Name: 大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习从大鼠骨骼肌中分离纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法，使用胶原酶消化和流式细胞术进行鉴定与表征。该技术为肌肉再生和病理纤维化研究提供了重要的体外和离体实验基础。

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我们感谢渥太华大学流式细胞术核心设施以及圣迈克尔医院Unity健康多伦多生物医学科学基南研究中心（KRC）在优化本论文所述流式细胞术/FACS方案方面提供的专业知识和指导。本研究由“通过设计实现医学进步”新理念2018基金（MbDNI-2018-01）资助，资助对象为JB。

作者声明无利益冲突。

一种经过优化且已验证的大鼠肌肉FAPs分离方案，对于希望研究因生物学或技术原因无法在小鼠中实施的损伤模型的研究人员至关重要。例如，小鼠并非研究慢性局部损伤或神经退行性损伤（如长期失神经支配）的理想动物模型。从生物学角度看，小鼠寿命短、衰老迅速，使得难以准确区分失神经支配引起的肌肉继发性改变与衰老这一混杂因素的影响。从技术角度看，由于严重萎缩导致肌肉质量显著减少，不足以进行有效的流式细胞术分析。事实上，现有小鼠FAPs分离方案建议将健康肌肉组织合并处理，以提高分选FAPs的得率29。尽管这种方法克服了获取足够肌肉组织进行分析的技术障碍，但同时也限制了研究人员在特定肌肉水平上对FAPs进行评估的能力。由于不同肌群在肌纤维类型组成、血管化程度以及线粒体数量等方面本就存在固有差异47&#160;，例如，将多种不同肌肉合并进行流式细胞术分析会阻碍对特定肌肉FAPs的特征解析。相比之下，我们证明无论是健康的，还是长期失神经支配后发生萎缩和纤维化的的大鼠腓肠肌，均能提供足够量的起始材料用于有效的流式细胞术分析。此外，在健康样本中，多余的肌肉组织还可进一步细...

纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类存在于骨骼肌中的常驻多能祖细胞，在肌肉稳态、修复和再生中发挥关键作用；相反，它们也介导了肌肉损伤后的病理性反应。顾名思义，FAPs最初被鉴定为具有分化为成纤维细胞和脂肪细胞潜能的祖细胞群体1&#160;，并被认为是在慢性损伤和疾病状态下骨骼肌发生纤维-脂肪浸润的关键介导者。进一步研究表明，FAPs还具备成骨和软骨生成能力2,3,4。因此，在文献中更广泛地将其标记为间充质或基质祖细胞3,5,6,7,8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖，为活化的肌肉卫星细胞及其下游的成肌祖细胞（MPs）提供有利微环境，从而间接促进再生性成肌过程1,9,10。随着再生成功完成，FAPs经历凋亡，数量恢复至基础水平1,9,10,11。相比之下，在慢性肌肉损伤中，FAPs会克服促凋亡信号，导致其持续存在9,10,11&#160;并引发异常的肌肉修复。
体内 迄今为止，研究FAPs介导肌肉反应的细胞和分子机制的研究均采用小鼠动物模型1,7,9,10,11,12,13,14. 虽然基因工程小鼠是强大的研究工具，可用于&#160;在这些分析中的应用，动物体型较小限制了组织的可获取性，尤其是在肌肉萎缩可能极为显著的长期局部损伤模型中，例如创伤性去神经支配。此外，肌肉力量和身体功能的测量需要 离体 或 原位 需要终止小鼠的测量，或 体内 需要手术和/或全身麻醉以评估肌肉收缩功能的方法15,16,17,18,19,20在大鼠中，存在多种经过充分验证且全球广泛使用的肌肉功能分析方法，此外还包括针对更复杂运动行为的分析方法，例如步态分析（如坐骨神经功能指数、CatWalk分析），这些分析均在清醒且自发运动的动物中进行。21,22,23,24这进一步优化了动物实验中尽量减少动物伤害的原则，并减少了实验动物的使用数量。大鼠模型为FAPs研究者提供了更大的损伤肌肉体积，便于进行蛋白质和细胞分析，同时能够在清醒动物中连续评估肌肉复合体的静态与动态功能活动及行为。
FAPs 主要通过流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）分别从完整的肌肉样本中鉴定和分离。这些基于激光的检测方法能够根据细胞的大小、颗粒度以及特定的细胞表面或细胞内标志物组合等特征，识别多种特定的细胞群体。25。这对于骨骼肌等器官系统的研究具有显著优势，因为稳态和再生过程是&#160;由多种细胞类型协调的复杂、多因素过程。一项开创性研究利用流式细胞术在小鼠骨骼肌中鉴定出FAPs以及MPs。1他们证明FAPs具有间充质特性，因为它们缺乏内皮细胞（CD31）、造血细胞（CD45）或肌源性细胞（整合素-α7 [ITGA7]）特异的表面抗原，但表达间充质干细胞标志物Sca-1（干细胞抗原1）。1&#160;并在培养中分化为成纤维细胞和脂肪细胞。其他研究证实，基于替代性干细胞标志物血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）的表达，可成功从肌肉中分离出间充质前体细胞。2,7,8&#160;进一步分析表明，这些很可能与FAPs属于同一细胞群体3FAPs 现在通常通过流式细胞术，以 Sca-1 或 PDGFRα 作为阳性选择标志物进行鉴定。1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31. 使用PDGFRα更适用于人类组织&#160;然而，目前尚未鉴定出小鼠 Sca-1 的直接人类同源物32此外，已有研究报道其他细胞表面蛋白可作为微囊泡（MPs）的标志物（例如 VCAM-1），这为在分离脂肪间质细胞（FAPs）过程中识别肌源性谱系细胞提供了替代 ITGA7 的潜在指标33.
尽管流式细胞术/FACS 是研究骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）作用及其致病潜力的强大方法1,9,10,11,13,29，但其技术上受限于所需试剂的特异性和优化程度。由于FAPs的流式细胞术鉴定与分离技术是在小鼠动物模型中建立并实施的1,9,10,11,29，这为希望在其他模式生物中研究FAPs的研究人员带来了挑战。许多因素——例如待处理组织的最佳大小，以及试剂和/或抗体的特异性与可获得性——均因所用物种的不同而存在差异。
除了在新型动物模型中研究FAPs存在技术障碍外，目前对FAPs的研究主要集中在急性毒性环境下进行，通常通过肌肉内化学注射或心脏毒素处理来实现。关于FAPs长期动态变化的研究，主要局限于杜氏肌营养不良症的mdx小鼠模型9,10,11，以及复合性肌肉损伤模型，例如在肩部肌肉上同时造成肌腱横断和去神经支配的大规模肩袖撕裂模型26,27,28。而对于慢性创伤性去神经支配这一单一损伤因素所引发的FAPs反应——这种情况在重工业、农业中的工伤事故以及出生时的创伤（臂丛神经损伤）34,35,36,37&#160;中较为常见且具有显著的发病率——目前尚缺乏充分表征，相关研究往往局限于短期时间范围11,38。
我们描述了一种用于鉴定和分离大鼠健康骨骼肌以及严重萎缩和纤维化骨骼肌中FAPs和MPs的方法。首先，通过组织消化和流式细胞术染色方案，鉴定CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs和CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs，并通过培养及对FACS分离细胞进行免疫细胞化学染色来验证研究结果。利用该方法，我们还报道了在大鼠长期孤立性失神经损伤模型中FAPs的全新时间进程。

