Name: 悬浮中金纳米粒子尺寸的不对称流场-流分数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 学习使用非对称流场流分离技术结合紫外可见检测，准确测定悬浮液中金纳米粒子的尺寸分布。该方法适用于1至1000纳米范围的复杂样品分析。

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作者谨向整个ACEnano联盟致以感谢，感谢他们在本方案各个准备阶段所进行的富有成效的讨论。作者同时感谢欧洲联盟“地平线2020”计划（H2020）在ACEnano项目框架下根据资助协议编号720952提供的资金支持。

1. AF4 系统设置
<ol>
	<li>按照制造商手册中的说明，组装 AF4 色谱柱并连接 AF4 系统和紫外-可见检测器（材料表）的所有硬件组件。</li>
	<li>按照制造商手册中的说明，安装用于控制、数据采集、处理和分析的所有必要软件包。</li>
	<li>确保 AF4 系统与紫外-可见检测器之间的所有必要信号连接均已建立。</li>
	<li>通过以超纯水（UPW）冲洗系统 15 分钟（进样流速 1 mL∙min-1，聚焦流速 1 mL∙min-1，横向流速 1.5 mL∙min-1），确保已建立的 AF4-UV-vis 连接紧密且无泄漏。操作方法为：打开 AF4 控制软件，在主页右上方相应面板中输入流速。如有必要，拧紧相应接头（连接件），并重复该步骤直至无泄漏现象。 
	注意：所有测量过程中的系统内部压力应持续监测，且必须保持在 4 至 12 bar 范围内。若压力过高或过低，需调整背压管。此外，通道压力在整个测量期间应保持稳定。 
	注意：若配备通道恒温箱，应将其温度设定为 25 °C，以确保所有 AF4 实验在可比的测量条件下进行。</li>
</ol>
2. AF4-UV-vis 系统适用性及样品分析用溶液和悬浮液的制备
<ol>
	<li>清洗液
	<ol>
		<li>将 8 g 固体氢氧化钠 (NaOH) 和 2 g 十二烷基硫酸钠 (SDS) 加入 1 L 超纯水 (UPW) 中，搅拌至完全溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱液
	<ol>
		<li>将 500 μL 过滤后的表面活性剂混合物加入 2 L 经过滤并脱气的超纯水 (UPW) 中，配制成洗脱液（0.025% (v/v)，pH 约为 9.4）。 
		注意：表面活性剂混合物中各组分的详细说明见表 1（亦见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于质量回收率测定的任意金纳米颗粒 (AuNP) 尺寸标准品
	<ol>
		<li>将任意尺寸的金纳米颗粒标准品（50 mg∙L-1）涡旋振荡 2 分钟，用超纯水 (UPW) 按 1:4 比例稀释，得到最终质量浓度为 12.5 mg∙L-1 的溶液。稀释后再次涡旋振荡 2 分钟，以使所得悬浮液均匀混合。 
		警告：操作化学品时，特别是氢氧化钠颗粒，必须采取必要的预防措施并佩戴适当的防护装备。 
		注意：通常建议使用 0.1 µm 膜滤器（亲水性 PVDF 或类似材质）对所有所需溶液（清洗液除外）进行脱气和过滤，以确保在 AF4-UV-vis 实验过程中具有较低的颗粒本底。此步骤可通过专用的真空过滤装置或注射器滤器完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. AF4-UV-vis 系统确认
<ol>
	<li>使用步骤1.4中所述的软件设置，以清洗液冲洗系统30分钟（流速1 mL∙min⁻¹）-1，聚焦流速 1 mL·min⁻¹-1，以及交叉流速 1.5 mL·min⁻¹-1).</li>
	<li>更换相应的洗脱瓶，并用超纯水以1 mL·min⁻¹的流速冲洗系统20 min（提示-1，聚焦流速 1 mL·min⁻¹-1，以及交叉流速 1.5 mL·min-1).</li>
	<li>更换相应的在线泵滤芯。</li>
	<li>打开 AF4 芯片并更换 AF4 膜。重新组装 AF4 芯片，并将其与 AF4-UV-vis 系统重新连接。</li>
	<li>用洗脱液冲洗清洁后的 AF4-UV-vis 系统至少 30 分钟，以平衡膜并稳定系统（尖端流速 1 mL∙min⁻¹）-1，聚焦流速 1 mL·min⁻¹-1，以及交叉流速 1.5 mL·min⁻¹-1）。再次检查是否存在潜在泄漏（参见步骤 1.4）。</li>
	<li>使用任意尺寸的金纳米颗粒（AuNP）标准品，通过测定质量回收率和保留时间的变化来对场流分离-紫外-可见光谱联用系统（AF4-UV-vis）进行性能验证。
	<ol>
		<li>不施加分离力，直接进样运行。
		<ol>
			<li>通过打开创建一个新的测量文件 文件 | 新建 | 运行 在 AF4 控制软件中。</li>
			<li>定义样品和测量描述，以及进样体积和样品名称 运行 表。测量条件显示在 表2.</li>
			<li>在第二个选项卡中设置测量参数 FFF法 根据 表2.</li>
