用于悬浮液中金纳米颗粒粒径分析的非对称流场-流场分离技术

采用不对称流场-流场分离技术结合外部尺寸校准，是准确测定悬浮液中金纳米颗粒尺寸分布的有力工具。AF4 覆盖了从 1 到 1000 纳米的完整尺寸范围。该方法不受样品组分组成的限制，即使对于分散性较差或复杂的样品也可适用。

AF4 的优势在于其极为广泛的应用范围，不仅涵盖不同性质和尺寸的纳米颗粒，还包括蛋白质、病毒以及合成或天然的大分子。首先，将任意尺寸的金纳米颗粒标准品以 50 毫克每升的浓度涡旋振荡两分钟，然后用超纯水按 1 比 4 的比例稀释该标准品。随后，将稀释后的溶液再涡旋振荡两分钟，以获得均一的悬浮液。

清洗系统后，打开 AF4 装置以更换 AF4 膜。用超纯水冲洗新膜，重新组装装置，然后将装置重新连接至 AF4-UV-vis 系统。

使用经过滤并脱气的洗脱液冲洗清洁后的 AF4-UV-vis 系统至少 30 分钟，设置进样尖端流速为 1 毫升/分钟，聚焦流速为 1 毫升/分钟，横向流速为 1.5 毫升/分钟，以平衡膜、稳定系统并检查是否存在潜在泄漏。系统压力应稳定在 4 至 12 bar 之间。为验证 AF4-UV-vis 系统性能，采用任意一种金纳米颗粒尺寸标准品，在不施加分离力的条件下进行直接进样运行，以测定质量回收率和保留时间的变异情况。

然后施加分离力进行一次分级运行。为制备用于外部分子量校准的金纳米颗粒尺寸标准品，将所有50毫克/升的金纳米颗粒尺寸标准品涡旋混匀2分钟，并用超纯水以1:4的比例稀释各相应样品用于分析。尺寸标准品制备完成后，在FFF方法选项卡中，将检测器流速设为500微升/分钟，进样流速设为500微升/分钟，进样时间设为0.1分钟。

设定洗脱时间为八分钟，不设定分离力，向系统中注入10微升第一种标准品。当所有尺寸标准品测定完成后，向系统中注入50微升第一种标准品。将检测器流速设定为500微升每分钟。

将延迟时间设为两分钟，进样流速设为每分钟200微升，持续五分钟，过渡时间为0.2分钟。聚焦流速将自动计算。设洗脱时间为60分钟，横向流速为每分钟一毫升。

该AF4方法采用恒定的横向流速，随后在10分钟内线性衰减至每分钟零微升。设置清洗步骤为9分钟，针尖流速为每分钟500微升。当所有金纳米颗粒尺寸标准品完成分离后，制备待测金纳米颗粒样品，并按照前述方法对未知金纳米颗粒样品进行直接进样测定及分离。

为分析数据，需将数据文件导入系统软件。在概览选项卡中显示测量结果，并从检测器列表中选择紫外-可见光检测器信号。为每次测量定义感兴趣的区域和基线，并根据需要调整信号和基线显示。

使用信号处理工具箱对任何含噪声的信号进行平滑处理，并使用“将处理参数分配给其他运行”功能，以便将参数应用于其他测量数据。要执行质量回收计算，请打开直接进样测量数据和分级分离数据。插入一次直接进样校准，并在直接进样校准设置视图中选择相应的直接进样测量数据。

将使用样品的进样体积和浓度来关联峰面积与进样量。接下来，使用“分配至选定粒子预设”功能，将获得的校准函数分配给相应的分级测量。然后，利用该方程通过比较分级测量与直接进样测量中相应紫外-可见光谱峰的峰面积，计算金纳米颗粒的质量回收率。

要显示结果，请打开定量结果计算。将根据峰面积显示质量浓度。通过将该值与注入浓度进行比较，可获得质量回收率。

在粒径校准窗口的“粒径”选项卡下，单击“选择用于校准的参考”表格中每个相应的测量项，以选择所有校准运行。所选的测量结果将显示在表格中。输入所有校准测量的水动力学半径。

函数和方程将显示在粒径校准函数窗口中。要将校准函数应用于未知金纳米颗粒样品的测量，请在“选择运行以分配”列表中选择相应的分级部分，并打开粒径分布计算以显示结果。计算得到的粒径将在尺寸分布窗口中显示，并标注在峰的最大值处。

先前创建的粒径校准将被列为未知金纳米颗粒样品测量的校准标准。要对一个样品的所有测量结果进行平均，请选中“对样品信号取平均”复选框。结果将显示在“峰最大值”标签中。

此处展示了一个典型的金纳米颗粒尺寸标准品通过场流分离（AF4）分离，并利用紫外-可见光谱在532纳米波长处检测其吸光度所得的叠加图谱。通过三次重复测量获得的每种纳米颗粒在其相应紫外-可见光谱峰最大值处的保留时间，其相对标准偏差均低于1.1%。对这些数据进行线性回归分析，得到线性校准函数，其平方相关系数（R²）为0.9958。随后对九个未知金纳米颗粒样品进行AF4-紫外-可见光谱分析，获得的相应保留时间的相对标准偏差显著较低，介于0.1%至0.5%之间。利用金纳米颗粒尺寸标准品分离所得的粒径校准函数，并将该函数与未知金纳米颗粒样品在紫外-可见光谱峰最大值处测得的保留时间相关联，可计算出其总体平均水力学半径。

此外，可获得合理的质量回收率，表明金纳米颗粒样品未发生显著的团聚或溶解，也未在膜表面发生明显的颗粒吸附。当使用外部尺寸校准和场流分离（AF4）分析时，至关重要的是将相同的AF4方法一致地应用于所有尺寸标准品和样品本身。AF4技术可帮助研究人员更深入地理解其纳米颗粒样品的特性。

因此，它是一种重要的质量控制工具，最终有助于提高纳米技术产品的功效。