Name: 细菌性心内膜炎小鼠模型中感染参数的内注射与定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解玻璃体腔内注射技术用于建立小鼠细菌性眼内炎模型并定量感染参数的方法。该技术可评估宿主免疫反应、病原体基因表达及新型治疗效果，为研究眼内感染发病机制和开发靶向治疗策略提供可靠实验手段。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢冯·李博士（Dr. Feng Li）和马克·迪特马尔（Mark Dittmar）（美国俄克拉荷马城俄克拉荷马大学健康科学中心P30活体动物成像中心，迪恩·A·麦吉眼科研究所）提供的协助。本研究获得了美国国立卫生研究院资助项目R01EY028810、R01EY028066、R01EY025947和R01EY024140的支持。本研究还获得了P30EY21725（美国国立眼科研究所核心资助，用于活体动物成像与分析、分子生物学和细胞成像）的支持。此外，本研究还得到了美国国立眼科研究所视觉科学博士前培训项目5T32EY023202、长老会健康基金会研究资助以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）向迪恩·A·麦吉眼科研究所提供的无限制资助的支持。

所有操作均遵循《实验动物护理和使用指南》以及视觉与眼科研究协会关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明中的建议。相关方案已获俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准（方案编号：15-103、18-043 和 18-087）。
1. 无菌玻璃针
<ol>
	<li>转动 开启 针状移液器拉制仪</li>
	<li>调节 加热器 旋钮直至显示屏显示12.6。</li>
	<li>打开门，手动将5 μL毛细管穿过上部夹具和加热丝，直至一半管段延伸至加热丝下方（图1A).</li>
	<li>确认毛细管位于上部夹具的“V”形槽内。拧紧上部夹具。</li>
	<li>下夹具打开时，手动向上调节垂直滑块，直至下夹具到达其上限位置。确认试管位于下夹具的“V”型槽内。拧紧下夹具。</li>
	<li>关闭门并确认“Ready”指示灯已亮起。按下 开始 启动加热器和拉制程序的按钮（图1B).</li>
	<li>确保加热器在加热完成后自动关闭，且重力将毛细管拉开（图1C），载玻片向下移动。</li>
	<li>打开门。在握住毛细管顶端的同时，松开顶部夹具。取下上部的毛细管并放置一旁。</li>
	<li>将毛细管固定在底片上，松开下部夹具。取下下部的毛细管并放置一旁。</li>
	<li>使用微电极斜面研磨仪和粒径为0.05 μm的氧化铝研磨板对拉制好的毛细管进行斜面打磨，以制备注射针。</li>
	<li>用移液器吸取足量水滴加到研磨板上，以覆盖其表面（图1D).</li>
	<li>转动 开启 将修边器调至以60 rpm的转速开始旋转。将拉制好的毛细管插入移液管夹具的“V”形槽中。拧紧夹具，并将移液管夹具的角度调整至30°。</li>
	<li>将毛细管尖端调整至距研磨板旋转中心约三分之二距离的位置。</li>
	<li>通过调节操纵器顶部的粗调控制旋钮，降低夹紧的毛细管。继续降低毛细管，直至其尖端伸入水面以下，并接触到研磨板的磨削表面。</li>
	<li>使用修针仪上连接的显微镜监测拉针的磨削进程。5分钟后，调节微调控制装置，将玻璃针从磨针板上抬起。</li>
	<li>移除玻璃针，将其置于10倍放大镜下检查毛细管尖端图1E，F).</li>
	<li>为确保无堵塞，将玻璃针插入连接注射器的移液器 holder 中，并向含有 1 mL 99% 乙醇的离心管中推入空气。若针尖处形成气泡，则表明玻璃针无堵塞，可用于显微注射。此步骤还可确保玻璃针的无菌性。</li>