			<li>点击 运行 开始测量的按钮。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>施加分离力（横向流）进行分级分离运行。
		<ol>
			<li>根据前一节所述，使用指定的分级条件定义分级方法 表3.</li>
			<li>点击 运行 开始测量的按钮。</li>
			<li>四次重复测量。 
			注意：第一次运行旨在对系统（即 AF4 膜）进行预处理，其结果将不纳入系统合格性评估的最终结果中。 
			注意：建议通过打开保存所有生成的运行文件 文件 | 保存 在 AF4 控制软件中。</li>
			<li>若质量回收率达到以下标准，则认为AF4-UV-vis系统合格 &gt;80% 和保留时间的变化 &lt;对于任意的金纳米颗粒尺寸标准，获得2%的结果。</li>
			<li>使用自动进样器作为进样系统时，应将自动进样器针头清洗储液瓶中装入与AF4-UV-vis系统所泵送的相同溶液（例如清洗液、超纯水或相应洗脱液），以确保最佳运行条件。更换洗脱液时，通常建议通过监测UV-vis检测器信号来跟踪AF4系统的重新平衡过程，直至其基线稳定在恒定水平。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. AF4-UV-vis 样品分析
<ol>
	<li>通过将相应粒径的金纳米颗粒（AuNP）悬浮液（20 nm、40 nm、80 nm、100 nm，每种浓度为50 mg·L-1）涡旋振荡2分钟，然后以超纯水（UPW）按1:4比例稀释，获得最终质量浓度为12.5 mg·L-1的标准溶液。稀释后再次涡旋振荡2分钟，以确保悬浮液均匀混合。</li>
	<li>对未知AuNP样品采用与步骤4.1中所述校准标准品相同的处理方法进行分析前准备。</li>
	<li>使用表2所示的场流分离（AF4）方法，对所有AuNP粒径标准品进行直接进样测定。
	<ol>
		<li>将表2中汇总的相应参数值输入仪器制造商提供的软件中的对应位置，设定分离条件和样品参数，然后点击运行按钮以启动实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用表3所示的AF4方法对每种AuNP粒径标准品分别进行分馏，以建立外部粒径校准曲线。
	<ol>
		<li>将表3中汇总的相应参数值输入仪器制造商提供的软件中的对应位置。分馏方法包括聚焦步骤、多个洗脱步骤以及冲洗步骤。完成方法设置后，点击运行按钮以启动实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用表2所示的AF4方法对未知AuNP样品进行直接进样测定。</li>
	<li>按照表3所列的AF4方法对未知AuNP样品进行分馏。</li>
	<li>除非另有说明，否则应将第3节和第4节中提到的所有测量重复三次，以确保获得有意义且具有统计学意义的结果。
	<ol>
		<li>在使用前，将50 mg·L-1的AuNP储备悬浮液储存于4–8 °C条件下。稀释后的AuNP悬浮液建议在使用前30分钟内配制。 
		注：通常仅通过涡旋振荡即可充分分散，无需超声处理。</li>
		<li>为使未知AuNP样品的保留时间能够与AuNP粒径标准品的保留时间进行关联，所有样品应采用相同的AF4方法进行测定。 
		注：为确保分离条件的一致性和有效性，应在完成一定数量的样品测定（例如10次）后，插入或重复系统适用性测试部分所述的分馏步骤（见步骤3.6.2）。此外，应记录系统压力及紫外-可见光（UV-vis）检测器基线的稳定性，二者在整个AF4-UV-vis运行过程中应保持稳定且恒定。 
		注：通常情况下，当UV-vis检测器（或若有，多角度光散射（MALS）检测器）出现噪声水平升高，或系统适用性指标（如回收率、样品峰形或重复性）未达标时，应更换超滤膜；此外，在AF4-UV-vis系统经过彻底清洗后也应更换膜。在本文所述条件下，经验证的AF4-UV-vis系统使用同一张膜通常可稳定运行至少50次测定；然而，实际可连续运行并满足规定质量标准的测定次数会因样品、样品基质及洗脱液组成的不同而有显著差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据评估
<ol>
	<li>使用场流分离-紫外可见光（AF4-UV-vis）系统制造商提供的数据评估软件，或在按照制造商手册中的说明从相应的数据采集软件中导出所有必要的原始数据（即，UV-vis 峰面积）后，通过电子表格分析进行质量回收计算。
	<ol>
		<li>通过比较分级分离测量（Afractionation）和直接进样测量（Adirect injection）中相应 UV-vis 峰下的面积，使用以下公式计算 AuNP 的质量回收率： 
		<img alt="回收率计算公式，回收率 % = (A_f/A_d) × 100，方程图示，分析方法。" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> 
		注意：在直接进样测量中，不施加分离力，因此可忽略分析物与积累壁之间的潜在相互作用。在假设样品中无其他物质在相应波长处吸收 UV-vis 光，且/或 i) 在分级条件下在其他保留时间洗脱，ii) 被 AF4 膜去除的前提下，可通过比尔-朗伯定律将相应 UV-vis 峰下的面积直接关联至 AuNP 质量。</li>
