大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征
2021年6月9日
该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。
由于FAPs是肌肉再生和病理性纤维化的介质，我们的方案允许表征肌肉损伤后的FAP动力学，并分离FAPs用于体外或体外研究。迄今为止，研究仅限于从小鼠中分离的FAPs。我们的方案能够从较大的大鼠中有效分离FAPs，为下游测定提供更大的组织可用性。
延长的组织处理时间会对FAPs的生存能力产生负面影响。如果同时处理多个样品，建议两个操作员串联执行实验方案，以最大限度地提高分离的细胞活力。首先将收获的肌肉组织置于无菌的10厘米细胞培养皿中。
用镊子轻轻撕开并切碎组织，并去除结缔组织，以获得约三到四毫米的立方块。将Minster组织转移到含有6毫升DMEM和1%青霉素 - 链霉素的无菌50毫升锥形管中。接下来，通过加入10微升300毫摩尔氯化钙溶液来激活365微升胶原酶II溶液。
将活化的胶原酶II溶液加入组织浆液中，最终浓度为每毫升250单位。将管子在振荡器中孵育一小时，并在37摄氏度下以240×g孵育，每15分钟手动搅拌一次，以移开粘附在管子侧面的组织。孵育一小时后，向样品中加入100微升胶原酶II和50微升脱酶。
然后，用血清学移液器移液15至20次，直到溶液均勻。将样品在37摄氏度和240×g下再次孵育30分钟，每15分钟手动搅拌一次。用20号针头将肌肉溶液样品通过20毫升注射器缓慢剪切10个周期。
然后，将40微米细胞过滤器放在无菌的50毫升锥形管上，并通过移液五毫升补充10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM来润湿它。通过过滤器一次移取样品一毫升。过滤整个样品后，用补充有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素的DMEM洗涤细胞过滤器，以使样品的总体积达到25毫升。
将样品体积均匀地分成两个15毫升的锥形管，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于室温下的一毫升红细胞裂解缓冲液中七分钟。然后，加入9毫升洗涤缓冲液，使体积达到10毫升，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。
离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于一毫升洗涤缓冲液中。将适当体积的细胞转移到单独的1.5毫升微量离心管中，并将其与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数器在光学显微镜上计数活细胞。
对于流式细胞术，将每个实验样品中的1至200万个细胞转移到无菌的1.5毫升微量离心管中。用洗涤缓冲液将样品体积降至一毫升，并将试管放在冰上。设置实验的所有控件。
对于细胞对照，在1.5毫升微量离心管中，将500， 000至100万个细胞等分到100万个细胞的1毫升洗涤缓冲液中，并将其放在冰上。如果实验是首次进行，还应包括单染色细胞悬浮液。要设置磁珠控制，请在每个标记的1.5毫升离心管中加入约150， 000个正补偿微珠。
通过将一半的细胞体积从活化管转移到刷新标记为死的1.5毫升微量离心管来准备活力控制。将死管在65摄氏度下孵育两到三分钟，然后将其放在冰上。孵育后，将死细胞返回活力管。
将单细胞悬浮液（包括实验和对照样品）在500×g和4摄氏度下离心5分钟，并在吸出上清液后将细胞沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中。根据对照或实验条件加入抗体，轻轻轻拂样品，确保完全混合。然后，将它们在黑暗中的冰上孵育15分钟。
对于补偿珠，将管子在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过向单细胞悬浮液中加入900微升洗涤缓冲液和900微升PBS用于补偿微珠对照，将每个样品的体积调至1毫升。将单细胞悬浮液在500 x g和4摄氏度下离心5分钟，补偿珠在300 x g和4摄氏度下离心5分钟。
离心样品后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于300微升洗涤缓冲液中，并在300微升PBS和150， 000阴补偿微球中对照。将细胞样品保存在冰上，并在室温下将珠子样品放在铝箔下。通过设置门控策略来鉴定纤维脂肪原祖细胞和肌原祖细胞，继续进行流式细胞术采集。
在代表性分析中，证实了Sca-1 APC抗体与健康大鼠腓肠肌产生的补偿珠和细胞悬浮液的单染色的成功偶联。在单细胞悬浮液上滴定五种不同浓度的Sca-1 APC，并根据最大荧光强度和最少的背景染色确定抗体的最佳浓度。使用此处显示的门控策略对大鼠腓肠肌中的FAP和MP进行流式细胞术鉴定。
首先对样品进行门控，以排除计数珠中的碎片。然后对细胞进行门控，以通过前散射和侧散射特性排除双倍体。通过用SYTOX蓝染色来评估所得细胞的活力。
对SYTOX蓝光阴性单线态进行CD31和CD45评估，以排除Lin+组分。评估了林族人口。Sca-1单阳性的细胞被指定为FAPs，VCAM-1单阳性的细胞被指定为MP。