	<li>一根毛细管最多可容纳 5 μL 液体。将毛细管分为 10 个等分段，以计算针头上每 0.5 μL 体积对应的刻度间距。标记出容纳 0.5 μL 液体的距离刻度，供后续使用。对于 5 μL 的针头，间距为 0.7 mm 时相当于 0.5 μL（图1G).</li>
</ol>
2. Bacillus cereus 培养
<ol>
	<li>本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。</li>
	<li>取蜡样芽孢杆菌（B. cereus）ATCC 14579 冻存菌种，在 5% 羊血琼脂平板上划线以分离单菌落，并于 37 ˚C 培养过夜（图 2A）。</li>
	<li>用移液器将 5 mL 无菌脑心浸液（BHI）肉汤加入一支 10 mL 无菌带盖试管中（图 2B）。使用无菌接种环或接种针，从琼脂平板上挑取一单菌落的 B. cereus ATCC 14579，接种至液体 BHI 培养基中。</li>
	<li>短暂涡旋混匀样品，将带盖试管放入旋转培养箱中，设置温度为 37 °C、转速为 200 rpm。培养 18 小时后，从培养箱中取出培养物（图 2B）。</li>
</ol>
3. 玻璃体内注射用细菌稀释
<ol>
	<li>本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。</li>
	<li>计算需加入10 mL新鲜BHI培养基中的过夜培养B. cereus菌液体积，以达到每微升200个菌落形成单位（CFU/μL）。例如，B. cereus在BHI培养基中过夜培养后浓度约为2 × 108 CFU/mL，取10 μL过夜培养物加入10 mL新鲜BHI培养基中，即可稀释至200 CFU/μL。</li>
	<li>将1 mL新鲜稀释后的菌液移入1.5 mL微量离心管中。将该管置于冰上保存，直至进行玻璃体内注射。在菌液稀释后60分钟内完成玻璃体内注射操作。</li>
</ol>
4. 小鼠玻璃体内注射
<ol>
	<li>本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。</li>
	<li>在手术台上放置医用垫巾以准备操作区域。</li>
	<li>转动 开启 打开连接至显微注射仪的压缩空气罐上的气体阀门。调节气罐调压阀，使气体输送压力约为60 psi。</li>
	<li>在显微注射仪上按下 模式 直到屏幕显示 平衡. 按压 平衡 将计算机鼠标放置于手术台上。将不锈钢移液器支架连接至与注射器“填充/输出”端口相连的管路。该管路始终与注射器保持连接。</li>
	<li>将毛细玻璃针插入移液器 holder 的另一端，通过拧紧移液器 holder 连接头固定针头。</li>
	<li>打开眼科显微镜，将光源强度调至50%。调整显微镜至手术台操作区域上方，并调节显微镜至所需焦距。</li>
	<li>在开始操作前，通过测试小鼠的足底回缩反射来确认其已充分麻醉。务必遵循经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的麻醉操作规程。&#160;</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于医用垫巾上，使其鼻部朝右，身体向左侧倾斜。</li>
	<li>通过眼科显微镜观察小鼠右眼，使用反向持针钳在眼睛两侧轻轻撑开眼睑，以暴露注射部位（图3C).</li>
	<li>用鼠标左键点击连接至显微注射仪的触控板，将毛细玻璃针填充200 CFU/μL的菌液稀释液图 3D).</li>
	<li>用左手固定动物头部，将针头尖端置于眼睛的角膜缘处。针头斜面朝上，与眼球呈45°角刺入小鼠眼内，注射时确保仅针尖锐利部分（约0.5 mm）插入眼内。</li>