		<li>导入从直接进样和分级运行中获得的 .dat 文件。</li>
		<li>在 概览 选项卡中选择 UV-vis 检测器信号轨迹。</li>
		<li>在所有测量的信号与基线视图中定义感兴趣区域（ROI）和基线。</li>
		<li>通过 插入 添加 直接进样校准。</li>
		<li>在 直接进样校准设置 视图中选择所有直接进样运行，并输入紫外吸收系数。 
		注意：必须在校准和分级测量中使用相同的 UV-vis 吸收系数。</li>
		<li>使用 ROI 内 UV-vis 信号轨迹下的面积以及根据输入浓度和进样体积计算的进样量建立校准曲线。所得校准结果将在独立的 直接进样校准函数 窗口中显示。</li>
		<li>将该校准函数分配给相应的分级测量。 
		注意：由于 AuNP 的 UV-vis 吸光度具有尺寸依赖性，因此每种校准尺寸标准品和未知 AuNP 样品均需建立独立的校准函数。该 UV-vis 检测器的局限性可通过使用质量敏感型检测器（如 ICP-MS）来克服。</li>
		<li>通过插入 定量结果 计算执行分析，结果将以浓度和进样量值的形式在右侧表格中显示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用场流分离（AF4）系统制造商提供的数据评估软件，或在按照制造商手册中的说明从相应的数据采集软件中导出所有必要的原始数据（即，AuNP 校准标准品在相应 UV-vis 峰最大值处的保留时间及相应空体积时间）后，通过电子表格分析计算保留时间的变化。
	<ol>
		<li>打开 概览 窗口以显示所有导入测量的相应 UV 信号轨迹。</li>
		<li>峰检测将自动进行；在信号处理工具箱中调整峰检测参数以优化性能。通过逐一检查所有测量文件提取相应的峰最大值。</li>
		<li>使用以下公式计算所有测量的相对标准偏差： 
		<img alt="相对标准偏差方程；统计分析；数据变异性公式；RSD 计算。" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> 
		也可使用相应的电子表格软件进行该计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用制造商提供的数据评估软件，或在按照制造商手册中的说明从相应的数据采集软件中导出所有必要的原始数据（分析物在 UV-vis 峰最大值处的保留时间及相应空体积时间）后，通过电子表格分析进行尺寸测定。可通过将 AuNP 尺寸标准品（20 nm、40 nm、80 nm、100 nm）的空体积时间校正后的保留时间（净保留时间，见 表 5）与其通过先前 DLS 测量获得的流体动力学尺寸作图，建立外部尺寸校准函数（见 表 4）。 
	注意：DLS 测量应尽可能在与相应分级测量同一天进行，以确保样品性质具有可比性。
	<ol>
		<li>导入 .dat 文件后，所有测量结果均显示在 概览 选项卡中。从检测器列表中选择 UV-vis 检测器信号，该列表显示在叠加窗口下方。在 信号与基线 视图中为每次测量定义感兴趣区域（ROI）和基线，可进行调整。使用右侧的 信号处理 工具箱对噪声信号进行平滑处理。使用 将处理参数分配给其他运行 功能，将参数分别分配给其他测量或信号。</li>
		<li>从 插入 选项卡中选择 粒径校准。</li>
		<li>通过点击 选择校准参考 表格右上方的相应测量，选择所有校准运行。所有选定的测量将在下方表格中列出。输入 表 4 中指定的所有校准测量的流体动力学半径。该函数将在“粒径校准-函数”窗口中显示，并同时显示其方程。 
		注意：所建立的尺寸校准函数的相关系数（R2）必须 ≥0.990。</li>
		<li>在 选择分配运行 列表中选择相应的分级测量，将该校准函数分配给未知 AuNP 样品的测量。</li>
		<li>在 插入 选项卡中打开 粒径分布 计算以显示结果。先前创建的粒径校准将在右侧窗口的 设置 中列为未知 AuNP 样品测量的 校准。计算出的尺寸将在标注为峰最大值的 尺寸分布窗口 中显示。选中 对样品信号取平均 复选框，以对同一样品的所有测量取平均，并将结果列于峰最大值标签中。</li>
		<li>此外，通过选中 显示校准曲线 复选框，将校准线叠加在 fractogram 上。通过选中 显示累积分布 复选框，可获得累积尺寸分布。 
		注意：当使用制造商软件进行数据分析时，建议通过点击 插入 选项卡内的 报告 按钮，将所有结果添加至报告中。该 报告 按钮会将所有结果、表格和图表添加至文档中。在 报告 选项卡下，可通过打开 文档 部分中的 报告设置 来更改报告设置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

本手稿的所有作者均为Postnova Analytics GmbH的员工，本方案中使用了该公司生产的产品。