在分选后立即进行联合免疫染色，新鲜分离的FAPs群体显示出PDGFRalpha阳性染色，没有受到Pax7阳性细胞的污染。相反，对Pax7染色的MP群体进行排序，没有PDGFRalpha阳性细胞。FAPs在第12天在脂肪生成分化培养基中显示出分化的成纤维细胞和脂肪细胞，分别表达成纤维细胞特异性蛋白1和perilipin 1。
来自成熟脂肪细胞的中性甘油三酯和脂质的存在在油红O染色中很明显。此外，FAPs显示存在I型胶原蛋白和没有污染的肌细胞。第12天在肌原分化培养基中生长的MP显示出成熟肌细胞的存在并融合了多核肌管，并且没有成纤维细胞和脂肪细胞污染。
当使用这种技术分离活细胞进行长期培养时，研究人员必须确保使用无菌技术，同时有效地工作，以确保良好的细胞活力。
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概述
本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法，重点针对肌肉损伤模型以提高组织可获得性。该方案可有效分离并表征损伤后FAP的动态变化，为体外和离体研究提供重要信息。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 肌肉再生
- 病理性纤维化
背景
- FAPs 在肌肉恢复和病理状态下起着关键作用。
- 以往的研究主要使用小鼠模型；本方案将重点转向大鼠。
- 大鼠提供的组织量更充足，有利于下游检测的开展。
使用的方法
- 离心和胶原酶处理用于细胞分离
- 大鼠骨骼肌作为生物模型
- 流式细胞术用于FAP和MP的鉴定
主要结果
- 成功从大鼠肌肉组织中分离出具有活性的纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）。
- 损伤后对FAP和肌肉前体细胞（MP）群体的表征。
- 经验证的实验方案和条件可提高细胞存活率。
结论
- 本研究展示了分离和分析肌肉前体细胞的有效方法。
- 这些发现对于理解肌肉健康与疾病具有重要意义。
常见问题
行业重要性概述
在大鼠骨骼肌中稳健地鉴定和分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs），可实现对肌肉损伤与再生过程更高保真度的建模，从而支持转化研究和靶点验证。该方案具有可扩展性且组织得率高，可解决肌肉疾病研究领域下游检测开发和机制性风险排除中的关键瓶颈。这一能力有助于提升肌肉靶向治疗药物在早期发现和临床前关键节点的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可探究FAP和MP在肌肉再生和纤维化中的作用。
- 通过分离纯化的细胞群体用于机制研究，支持靶点的功能性验证。
- 通过阐明损伤后前体细胞的动态变化，有助于预测性降低研发风险。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的物种特异性细胞群体，用于可重复的体外和离体实验。
- 标准化基于流式细胞术的设门策略和抗体验证，适用于大鼠肌肉模型。
- 实现对细胞活力和分化潜能的定量评估，以确保实验的可用性。
转化与临床前研究
- 通过在大鼠肌肉损伤和萎缩模型中开展纵向研究，与疾病相关模型保持一致。
- 通过提供可扩展的组织和细胞来源，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过在大鼠中实现系列性、非终末性的功能评估，提高基于风险调整的推进决策质量。
流程与工作流整合
本方案通过实现大鼠模型中肌肉前体细胞的分离、表征及后续功能分析，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：支持对前体细胞功能及信号通路在肌肉修复中作用的假设验证。
- Screening：提供可重复、定量的基于细胞的检测输入，用于化合物评估。
- Analytics：提供基于流式细胞术的读数以及免疫染色验证，用于比较研究。
- Translational Research：促进与肌肉损伤和再生模型中疾病相关终点的对接。
- Enterprise Reuse：建立可在多个研究项目中重复使用的鼠源肌肉前体细胞分离方案。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肌肉生物学研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：增强细胞分离工作流程的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：提升靶向肌肉的研发项目中“推进/终止”决策的质量与资本使用效率。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的肌肉疾病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、抗体偶联和细胞培养技术方面的专业知识。
- 需要获得经过验证的适用于大鼠模型的抗体以及相应的分析基础设施。
- 需要跨团队统一门控策略和细胞活力对照的标准操作流程。
- 对于高度纤维化或去神经支配的肌肉组织，可能需要进行方法调整。
- 细胞活力对处理时间和操作人员的操作效率较为敏感。