	<li>针尖插入后，将左手从鼠头移开，放至鼠标垫上，右键点击鼠标垫以注入 0.5 μL 的液体 B. cereus 稀释。为防止泄漏，在拔出前将针头尖端留在小鼠眼内 2-3 秒图3E)1,19,26,27,32,34,36,37,38.</li>
	<li>松开镊子，将小鼠放入置于加热垫上的笼子中。持续观察小鼠，直至其从麻醉状态中恢复图3F).</li>
	<li>小鼠从麻醉中恢复后，将鼠笼放回相应的架位。若小鼠需接受视网膜电图检测以分析视网膜功能，应将鼠笼放回暗室，以确保充分的暗适应。</li>
</ol>
5. 收集管的制备
<ol>
	<li>将1 mm无菌玻璃珠放入1.5 mL螺口管中。</li>
	<li>在干燥模式下使用高压灭菌器对这些管子进行灭菌。使用前让管子冷却至室温。</li>
	<li>向无菌的15 mL离心管中加入10 mL 1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>向管中加入1片蛋白酶抑制剂混合物片剂。通过涡旋混合19,27,29,34,35。</li>
	<li>将含有蛋白酶抑制剂的400 μL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）移液至每个已高压灭菌的收获管中。标记管子并置于冰上。（图4A）。</li>
</ol>
6. 收集眼球
<ol>
	<li>本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。</li>
	<li>通过吸入 CO2 处死小鼠，并采用第二种方法确认动物已安乐死。</li>
	<li>固定安乐死小鼠的头部，将精细镊子张开并置于感染眼的两侧，向下朝向头部方向推动以使眼球突出。当镊子尖端到达眼球后方时，夹紧镊子，然后将镊子向外拉离头部，以摘除眼球（图 4B）。</li>
	<li>立即将摘下的眼球放入已标记的收集管中，并将收集管置于冰上，保存时间不得超过 60 分钟（图 4C）。</li>
</ol>
7. 眼内细菌计数
<ol>
	<li>本节所有操作均须在生物安全二级条件下进行。</li>
	<li>确认所有收集管已紧密封闭，并在组织匀浆器中保持平衡（图5A）。开启组织匀浆器匀浆1分钟，暂停30秒后，再次开启1分钟。将管子置于冰上（图5B,C）。</li>
	<li>将匀浆液依次进行10倍系列稀释：每次取20 μL匀浆液加入180 μL无菌1x PBS中。连续稀释至稀释倍数达到10-7（图5D）。</li>
	<li>在预热的方形BHI平板上，用适当的稀释倍数标记每一行。将每种稀释液各取10 μL，依次加到倾斜约45°的BHI平板顶部。让样品液沿斜面流下，接近平板底部时，将平板放平（图5E）39。</li>
	<li>待样品完全被BHI琼脂吸收后，将平板放入37 °C培养箱中培养。接种后约8小时应开始可见菌落生长。</li>
	<li>在B. cereus菌落生长至相互重叠影响单个菌落识别之前，及时将平板从培养箱中取出（图5F）。</li>
	<li>为准确反映样品中的菌液浓度，应计数含有10–100个菌落的行。例如，稀释倍数为10-4的行中若计得45个菌落，则其浓度为4.5 × 105 CFU/mL。</li>
	<li>计算每只眼中的细菌总数时，将上述浓度乘以0.4（代表用于匀浆眼球的1x PBS体积，单位为毫升）。例如，4.5 × 105 CFU/mL的浓度相当于每只眼含有1.8 × 105 CFU B. cereus。</li>
</ol>
8. 样品保存
<ol>
	<li>将匀浆样品放入已标记的冻存盒中，并将该冻存盒置于 -80 °C 超低温冰箱中。这些样品日后可用于通过 ELISA 检测炎症介质。</li>
</ol>