通过场流分离技术（AF4）联用紫外-可见光检测器，并使用尺寸范围为20 nm至100 nm的明确定义的金纳米颗粒（AuNP）标准品，准确评估了未知AuNP的流体动力学尺寸。所建立的AF4方法采用恒定的横向流速模式进行优化，以在测得的保留时间与AuNP尺寸之间建立线性关系，从而可通过线性回归分析直接确定颗粒尺寸。研究还特别关注实现足够高的回收率，表明在分级过程中无明显样品损失；同时验证了所建立的AF4方法，包括所用洗脱液和膜材料，均与所有分级的AuNP样品具有良好匹配性。
方法开发可以说是场流分离（AF4）中最关键的步骤，为了在给定的洗脱时间窗口内改善分离效果，必须综合考虑多个参数，包括通道尺寸、流速参数以及洗脱液、膜材质、隔网高度，甚至样品本身的性质。本段旨在引导读者了解为成功测定本文讨论的未知金纳米颗粒（AuNP）样品尺寸而优化的关键步骤。有关AF4方法开发的一般性详细描述，可参考《ISO/TS21362:2018 - 纳米技术 - 使用非对称流场和离心场流分离分析纳米物体》标准文件中的AF4部分25。仔细查看表3中列出的分离条件，第一个关键步骤是将AuNP样品引入并使其在AF4通道中充分松弛。该过程由进样流、聚焦流和横向流共同调控，三者协同作用使样品聚集在膜表面附近，并在AF4通道进样口处形成一个狭窄的样品带，从而基本确定了分离的起始点。样品的充分松弛至关重要，因为在这一阶段，不同尺寸的样品组分将在AF4通道内垂直方向上分布于不同高度，这是实现成功尺寸分离的基础。若样品松弛不充分，通常会表现为空体积峰面积增大，这是由于部分样品组分未被保留（即未充分松弛）所致。这一问题可通过延长进样时间或提高施加的横向流速加以缓解。然而，这两个参数都需要仔细优化，特别是对于容易发生团聚或吸附在AF4膜上的样品，可通过不同参数设置下获得的相应回收率进行监测36,37。实验中采用5分钟的进样时间并结合1.0 mL∙min-1的横向流速，结果显示所有AuNP样品的回收率均&#62;80%，且空体积峰面积可忽略不计，表明已接近最优的松弛条件。在AuNP样品充分松弛后，停止聚焦流，启动样品沿AF4通道向紫外-可见检测器方向的迁移，这是第二个关键步骤。为在合理的分析时间内确保足够的分离能力，采用1.0 mL∙min-1的恒定横向流速持续30–50分钟（根据所用AuNP尺寸标准品而定），随后在0.5 mL·min-1的检测器流速下进行10分钟的线性横向流衰减。在整个AuNP尺寸标准品的分离过程中使用恒定横向流模式，结果显示保留时间与AuNP尺寸之间呈线性关系，符合场流分离理论22，从而可通过简单的线性回归分析实现对未知AuNP样品的尺寸测定。然而，也有研究采用非恒定横向流模式进行纳米颗粒尺寸测定，最终导致保留时间与颗粒尺寸之间呈现非线性关系38,39。此外，利用明确定义的尺寸标准品进行AF4尺寸测定不仅限于AuNP，还可应用于其他尺寸和元素组成的纳米颗粒（例如银纳米颗粒38,40或二氧化硅纳米颗粒41,42）。另外，在处理稀释样品时，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）作为一种高灵敏度的元素检测器，可与AF4联用，进一步增强了该分析方法在悬浮态多种纳米颗粒尺寸测定中的适用性和灵活性。
尽管使用明确定义的尺寸标准进行外部尺寸校准在场流分离（AF4）中应用广泛，但在用于未知样品的精确尺寸测定时，仍有一些特殊性需要考虑。首先，该方法在很大程度上依赖于尺寸标准品与实际样品在分离过程中采用可比的实验条件。因此，在本案例中，金纳米颗粒（AuNP）尺寸标准品和未知AuNP样品必须使用相同的AF4方法、相同的洗脱液以及相同的膜进行分离，这使得该方法的灵活性较差。此外，若缺乏尺寸敏感型检测器（例如光散射检测器，如MALS和DLS），则很难判断使用尺寸标准品的AF4方法是否足够有效。这一点对于尺寸分布非常宽的未知样品尤为关键，因为无法确定所有样品组分是否均遵循正常的洗脱规律——即从小颗粒到大颗粒依次洗脱，还是较大颗粒组分已进入空间排阻-超层模式洗脱，从而可能与较小颗粒组分共洗脱43,44。另外，尽管场流分离理论强调AF4仅基于流体动力学尺寸的差异进行分离，并将颗粒视为无环境相互作用的点质量22，实际情况却有所不同，颗粒间以及颗粒与膜之间的相互作用（如静电吸引/排斥或范德华吸引力）可能发挥重要作用，并可能通过外部尺寸校准引入可测量的偏差45,46。因此，建议尽可能选用在组成和表面特性（Zeta电位）上与目标颗粒相匹配的尺寸标准品40,42；若无法获得此类标准品，则至少应使用经过充分表征的粒径标准物质（例如聚苯乙烯乳胶颗粒），并仔细评估其与目标颗粒在分析所处环境中表面Zeta电位方面的可比性41,47。
场流分离技术（AF4）的多功能性通常被认为是其最大的优势，因为它的应用范围超出了该领域中大多数其他常见的粒径分析技术22,48,49。然而，由于其被认为操作较为复杂，AF4也可能被视为最显著的缺点，尤其是与动态光散射（DLS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）或单颗粒ICP-MS等快速且看似易于使用的粒径分析技术相比时。尽管如此，将AF4与这些流行的粒径分析技术进行对比可以看出，每种技术都有其优缺点，但它们均有助于更全面地理解纳米颗粒的理化性质，因此应被视为互补而非竞争关系。
