Murine 模型心肌梗塞后 MSC 加载注射水凝胶的心内移植
September 20th, 2020
干细胞治疗已成为修复心肌梗塞后受伤的心脏组织的有效策略。我们使用明胶水凝胶为干细胞移植提供最佳的体内应用，这些水凝胶能够酶交叉连接。
这种方法可以帮助解决当前加重心脏治疗中的关键问题，例如对梗死心脏中移植细胞的低保留和存活的低适用性。为了解决这个问题，这种方法可以提供一种可靠的技术，在小鼠模型中使用可注射水凝胶研究干细胞的心肌内移植，这是研究心肌梗死后心脏组织修复和再生的绝佳平台。该技术的主要优点是，它是一种使用原位交联覆盖可注射水凝胶提高心肌内移植后移植干细胞保留和存活的可行方法。
这些水凝胶为心脏组织工程提供了多种机会，例如不仅输送干细胞，还输送生长因子、遗传物质和药物，以最大限度地提高它们在梗塞心脏组织中的治疗效果。演示体外实验程序的是我实验室的研究技术专家 Eunmi Lee。Eun-Hye Park 和 Eunhwa Seong 的研究技术人员将演示体内实验的程序。
在37 摄氏度和 5% 二氧化碳的 100 毫米培养皿中培养间充质干细胞或 MSC。当细胞达到 80% 汇合时，用 DPBS 洗涤培养皿两次，并与 1 毫升胰蛋白酶替代品在 37 摄氏度下孵育 3 分钟。然后向细胞中加入 9 毫升培养基，并以 500 次 G 离心 3 分钟。
丢弃所得上清液。将细胞重悬于 1 mL PBS 中，并将细胞悬液保持在冰上。用 10 μL 台盼蓝稀释 10 μL 细胞悬液，并使用自动细胞计数器测定细胞浓度。
将 MSC 重悬至每毫升第 7 个细胞的 1 倍 10 倍，然后将它们转移到 1 毫升试管中。在 PBS 中制备 6.25% GH 偶联物溶液，并将其分成两个小瓶中。接下来，将 GH 溶液与每毫升 6 微克 HRP 或 0.07% 过氧化氢混合。
以1000 倍 G 短暂离心细胞悬液，并小心吸出所得上清液。然后将细胞沉淀与 GH 溶液 A 混合，将 GH 溶液 A 和 GH 溶液 B 中的 MSC 加载到双注射器的任一侧。将 300 微升含 MSC 的混合 GH 溶液以每毫升 500 万个细胞的最终密度接种到八孔室载玻片上。
在原位水凝胶形成和随后通过酶交联进行 MSC 包封后，加入 700 微升含有 10% FBS 和 1% 抗生素抗真菌溶液的 DMEM。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育玻片，并每两到三天更换一次培养基。手术前，使用脱毛霜对小鼠胸部进行消毒，并用碘对皮肤进行消毒。
将鼠标放在手术台上，通过将导管插入气管进行插管，以通过机械通气提供补充氧气。用手术剪刀轻轻剪开皮肤。然后用微型剪刀穿透肋间肌。
使用 5-O 丝缝合线将第二根和第三根左肋骨分开，以保持胸腔开放。使用带有 8-0 的持针器小心地结扎左前降支冠状动脉聚丙烯缝合并使用电烙术切割缝合线。观察到左心室前壁的颜色立即发生变化。
诱发心肌梗死后，将 10 微升 MSC 负载 GH 溶液注射到梗死交界区的两个不同点。使用 5-0 缝合线恢复张开的胸腔并闭合肌肉和皮肤。在恢复过程中，取出气管插管，将鼠标放在红外灯下的笼子里。
进行超声心动图检查并测量 LV 前壁、LV 内壁和 LV 后壁的相应线路，以获得心脏壁厚度、腔室尺寸和缩短分数。在体内移植之前，通过 3D 体外活死细胞染色测定证实 MSC 在 GH 水合物中的增殖和存活。代表性图像显示足够的 MSC 增殖，显示 GH 水凝胶内的支链网络。
在第 14 天清楚地观察到 MSC 的广泛多细胞 3D 结构，表明 GH 水凝胶可以为包膜细胞提供适当的微环境。诱导心肌梗死后，将 MSC 负载 GH 水凝胶心内移植至梗死周围区域。MSCs 和凝胶在梗死区域内得到适当维持。
MSC 很好地整合到 GH 水凝胶中。为验证 MSC 负载 GH 水凝胶的治疗效果，在移植后 28 天通过超声心动图和组织学分析评估心脏功能和结构的变化，并在不同治疗组之间进行比较。代表性超声心动图显示 MSC 凝胶治疗组的心脏功能改善，包括缩短分数、射血分数和收缩末期容积。
此外，组织学分析显示 MSC 凝胶治疗组的纤维化较少、梗死壁较厚且梗死面积小于其他组，表明该方案显着减弱了 LV 重塑。使用这项技术，我们在小鼠模型中实现了长期干细胞的进入和增殖，并导致心肌梗死后心脏结构和功能的显着改善。该技术可以扩展到大型动物的使用，并通过提供心脏组织修复和再生作为预防梗死后心力衰竭的新策略进行临床转化。
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概述
本研究提出了一种新的方法，用于心脏组织修复中的干细胞移植，使用酶交联明胶水凝胶。该方法旨在增强梗阻心脏中移植细胞的保留和存活。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏组织工程
- 干细胞疗法
- 水凝胶应用
背景
- 当前的心脏治疗面临着细胞保留率低等挑战。
- 基于干细胞的疗法对心肌梗塞的恢复很有前景。
- 可注射水凝胶可以改善治疗剂的递送。
- 体内模型对于研究心脏修复机制至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的心肌内干细胞移植技术。
- 研究明胶水凝胶在增强细胞存活中的有效性。
- 探索水凝胶在递送生长因子和药物方面的潜力。
使用的方法
- 使用小鼠模型进行体内实验。
- 用于干细胞递送的酶交联明胶水凝胶。
- 研究技术人员示范程序。
- 评估移植后的细胞保留和存活。
主要结果
- 改善了心脏组织中移植干细胞的保留。
- 使用可注射水凝胶增强了细胞的存活率。
- 在体外和体内环境中成功示范了该方法。
- 水凝胶有可能递送额外的治疗剂。
结论
- 该方法为心脏组织修复提供了一种可行的解决方案。
- 水凝胶可以显著改善干细胞疗法的效果。