作者没有需要披露的财务利益冲突。

尽管已有强效抗生素、抗炎药物和玻璃体切除手术，细菌性眼内炎仍可能导致患者失明。临床研究在眼内炎的探索中具有一定价值；然而，眼内炎的实验模型能够提供快速且可重复的结果，这些结果可转化为临床诊疗标准的进步，从而改善患者的视力预后。
小鼠眼球的玻璃体容积约为 7 µL40。如此小的容积仅能允许注射有限量的物质。为避免眼部损伤，注射体积不应超过 1.0 µL。该操作需要特定设备，并需熟练掌握相关技术以确保可重复性和准确性。内源性眼内炎已在灵长类动物、猪、兔、大鼠、豚鼠和小鼠中进行研究28,41,42,43,44,45。在体型较大的物种中，其眼球大小更接...

细菌性眼内炎是一种破坏性感染，可引起眼部炎症，若未得到妥善治疗，可能导致视力丧失甚至失明。眼内炎是由于细菌进入眼内所致1,2,3,4,5。一旦进入眼内，细菌会进行复制，产生毒素及其他有害因子，从而对精细的视网膜细胞和组织造成不可逆的损伤。此外，由于炎症通路被激活，导致炎性细胞浸润至眼内，由此引发的炎症反应也可造成眼部损伤1,5,6。眼内炎可继发于眼内手术（术后）、眼球穿透性损伤（外伤后），或由身体其他解剖部位的细菌经血行播散至眼部引起（内源性）7,8,9,10。细菌性眼内炎的治疗包括使用抗生素、抗炎药物或外科干预3,4,11。即使接受上述治疗，仍可能丧失视力或眼球。细菌性眼内炎后的视力预后通常取决于治疗效果、就诊时的视力水平以及致病菌的毒力。
Bacillus cereus（B. cereus）是导致创伤后内源性眼内炎的主要细菌病原体之一7,12。大多数B. cereus引起的眼内炎病程进展迅速，可在数天内导致失明。B. cereus眼内炎的典型特征包括快速发展的玻璃体炎症、眼痛、视力迅速下降以及发热。B. cereus在眼内的生长速度较其他常见致眼感染细菌更快2,4,12，并具有多种毒力因子。因此，有效治疗干预的时间窗相对较短1,&#160;2,&#160;3,&#160;4,&#160;5,&#160;6,&#160;7,&#160;11,&#160;12,&#160;13,&#160;14,&#160;15,&#160;16,&#160;17,&#160;18,&#160;19,&#160;20,&#160;21,&#160;22,&#160;23,&#160;24,&#160;25。针对该感染的常规治疗方法对其他毒力较弱的病原体所致眼内炎通常有效，但B. cereus引起的眼内炎常导致超过70%的患者出现显著视力丧失。约50%的患者需接受感染眼的眼球内容物剜除术或眼球摘除术7,16,22,23。B. cereus眼内炎的破坏性和快速进展特性要求立即采取正确治疗。近年来在阐明疾病发生机制方面的进展已识别出潜在的干预靶点19,26,27。实验性小鼠B. cereus眼内炎模型在揭示感染机制及测试可能预防视力丧失的潜在治疗手段方面仍具有重要价值。
小鼠眼内感染 B. cereus 的实验模型在研究细菌与宿主因素及其在眼内炎过程中的相互作用方面发挥了重要作用28。该模型模拟了创伤后或术后事件，即在眼部受伤时细菌被引入眼内。该模型具有高度可重复性，已被广泛用于测试实验性疗法，并为改进临床诊疗标准提供数据支持1,6,19,29,30。与许多其他感染模型类似，该模型允许独立控制多种感染参数，从而高效且可重复地评估感染结果。过去几十年中，在兔类相似模型中开展的研究已探讨了 B. cereus 毒力因子在眼部的作用2,4,13,14,31。通过注射缺失单个或多个毒力因子的 B. cereus 突变菌株，可通过感染后不同时间点的眼内细菌浓度或视觉功能丧失等指标，量化这些毒力因子对疾病严重程度的贡献13,14,27,31,32。此外，通过感染缺失特定炎症相关宿主因子的基因敲除小鼠品系，该模型也可用于研究宿主因素的作用26,29,33,34,35。该模型还可用于评估潜在治疗方法，例如在感染后向眼内注射新型化合物30,36。在本论文中，我们描述了一项详细的操作流程，包括对小鼠眼部进行 B. cereus 感染、感染后取材、定量检测眼内细菌载量，以及保存样本以进一步评估疾病严重程度的其他参数。