本文所述的标准操作程序（SOP）突出了场流分离-紫外-可见光谱法（AF4-UV-vis）结合外部尺寸校准在悬浮液中未知金纳米颗粒（AuNP）样品尺寸测定方面的优异适用性，并最终被采纳为国际实验室间比对（ILC）中分析未知AuNP样品的推荐指南。该比对研究是在“地平线2020”计划ACEnano项目框架内开展的（本次ILC的结果将另文发表）。因此，本方案进一步推动了当前国际上验证和标准化AF4方法的积极努力25,50,51,52，凸显了AF4在纳米颗粒表征领域的广阔应用前景。

金纳米颗粒（AuNP）以胶体金的形式，在人类尚未理解纳米颗粒本质、也未出现“纳米颗粒”这一现代科学术语之前，便早已成为人类文化的一部分。早在公元前5至6世纪，古代中国、阿拉伯和印度在缺乏对其纳米尺度特性明确认识的情况下，就已经将悬浮的AuNP用于医学及其他用途1；古罗马人也利用其特有的宝石红色，将其应用于著名的英国博物馆藏品——莱克格斯杯（Lycurgus Cup）的陶瓷着色2。在西方世界，从中世纪到近代，悬浮的AuNP主要被用作玻璃和珐琅的着色剂（即“卡西乌斯紫”）3，同时也用于治疗多种疾病（即“可饮用金”），尤其是梅毒4。
然而，所有这些研究主要集中在悬浮态金纳米颗粒（AuNP）的应用上，直到1857年，迈克尔·法拉第（Michael Faraday）才首次提出系统性的方法来研究其形成过程、本质及其性质5。尽管法拉第当时已意识到这些AuNP的尺寸极其微小，但直到电子显微镜技术发展之后，人们才获得了关于其尺寸分布的明确信息6,7，从而最终实现了AuNP尺寸与其他性质之间的关联分析。
如今，由于金纳米颗粒（AuNP）具有相对简单直接的合成方法、显著的光学特性（表面等离子体共振）、良好的化学稳定性因而毒性较低，以及在可获得的尺寸和表面修饰方面的高度多样性，其已在纳米电子学8、诊断学9、癌症治疗10和药物递送11等领域得到广泛应用。显然，在这些应用中，精确掌握所用AuNP的尺寸及其尺寸分布是确保其最佳效能的基本前提12，因此迫切需要可靠且稳健的工具来测定这一关键的理化参数。目前，已有多种分析技术可用于测定悬浮液中AuNP的尺寸，例如紫外-可见光谱法（UV-vis）13、动态光散射法（DLS）14和单颗粒电感耦合等离子体质谱法（spICP-MS）15，其中场流分离技术（FFF）在该领域发挥着关键作用16,17,18,19,20。
场流分级（FFF）最早由 J. Calvin Giddings 于1966年提出21，是一类基于洗脱的分离技术，其分离过程发生在一个无固定相的薄带状通道内22,23。在FFF中，样品在层流通道流中向下游输运的同时，受到一个垂直于流动方向的外加力场作用，从而实现分离，通常样品最终流向串联的检测器。在众多相关的FFF技术中，非对称流场流分级（AF4）应用最为广泛，其以第二股流动（即横向流）作为外加力场24。在AF4中，通道底部（即富集壁）装有一张半透性的超滤膜，该膜可截留样品，同时允许横向流透过膜并通过额外出口流出通道。由此，横向流可将样品推向富集壁，从而抵消由扩散引起的通量（布朗运动）。在力场与扩散共同作用所形成的平衡状态下，扩散系数较高的小尺寸组分更靠近通道中心分布，而扩散系数较低的大尺寸组分则更靠近富集壁分布。由于通道内具有抛物线流速分布，因此小尺寸组分在流速较快的流层中被更快地输运，先于大尺寸组分洗脱出来。结合FFF保留参数和斯托克斯-爱因斯坦扩散系数方程，AF4中样品的洗脱时间或洗脱体积可直接转换为其流体力学尺寸22。上述洗脱行为称为正常洗脱模式，通常适用于粒径范围约为1–500 nm的颗粒（根据颗粒性质和分离参数的不同，有时可扩展至2000 nm）；而当颗粒尺寸超过此阈值时，通常会出现排阻-超层洗脱行为25。
在场流分离（FFF）后，获取尺寸信息有三种常用方法。由于FFF是一种模块化仪器，因此可在其下游联用多种检测器，例如基于多角度光散射（Multi-Angle Light Scattering, MALS）原理的尺寸敏感型光散射检测器26,27、动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）检测器28,29，甚至可同时联用两种检测器以获得额外的颗粒形状信息30,31。然而，由于样品在FFF通道中的保留行为通常由明确的物理作用力所支配，因此也可通过数学方法（即FFF理论）计算其尺寸，此时仅需一个简单的浓度检测器（例如紫外-可见光检测器）即可指示洗脱样品的存在32,33。
作为第三种选择，本文报道了一种外部尺寸校准方法34,35，该方法使用尺寸范围为20–100 nm的明确定义的AuNP标准品，结合场流分离（AF4）与紫外-可见光检测，对悬浮液中未知尺寸的金纳米颗粒样品进行尺寸测定。该实验装置设计简单，旨在使尽可能多的实验室能够参与国际实验室间比对（ILC）。后续基于本文所述方案，在欧盟“地平线2020”计划ACEnano项目框架下开展了该项比对研究。