- 这种方法为心脏再生研究开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Current cardiac stem cell therapies face challenges with low retention and survival of transplanted cells in infarcted myocardium, limiting therapeutic efficacy. This protocol introduces an injectable hydrogel platform to improve MSC delivery and engraftment in a murine myocardial infarction model. The approach supports preclinical evaluation of biomaterial-enhanced cell therapies for cardiac tissue repair and regeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell engraftment mechanisms in ischemic tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible model to assess cell survival post-transplantation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports development of standardized hydrogel-based cell delivery systems.
- Operational Value: Facilitates quantitative assessment of MSC proliferation and survival in 3D culture.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates functional improvement in cardiac structure and function post-MI.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment via echocardiography and histology at day 28.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting early validation of stem cell delivery systems prior to lead optimization and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Tests hydrogel-mediated enhancement of MSC retention in infarcted myocardium.
- Screening: Enables standardized preparation and characterization of MSC-hydrogel constructs.
- Analytics: Provides quantitative readouts via live/dead staining, echocardiography, and histological analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to in vivo outcomes in a disease-relevant murine model.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform adaptable for co-delivery of growth factors, genetic materials, or drugs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in stem cell therapy outcomes by enhancing cell retention and survival.
- Operational Value: Offers a simple, in situ cross-linkable hydrogel system for reproducible cell delivery.
- Strategic Value: Reduces biological risk in cardiac regeneration programs by addressing a key limitation of cell therapies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of biomaterial-stem cell combinations for post-infarct heart failure prevention.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mesenchymal stem cell culture and hydrogel preparation.
- Necessitates microsurgical skills for LAD ligation and intramyocardial injection in mice.
- Depends on standardized cell concentration and viability assessment via trypan blue exclusion.
- Requires controlled in vitro culture conditions to validate MSC proliferation prior to transplantation.
- Limited to small animal models; scalability to large animals or clinical settings requires further validation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:49
Preparation of MSCs and Injectable Gelatin Hydrogels
3:38
In Situ MSC-loading and Three-dimensional in Vitro Culture
4:29
Induction of Myocardial Infarction in Mice
5:44
Intramyocardial Transplantation of MSC-loading GH Hydrogels
6:37
Results: Improving Stem Cell Retention and Engraftment with Injectable Hydrogels
8:31
Conclusion