<table><tbody><tr><td>5 mL 聚丙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的 5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>ThermoFisher</td><td>130185</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 玻璃盖玻片，No.2</td><td>VWR</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Beckton Dickenson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>FroggaBio</td><td>91014</td><td></td></tr><tr><td>20 号针头</td><td>Beckton Dickenson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>40&amp;micro;m 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>FroggaBio</td><td>TB50</td><td></td></tr><tr><td>AbC 总抗体补偿微珠&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵，试剂级</td><td>Bioshop</td><td>AMC303.500</td><td></td></tr><tr><td>APC 偶联试剂盒，50–100&amp;micro;g</td><td>Biotium</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex 水性封片介质</td><td>Merck</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>Biolaminin 411 LN</td><td>Biolamina</td><td>LN411</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Bioshop</td><td>CCL444.500</td><td></td></tr><tr><td>II 型胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Plus 绝对计数微珠</td><td>ThermoFisher</td><td>C36995</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基 (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>(+)4.5 g/L D-葡萄糖&lt;br/&gt; (+)L-谷氨酰胺&lt;br/&gt; (+)110 mg/L 丙酮酸钠 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>FisherScientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>FACSClean 清洗液</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 软件</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FACSRinse 冲洗液</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术鞘液</td><td>Beckton Dickenson</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>荧光封片介质</td><td>Dako</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 Alexa Fluor 555 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 488 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 Alexa Fluor 555 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10 培养基</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>11550043</td><td>(+) 酚红&lt;br/&gt; (+) L-谷氨酰胺&lt;br/&gt; (-) HEPES</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (HBSS) (1X)</td><td>Multicell</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>热灭活马血清</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Reichert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，滴定纯度不低于 99.5%</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>ThermoFisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>人转化生长因子 &amp;beta;1 (hTGF-&amp;beta;1)</td><td>Cell Signaling</td><td>8915LF</td><td></td></tr><tr><td>Humulin R</td><td>Lilly</td><td>HI0210</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5879</td><td>又称 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>又称 2-丙醇</td></tr><tr><td>雌性 Lewis 大鼠</td><td>Charles River Kingston</td><td>004 (品系编号)</td><td>使用体重 200–250 克</td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20 台式流式细胞仪</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5417R</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP 细胞分选仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 CD31::FITC 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab33858</td><td>克隆号 TLD-3A12</td></tr><tr><td>小鼠抗 CD45::FITC 抗体</td><td>Biolegend</td><td>202205</td><td>克隆号 OX-1</td></tr><tr><td>小鼠抗 CD106::PE 抗体</td><td>Biolegend</td><td>200403</td><td>又称 VCAM-1</td></tr><tr><td>小鼠抗 MHC 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>N/A</td><td>又称 MF20</td></tr><tr><td>小鼠抗 Pax7 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库 (DSHB)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林，10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>油红 O</td><td>Millipore Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 偶联试剂盒</td><td>Abcam</td><td>ab102903</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>(-)氯化钙&lt;br/&gt; (-)氯化镁 </td></tr><tr><td>碳酸氢钾，试剂级</td><td>Bioshop</td><td>PBC401.250</td><td></td></tr><tr><td>兔抗成纤维细胞特异性蛋白 1 (FSP-1) 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-32347</td><td>FSP-1 又称 S100A4</td></tr><tr><td>兔抗整合素-a7 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab203254</td><td></td></tr><tr><td>兔抗层粘连蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Perilipin-1 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab3526</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Sca-1 抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB4336</td><td></td></tr><tr><td>兔重组抗 I 型胶原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td>又称 Col1a1</td></tr><tr><td>兔重组抗 PDGFR Alpha 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab203491</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子 (FGF-basic)</td><td>Gibco</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100 (Triton-X-100)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>曲格列酮</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20 (Tween-20)</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（faps）与肌源性祖细胞（mps）的鉴定、分离与表征

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中固有的间质细胞，与肌源性祖细胞（MPs）共同在肌肉稳态、损伤及修复过程中发挥关键作用。目前针对FAPs的鉴定与分离方案主要依赖流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），而迄今为止评估其功能的体内研究均 exclusively 在小鼠中开展。大鼠固有的体型较大，使得在骨骼肌损伤模型中对FAPs进行更全面的分析成为可能，尤其适用于严重萎缩的肌肉组织，或当研究人员需要大量组织样本以开展多项下游检测的情况。此外，大鼠还提供了更多可选的肌肉功能检测方法，这些方法无需对动物进行镇静或处死，从而通过连续多次评估显著降低动物发病率并减少动物使用量。目前为小鼠优化的流式细胞术/FACS方案具有物种特异性，尤其受限于 commercially available 抗体的特性，尚未针对大鼠或高度纤维化的肌肉组织中的FAPs分离进行优化。本研究建立了一种适用于健康及去神经支配大鼠骨骼肌中FAPs和MPs鉴定与分离的流式细胞术/FACS方案，该方案基于表面标志物CD31、CD45、Sca-1和VCAM-1的差异表达。由于经流式细胞术验证的、针对大鼠特异性的初级抗体极为有限，本研究自行完成了靶向Sca-1抗体的标记偶联。通过该方案，成功验证了Sca-1抗体的偶联效果，并通过细胞培养及对FACS分离获得的FAPs和MPs进行免疫染色，确认了流式细胞术对两类细胞的鉴定准确性。最后，我们报道了一种在长期（14周）大鼠去神经支配模型中FAPs动态变化的 novel 时间进程。该方法使研究人员能够在一种 novel 动物模型中开展FAPs的相关研究。