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m 膜滤器（亲水性 PVDF）</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>用于水溶液的过滤</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PVDF 注射器滤器（d = 33 mm）</td><td>默克密理博</td><td>Durapore Millex</td><td>用于 NovaChem100 的过滤</td></tr><tr><td>可调体积移液器（1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>研究增强</td><td>用于制备稀释的 AuNP 悬液</td></tr><tr><td>AF4 柱</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 分析通道</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>AF4膜 - 再生纤维素（10 kDa截留分子量）</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 装置的组成部分，该装置在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>分析天平（0.1 mg 精度）</td><td>赛多利斯</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>用于称量SDS和NaOH颗粒以配制清洗液</td></tr><tr><td>自动进样器</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>通道式烘箱</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 装置的组成部分，该装置在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>错流模块</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF 控制模块</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>一次性移液器吸头（1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>用于制备稀释的 AuNP 悬液</td></tr><tr><td>烧瓶（例如 2 升体积）</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>用于洗脱液储存</td></tr><tr><td>聚焦泵</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>玻璃小瓶（例如 1.5 mL 容量）</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>用于样品储存</td></tr><tr><td>金纳米颗粒尺寸标准品（20 nm、40 nm、80 nm、100 nm）</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>每50 mg L-1，用于建立尺寸校准函数</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>用于加速SDS和NaOH颗粒在超纯水中的溶解</td></tr><tr><td>个人计算机（PC）</td><td>戴尔科技</td><td>/</td><td>用于控制 AF4 运行、记录和评估采集数据的单元，有关必要的硬件和软件要求，请参阅 Postnova AF2000 手册</td></tr><tr><td>个人防护装备（手套、实验服、护目镜等）</td><td>/</td><td>/</td><td>根据各自实验室的规定&amp;rsquo;化学品（包括工程纳米材料）操作的安全规则</td></tr><tr><td>玻璃瓶螺旋盖（例如 1.5 mL 容量）</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>用于样品储存</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS） &amp;ge;99%，印迹级</td><td>卡尔·罗斯特有限责任公司 &amp;amp; Co KG</td><td>2326.1</td><td>用于清洗液的配制</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）颗粒， &amp;ge;98 %，p.a</td><td>卡尔·罗斯有限公司 &amp;amp; Co KG</td><td>6771.1</td><td>用于清洗液的配制</td></tr><tr><td>用于控制与数据采集的软件包</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaFFF AF2000 软件</td><td>用于执行 Af4 运行和数据采集的软件，有关必要的硬件和软件要求，请参阅 Postnova AF2000 手册</td></tr><tr><td>用于数据分析的软件包</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaAnalysis 软件</td><td>用于AF4数据评估的软件，有关必要的硬件和软件要求，请参阅Postnova NovaAnalysis手册</td></tr><tr><td>用于最终数据处理的软件包</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>用于最终数据处理</td></tr><tr><td>溶剂脱气装置</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 装置的组成部分，该装置在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>溶剂选择器</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>溶剂整理架</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 系统的组成部分，该系统在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>表面活性剂混合物</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>用于洗脱液制备的不同表面活性剂和盐的混合物</td></tr><tr><td>移液泵</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>AF2000 MF - MultiFlow FFF 装置的组成部分，该装置在文稿中被描述为 AF4 系统</td></tr><tr><td>未知金纳米颗粒样品</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC60</td><td>用于通过尺寸校准功能测定尺寸的60 nm AuNP样品</td></tr><tr><td>紫外-可见光检测器</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>用于与 AF4 系统下游连接的紫外-可见光检测器</td></tr><tr><td>真空过滤装置</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>洗脱液过滤系统</td><td>用于确保降低颗粒背景并去除所用洗脱液中的溶解空气，以保证最优的场流分离（AF4）分级条件</td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>用于稀释的金纳米颗粒悬浮液的均质化</td></tr><tr><td>水纯化系统</td><td>默克密理博</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>用于制备超纯水（UPW，18.2 MΩ·cm）&amp;Omega;cm 电阻率）用于制备清洗液、洗脱液及 AuNP 悬液的稀释</td></tr></tbody></table>

用于悬浮液中金纳米颗粒粒径分析的非对称流场-流场分离技术

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

粒径可以说是与纳米颗粒概念相关的最重要的物理化学参数。精确了解纳米颗粒的尺寸及其尺寸分布对于各种应用至关重要。尺寸范围同样重要，因为它定义了纳米颗粒剂量中最具“活性”的组分。
非对称流场-流场分离（AF4）是一种强大的技术，可用于测定悬浮液中粒径范围约为1–1000 nm的颗粒尺寸。从AF4实验中获取尺寸信息有多种方法。除了将AF4与基于多角度光散射或多分散光散射原理的尺寸敏感检测器在线联用外，还可以通过成熟的理论方法（FFF理论）将样品尺寸与其保留时间相关联，或通过与已知粒径标准颗粒的保留时间进行比较（外标尺寸校准）来实现尺寸测定。
本文描述了一种标准操作程序（SOP）的开发及其内部验证过程，该程序用于通过场流分离（AF4）结合紫外-可见光检测，并利用20–100 nm粒径范围的金纳米颗粒标准品进行外部尺寸校准，对未知金纳米颗粒样品进行粒径测定。本程序详细阐述了所建立的工作流程，包括样品制备、AF4仪器的设置与确认、AF4方法开发及未知金纳米颗粒样品的分离，以及将所得结果与已建立的外部尺寸校准曲线进行关联分析。该SOP最终在一项实验室间比对研究中成功通过验证，凸显了AF4技术在悬浮态纳米颗粒样品粒径测定中的卓越稳健性和可靠性。

首先，采用 AF4 对 AuNP 尺寸标准品进行分离，并通过紫外-可见光谱法检测，测量 AuNP 在 532 nm 波长处的吸光度（AuNP 的表面等离子体共振）。所获得的分离谱图叠加结果如图 1所示。三次重复测量所得各 AuNP 在其相应紫外-可见吸收峰最大值处的保留时间列于表 5中。所有保留时间的相对标准偏差均低于 1.1%，且随着粒径增大，测量方差减小。总体而言，重复性极佳。实验中施加了恒定的分离力，从而实现了洗脱时间与流体动力学尺寸之间的线性关系。通过将标称的流体动力学半径对经空体积时间校正后的洗脱时间（净保留时间）作图，建立了外部尺寸校准曲线。线性回归分析得到线性校准函数，其截距 a = -3.373 nm ± 1.716 nm，斜率 b = 1.209 nm∙min-1 ± 0.055 nm∙min-1。洗脱行为的线性关系由决定系数 R2 = 0.9958 得到验证。相应的校准函数在图 2中直观展示。
