小鼠心肌梗死模型中注射型水凝胶负载间充质干细胞的心肌内移植

该方法有助于解决当前加重的心脏治疗中的一些关键问题，例如移植细胞在梗死心脏中留存率低和存活率低导致的应用范围受限。为解决这一问题，该方法可提供一种可靠的技术，用于在小鼠模型中研究通过可注射水凝胶进行心肌内移植干细胞，该模型是研究心肌梗死后心脏组织修复与再生的优秀平台。该技术的主要优势在于，它是一种可行的方法，可通过原位交联包覆的可注射水凝胶，提高干细胞在心肌内移植后的留存率和存活率。

这些水凝胶为心肌组织工程提供了多种应用前景，例如不仅可递送干细胞，还可递送生长因子、遗传物质和药物，以最大限度地增强其在梗死心肌组织中的治疗效果。体外实验操作流程将由本实验室的研究技术员李恩美（Eunmi Lee）进行示范。朴恩惠（Eun-Hye Park）和成恩华（Eunhwa Seong）两位研究技术员将示范体内实验的操作流程。

在37摄氏度和5%二氧化碳条件下，在100毫米培养皿中培养间充质干细胞（MSCs）。当细胞达到80%融合度时，用DPBS洗涤培养皿两次，并加入1毫升胰蛋白酶替代物，在37摄氏度下孵育3分钟。然后向细胞中加入9毫升培养基，以500 × g离心3分钟。

弃去所得上清液。将细胞重悬于1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并将细胞悬液置于冰上保存。取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合稀释，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。

将MSC重悬至浓度为1×10⁷个细胞/毫升，并转移至1毫升离心管中。在PBS中配制6.25%的GH偶联物溶液，并分装至两个小瓶中。随后将GH溶液分别与6微克/毫升的HRP或0.07%过氧化氢混合。

将细胞悬液在1000 × g条件下短暂离心，小心吸除上清液。然后将细胞沉淀与GH溶液A混合。将含有MSCs的GH溶液A和GH溶液B分别加入双筒注射器的两侧。取300微升含MSCs的混合GH溶液，以每毫升500万个细胞的终浓度，接种至八孔腔室载玻片中。

原位水凝胶形成并通过酶交联包封间充质干细胞后，加入700微升含有10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基。将载玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，每两至三天更换一次培养基。手术前，使用脱毛膏去除小鼠胸部毛发，并用碘液对皮肤进行消毒。

将小鼠置于手术台上，通过向气管插入导管进行插管，以机械通气方式提供辅助氧气。使用手术剪轻轻切开皮肤，随后用显微剪刺入肋间肌。

使用5-0丝线缝合分离左侧第二和第三肋骨，以保持胸腔开放。使用持针器以8-0聚丙烯缝线小心结扎左前降支冠状动脉，并用电灼法切断缝线。观察左心室前壁立即出现的颜色变化。

诱导心肌梗死后，在梗死边缘区的两个不同位点各注射10微升负载GH的MSC溶液。复位打开的胸腔，并使用5-0缝线缝合肌肉和皮肤。拔除气管插管，将小鼠置于铺有红外灯的笼子中恢复。

进行超声心动图检查，测量左心室前壁、左心室内径和左心室后壁的相应径线，以获取心肌壁厚度、心腔大小及缩短分数。在体内移植前，通过三维体外活死细胞染色实验确认间充质干细胞（MSCs）在GH水凝胶中的增殖与存活情况。代表性图像显示MSCs在GH水凝胶内充分增殖，形成分支状网络结构。

在第14天可明显观察到MSCs形成了广泛的多细胞三维结构，表明GH水凝胶能够为包封的细胞提供适宜的微环境。在诱导心肌梗死之后，将负载MSCs的GH水凝胶直接移植至梗死周围区域。MSCs和凝胶在梗死区域内得到了良好的维持。

MSCs 被良好地整合到 GH 水凝胶中。为验证负载 MSCs 的 GH 水凝胶的治疗效果，通过移植后第 28 天的超声心动图和组织学分析评估心脏功能和结构的变化，并在不同治疗组之间进行比较。代表性超声心动图显示，MSC 凝胶治疗组的心脏功能得到改善，包括缩短分数、射血分数以及收缩末期容积。

此外，组织学分析显示，与其它组相比，MSC凝胶治疗组的纤维化程度更轻、梗死区心壁更厚、梗死面积更小，表明该方案显著减轻了左心室重构。通过该技术，我们在小鼠心肌梗死模型中实现了干细胞的长期存留与增殖，并显著改善了心脏结构与功能。该技术可进一步拓展至大型动物研究，并有望转化为临床应用，作为一种通过促进心肌组织修复与再生来预防梗死后心力衰竭的新策略。