使用包含 Sca-1 和 VCAM-1 的新型抗体组合通过流式细胞术鉴定 FAP 和 MPs 
在大鼠肌肉中鉴定 FAP 的设门策略基于小鼠的流式细胞术方案29，该方案通过设门排除 CD31（内皮细胞）和 CD45（造血细胞）阳性细胞（称为谱系细胞 [Lin]），并在谱系阴性（Lin-）群体中分析 FAP 标记物 Sca-1 和 MPs 标记物 ITGA7 的荧光信号。由于目前尚无商业化、荧光标记且经流式细胞术验证的适用于大鼠 Sca-1 和 ITGA7 的抗体，我们自行将 Sca-1 抗体与 APC 进行偶联，并采用替代策略来鉴定 MPs。最近研究表明，VCAM-1 可作为有效的大鼠 MPs 单阳性筛选标记33，且已有商品化的、针对大鼠特异性的、荧光标记并经流式细胞术验证的抗 VCAM-1 抗体，因此我们选择使用 VCAM-1 而非 ITGA7 来鉴定 MPs。
我们通过使用补偿微珠和来自健康大鼠腓肠肌的细胞悬液进行单一染色，验证了Sca-1:A...

本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。

大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中固有的间质细胞，与肌源性祖细胞（MPs）共同在……中发挥关键作用。

