.
- Standardizes infection quantitation via CFU enumeration, supporting reproducibility and assay comparability.
- Generates quantitative readouts suitable for downstream screening and efficacy assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery and preclinical validation.
- Enables continuity from mechanistic studies to preclinical efficacy testing in ocular infection models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust infection and immune response data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular anti-infective development, bridging mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on infection mechanisms and immune modulation in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of bacterial load, immune mediators, and gene expression across conditions.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for biomarker and efficacy studies in ocular infection.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for diverse anti-infective and immunomodulatory research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of ocular infections.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of infection modeling and quantitation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical injection and animal model handling.
- Demands access to microinjectors, ophthalmic microscopes, and tissue homogenization infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, harvest, and quantitation protocols.
- Adaptation may be needed for different pathogens or mouse strains as supported by the protocol.
- Careful volume control and technique are critical to ensure reproducibility and data integrity.