<table><tbody><tr><td>2-20 &amp;micro;L 移液器</td><td>RANIN</td><td>L0696003G</td><td>NA</td></tr><tr><td>37°C 培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>NA</td></tr><tr><td>脑心浸出液培养基（Bacto Brain Heart Infusion）</td><td>BD</td><td>90003-032</td><td>NA</td></tr><tr><td>细胞显微注射仪</td><td>MicroData Instrument, Inc.</td><td>PM2000</td><td>NA</td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td>NA</td></tr><tr><td>玻璃珠，1.0 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079110</td><td>NA</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>NB-I2400</td><td>NA</td></tr><tr><td>5 微升微量毛细移液管</td><td>Kimble</td><td>71900-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>微量移液管斜面打磨仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BV-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>显微镜 Axiostar Plus</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>显微镜 OPMI Lumera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16 高通量组织研磨器</td><td>BioSpec</td><td>Model 607</td><td>NA</td></tr><tr><td>多通道移液器，30-300 &amp;micro;L</td><td>Biohit</td><td>15626090</td><td>NA</td></tr><tr><td>多通道移液器，5-100 &amp;micro;L</td><td>Biohit</td><td>9143724</td><td>NA</td></tr><tr><td>拉针仪/移液管拉制仪</td><td>Kopf</td><td>730</td><td>NA</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GIBCO</td><td>1897315</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>反向操作镊子</td><td>Katena</td><td>K5-8228</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

Intravitreal Injection and Quantitation of Infection Parameters in a Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis

眼内细菌感染对视力具有严重威胁。研究人员利用动物模型研究与感染相关的宿主和细菌因子以及免疫应答通路，以确定可行的治疗靶点，并测试预防失明的药物。玻璃体内注射技术用于将病原体、药物或其他物质直接注入眼球后段的玻璃体腔内。本文中，我们演示了该注射技术在小鼠眼部诱导感染的方法，以及定量检测眼内细菌的技术。Bacillus cereus 在脑心浸液液体培养基中培养18小时后，重悬至浓度为100菌落形成单位（CFU）/0.5 µL。使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对C57BL/6J小鼠进行麻醉。利用皮升级微注射仪和玻璃毛细管针头，将0.5 µL的Bacillus菌悬液注入小鼠眼球的玻璃体中部。对侧对照眼则注射无菌培养基（手术对照）或不进行注射（绝对对照）。感染后10小时，处死小鼠，使用无菌手术镊摘取眼球，放入含有400 µL无菌PBS和1 mm无菌玻璃珠的离心管中。如需进行ELISA或髓过氧化物酶检测，则在管中加入蛋白酶抑制剂；如需提取RNA，则加入相应的裂解缓冲液。眼球组织在组织匀浆机中匀浆1–2分钟。将匀浆液用PBS进行10倍系列稀释，并涂布于琼脂平板上。剩余匀浆液储存于-80 °C，用于其他检测。平板在37 °C孵育24小时后，定量每只眼球的菌落形成单位（CFU）。这些技术可在小鼠眼中建立可重复的感染模型，并有助于定量活菌数量、宿主免疫应答以及宿主与细菌基因表达的组学分析。

制备可重复的接种物以及准确执行玻璃体内注射操作，是建立微生物性眼内炎模型的关键步骤。本文中，我们以革兰氏阳性菌Bacillus cereus为例，演示了玻璃体内注射的操作过程。我们将100 CFU/0.5 μL的B. cereus注射至五只C57BL6小鼠眼球的玻璃体中部。感染后10小时，观察到每只眼内B. cereus增殖至约1.8 × 105 CFU/眼。图1展示了用于将细菌注入小鼠眼球玻璃体中部的玻璃毛细针的制备方法。Bacillus cereus在血琼脂平板及培养管中的生长情况见图2。图3展示了使用气压驱动注射系统进行小鼠玻璃体内注射的操作过程。图4演示了在感染后预定时间点采集感染眼球的步骤。图5展示了对感染眼球进行匀浆处理的技术。<stro...