由于FAPs是肌肉再生和病理性纤维化的重要中介因子，本方案可实现对肌肉损伤后FAP动态变化的表征，并可用于体外或离体研究中FAPs的分离。迄今为止，相关研究均仅基于从小鼠中分离的FAPs。本方案能够高效地从体型更大的大鼠中分离FAPs，从而为后续检测提供更充足的组织来源。过长的组织处理时间可能对FAPs的活力产生不利影响。若同时处理多个样本，建议由两名操作人员协同进行实验操作，以最大程度地维持分离细胞的活力。首先，将收获的肌肉组织置于无菌的10厘米细胞培养皿中。用镊子轻轻撕碎组织并剪成小块，去除结缔组织，获得约三到四立方毫米大小的组织块。将剪碎的组织转移至含有六毫升 DMEM 和 1% 青霉素-链霉素的无菌 50 毫升锥形管中。接着，通过加入 10 微升 300 毫摩尔氯化钙溶液，激活 365 微升胶原酶 II 溶液。将激活的胶原酶II溶液加入组织匀浆中，使终浓度为每毫升250单位。将试管置于37摄氏度、240 × g 条件下振荡孵育1小时，每15分钟手动震荡一次，以使黏附在管壁的组织脱落。孵育1小时后，向样品中加入100微升胶原酶II和50微升分散酶。然后，使用血清移液管将样品反复吹打15至20次，直至溶液均匀。将样品在37摄氏度、240 × g条件下再次孵育30分钟，每15分钟手动振荡一次。使用带有20号针头的20毫升注射器，将肌肉溶液样品缓慢剪切10个循环。然后，将一个40微米的细胞筛置于无菌的50毫升锥形管上，并通过移液加入5毫升含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基润湿筛网。每次移取1毫升样品，通过筛网过滤。待全部样品过滤完毕后，用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基冲洗细胞筛，使样品总体积达到25毫升。将样品体积均分为两份，分别加入两个15毫升的锥形管中，在15摄氏度、400 × g条件下离心15分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升室温的红细胞裂解缓冲液中，孵育7分钟。随后，加入9毫升洗涤缓冲液，使总体积达到10毫升，在15摄氏度、400 × g条件下再次离心15分钟。离心后，吸除上清液，并将沉淀物重悬于1毫升洗涤缓冲液中。取适量细胞转移至另一个1.5毫升微量离心管中，与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数板在光学显微镜下计数活细胞。进行流式细胞术时，将每份实验样品的1至200万个细胞转移至无菌的1.5毫升微量离心管中。用洗涤缓冲液将样品体积调至1毫升，并将试管置于冰上。设置实验所需的所有对照。对于细胞对照，将500,000至100万个细胞分装至1.5毫升微量离心管中，加入1毫升洗涤缓冲液，置于冰上。若为首次进行实验，还应包括单染细胞悬液。为设置微珠对照，向每个标记的1.5毫升离心管中加入约150,000个阳性补偿微珠。通过将活力检测管中一半的细胞体积转移至新标记为“dead”的1.5毫升微量离心管中，制备活力对照。将“dead”管在65摄氏度孵育2到3分钟，然后置于冰上。孵育结束后，将失活的细胞重新返回至活力检测管中。将单细胞悬液（包括实验组和对照组样品）在4℃条件下以500 × g离心5分钟，吸去上清液后，用100 µL洗涤缓冲液重悬细胞沉淀。根据对照组或实验组条件加入抗体，轻轻弹动样品管以确保充分混匀。随后将样品置于冰上避光孵育15分钟。对于补偿微珠，将试管置于室温避光孵育15分钟。向单细胞悬液中加入900 µL洗涤缓冲液，向补偿微珠对照中加入900 µL PBS，使各管体积均调整至1 mL。将单细胞悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，补偿微珠对照在300 × g、4 °C条件下离心5分钟。样品离心后，吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 300 µL 洗涤缓冲液中，将磁珠对照重悬于 300 µL PBS 和 150,000 个阴性补偿磁珠中。将细胞样品置于冰上，磁珠样品用铝箔包裹后置于室温下。通过设置门控策略进行流式细胞术检测，以鉴定成纤维-脂肪生成祖细胞和肌源性祖细胞。在代表性分析中，通过使用补偿微珠和来自健康大鼠腓肠肌的单细胞悬液进行单染色，证实了Sca-1 APC抗体的成功偶联。在单细胞悬液上滴定五种不同浓度的Sca-1 APC，并根据荧光强度最强且背景染色最小的原则确定抗体的最佳浓度。采用此处所示的设门策略，对大鼠腓肠肌中的FAPs和MPs进行流式细胞术鉴定。首先对样本进行设门，以排除计数微球中的碎片。然后根据前向散射和侧向散射特征对细胞进行设门，以排除双联体。通过SYTOX Blue染色评估所得细胞的活力。通过CD31和CD45对SYTOX Blue阴性单细胞进行分析，以排除Lin+细胞群。对Lin-细胞群进行检测。仅Sca-1单阳性细胞定义为FAPs，仅VCAM-1单阳性细胞定义为MPs。分选后立即进行共免疫染色显示，新分离的FAP群体对PDGFRalpha呈阳性染色，且无Pax7阳性细胞污染。相反，分选后的MP群体对Pax7呈阳性染色，且无PDGFRalpha阳性细胞。在成脂分化培养基中培养至第12天时，FAPs分化为成纤维细胞和脂肪细胞，分别表达成纤维细胞特异性蛋白1和perilipin 1。通过油红O染色可明显观察到成熟脂肪细胞中存在中性甘油三酯和脂质。此外，脂肪间质细胞（FAPs）表现出I型胶原的存在，且无污染的肌细胞。在成肌分化培养基中培养至第12天的肌源性细胞（MPs）显示出成熟肌细胞和融合的多核肌管的存在，且无成纤维细胞和脂肪细胞污染。采用该技术分离活细胞用于长期培养时，研究人员必须在确保无菌操作的同时高效工作，以保证细胞具有良好的存活率。

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Research

科研

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Biology

生物学

大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征

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获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

准确鉴定纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌肉干细胞（MuSCs）对于研究其在生理和病理条件下的生物学功能至关重要。本方案提供了从成年小鼠肌肉中分离、纯化和培养FAPs与MuSCs的操作指南。...

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本实验方案的目的是建立一种口面部肌肉纤维化模型。通过比较小鼠咬肌与胫骨前肌在冷冻损伤后的组织学特征，证实了咬肌发生纤维化。该模型将有助于进一步研究口面部肌肉纤维化潜在的机制。...

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利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

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成年与胚胎骨骼肌微植块培养及骨骼肌干细胞的分离

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