本文介绍了一种用于细菌性眼内炎小鼠模型的玻璃体内注射方法及后续细菌定量技术。该方案可进一步扩展用于检测宿主免疫反应以及细菌和宿主基因的表达。

眼内细菌感染对视力具有严重威胁。研究人员利用动物模型来探究宿主与细菌因素以及免疫反应……

本方案可重复地将微生物和治疗剂导入小鼠眼内，以研究眼内感染的发病机制及新型治疗方法的有效性。本技术可在小鼠模型中建立眼内感染，并有助于定量分析微生物、宿主免疫反应、感染相关宿主与病原体基因表达以及新型治疗手段的效果。注射部位、针头角度及给药过程的可视化对于成功实施该技术至关重要，而规范的眼组织采集则是准确量化感染参数的前提。在生物安全二级实验室内，向一个10毫升带盖离心管中加入5毫升BHI肉汤，并使用无菌接种环从划线平板培养物中转移单个蜡样芽孢杆菌（B. cereus）菌落至5毫升肉汤中。短暂涡旋混匀后，将样品置于37摄氏度、200转/分钟的旋转培养箱中培养18小时。培养结束后，用新鲜BHI肉汤将菌液稀释至每微升含200个菌落形成单位（CFU/µL）的浓度，涡旋混匀后，取1毫升新鲜稀释的菌液加入预冷的1.5毫升微量离心管中，置于冰上备用。进行玻璃体内注射时，打开微量注射器，并开启连接在微量注射器上的压缩空气罐的气体阀门。按下微量注射器上的“模式”（Mode）键，直至屏幕显示“平衡”（Balance）。按下“平衡”（Balance）键，并将计算机鼠标放置在手术台上。将不锈钢移液管支架连接到注射器填充输出端的管路上，并将移液管支架接头紧密地拧在斜面玻璃毛细移液管尖端针头上，以便将毛细针插入移液管支架的另一端。打开眼科显微镜，将光照强度设置为50%。将显微镜置于操作区域上方，并调节显微镜至所需焦距。确认小鼠对足底反射无反应后，将麻醉后的小鼠左侧卧位放置于医用垫巾上，鼻部朝向右侧。通过眼科显微镜物镜定位右眼，并将反向持针钳的钳夹置于眼球两侧，以暴露注射部位。点击连接至显微注射仪的鼠标左键，使已准备好的毛细玻璃针头吸入稀释的细菌溶液。用左手固定头部，将针尖（斜面朝上）置于角膜缘处。保持针头与眼球呈45度角，刺入眼球，注意仅将针尖锐利部分的0.5毫米插入即可。针尖插入后，用左手点击触控板右键，注入 0.5 µL 的 B.cereus 溶液。为防止液体渗漏，将针尖在小鼠眼内保留 2 至 3 秒后再拔出，随后松开镊子，眼球将自行回到眼窝内。将小鼠转移至带有加热垫的恢复笼中，并持续监测直至完全恢复卧姿。在适当的实验终点，向置于冰上的预标记灭菌收获管中加入 400 µL 含蛋白酶抑制剂的 PBS（每只眼球一管），并将精细尖头镊子张开置于感染眼的两侧。将镊子尖端向下朝头部方向推动，使眼球突出。当镊子尖端到达眼球后方时，夹紧镊子并向头部外侧拉动，以摘除眼球。立即将眼球放入相应标记的采集管中。在样本采集后60分钟内，将封闭的采集管放入组织匀浆器中，以两个一分钟的匀浆周期进行匀浆，每个周期之间间隔30秒休息时间。匀浆完成后，将样本置于冰上，并取20微升匀浆液作为分装量，每步用180微升磷酸盐缓冲液（PBS）进行连续稀释，直至达到1×10⁻⁸的稀释倍数。接下来，用记号笔在方形预热的BHI平板的每一行上标记相应的稀释浓度。将平板倾斜45度角，取10 µL每种稀释液分别加入平板顶部的各自行中。让每份样品沿斜面缓慢向下流动，直至接近平板底部时，再将平板平放。待样品完全被琼脂吸收后，将平板转移至37 °C培养箱中培养。孵育 8 小时后应开始可见菌落。为准确反映样品中的浓度，应计数含有 10 至 100 个菌落的区域。斜面玻璃针尖的制备对于将细菌注入小鼠眼球玻璃体中部至关重要。这些图片显示了在血琼脂平板和肉汤培养管中生长的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。如图所示，在感染后10小时，从小鼠的五只不同眼睛中测得的眼内细菌数量通常可从单个感染眼回收到1×10⁵至1×10⁷个菌落形成单位。进行此操作时最重要的是要将适量的细菌注入小鼠眼内。通过该实验流程，我们可利用组织学方法研究炎症，通过ELISA检测炎症介质，并通过高通量RNA测序分析基因表达，从而促进对该疾病发病机制的深入理解。

intravitreal-injection-quantitation-infection-parameters-mouse-model

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

细菌性心内膜炎小鼠模型中感染参数的内注射与定量

本视频介绍了一种通过将细菌悬液注射到小鼠眼内玻璃体腔中，建立模拟细菌性眼内炎的小鼠模型的方法。细菌性眼内炎是一种由细菌侵入眼内玻璃体腔引起的内部感染。该小鼠模型有助于研究疾病的发病机制并评估潜在的治疗方法。...

细菌性眼内炎小鼠模型：通过玻璃体内注射细菌悬液建立小鼠细菌性眼内炎的方法

关键词：细菌性眼内炎，小鼠模型，玻璃体内注射，细菌悬液，眼感染，实验性眼病

本视频介绍了从由蜡样芽孢杆菌（Bacillus...

细菌感染定量检测法：一种用于小鼠细菌性眼内炎模型中眼内细菌载量定量的方法

本视频展示了一种用于研究感染后葡萄膜炎的致敏型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）小鼠模型的建立方法。通过在先前用相同免疫原致敏的小鼠中进行玻璃体内注射热灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

一种用于研究感染后葡萄膜炎的经致敏的分枝杆菌性葡萄膜炎小鼠模型

本视频展示了一种用于检测和量化感染后葡萄膜炎小鼠模型中眼部炎症的体内成像技术。该技术称为光学相干断层扫描（OCT），可生成眼部的高分辨率横断面图像，用于评估疾病进展。...

用于评估小鼠模型中葡萄膜炎的光学相干断层扫描成像

本视频演示了在小鼠眼内玻璃体腔注射后，通过流式细胞术检测小胶质细胞对荧光生物颗粒的摄取。流式细胞术可检测表达 CD11b 的活细胞，并能将表现出绿色荧光的吞噬性小胶质细胞与其他髓系细胞（包括表达 Ly6C 的单核细胞和表达 Ly6G...

使用流式细胞术检测小胶质细胞对玻璃体内递送的荧光颗粒的摄取

来源：Park, S. W., 等. 小鼠视网膜色素上皮基因治疗中病毒载体的角膜缘入路视网膜下注射。J. Vis. Exp.

小鼠模型中向视网膜色素上皮的视网膜下注射病毒载体

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。...

实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

本方案概述了在小鼠中诱导 预激活型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）的步骤。该方法详细说明了在小鼠模型系统中产生可靠且显著的眼部炎症的操作流程。通过使用本方案，我们从单只动物中获得了葡萄膜炎眼及未发炎的对侧眼，可用于后续的免疫学、转录组学和蛋白质组学分析。...

作为感染后葡萄膜炎模型的启动型分枝杆菌性葡萄膜炎（PMU）

本方案介绍了如何结合数字滴定PCR（dd-PCR）、小规模AAV制备、玻璃体内注射、视网膜成像及视网膜基因组DNA提取，定量小鼠视网膜中AAV的转导效率。...

数字滴定PCR法用于定量小鼠视网膜中AAV转导效率

了解玻璃体腔内注射技术用于建立小鼠细菌性眼内炎模型并定量感染参数的方法。该技术可评估宿主免疫反应、病原体基因表达及新型治疗效果，为研究眼内感染发病机制和开发靶向治疗策略提供可靠实验手段。

小鼠细菌性眼内炎模型中的玻璃体内注射及感染参数定量分析

探索更多视频