第二部分涉及对未知金纳米颗粒（AuNP）样品的分析。根据方案部分（第4.2节）所述方法，制备了该样品的三个等分试样。对每个等分试样均采用相同的AF4分离方法进行三次重复测定，该方法此前也用于AuNP粒径标准品的分离。所获得的该未知AuNP样品全部九张AF4-UV-vis洗脱图谱如图3所示，其相应的评估结果汇总于表6中。各次测定保留时间的相对标准偏差显著偏低，介于0.1%至0.5%之间。利用AuNP粒径标准品分离所得的粒径校准函数，并结合未知AuNP样品在UV-vis峰最大值处的保留时间，计算得出其平均流体动力学半径为29.4 nm ± 0.2 nm。此外，获得的质量回收率为83.1% ± 1.2%，表明该AuNP样品未发生明显的团聚或溶解，也未在膜表面产生显著的颗粒吸附。图4展示了通过平均全部九条UV-vis信号曲线所得的粒径分布，突显了所采用AF4方法优异的稳健性。
<img alt="尺寸排阻色谱图；归一化的紫外-可见光信号百分比随时间变化，显示蛋白质分离情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1： 对四种单独的金纳米颗粒（AuNP）尺寸校准标准品进行三重分析所获得的场流分离-紫外可见光（AF4-UV-vis）洗脱图，信号强度已归一化，并采用恒定的交叉流速（黑线）。约在 5.9 分钟处的空隙峰以灰色突出显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="水力学半径随时间变化图；扩散数据分析；线性拟合；颗粒尺寸测定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2： 通过将各 AuNP 尺寸校准标准品在其相应峰最大值处的保留时间与指定的水力学半径作图，获得外部尺寸校准函数，误差棒来源于 DLS 测量的相应标准偏差（表 4）以及 AF4 保留时间的方差（表 5）。通过线性回归分析计算得到形式为 y = a + bx 的线性校准函数，其中 a = -3.373 nm ± 1.716 nm，b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1。确定的平方相关系数为 R2 = 0.9958，表明存在线性关系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="色谱紫外-可见光谱图、空隙峰、方法评估、化合物分离的光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： 三个等分试样三重测量的AF4-UV-vis fractogram，显示未知的AuNP。测量期间施加的恒定交叉流速以黑线表示。约5.9分钟处的空隙峰以灰色突出显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="水动力学半径分布图；微分分布曲线与时间数据，单位：nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：未知金纳米颗粒（AuNP）样品的平均粒径分布（红色）与所用线性校准函数（虚线）的叠加图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">组分</td>
			<td>CAS编号</td>
			<td>质量百分比 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">水</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">9-十八碳烯酸 (Z)-, 与 2,2',2''-氮川三乙醇的化合物 (1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">碳酸钠</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">醇类，C12-14仲醇，乙氧基化</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">乙二胺四乙酸四钠</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">聚乙二醇</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">油酸钠</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">碳酸氢钠</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 用于配制洗脱液的表面活性剂混合物各组分列表（另见材料表）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AF4-紫外-可见光参数</td>
			<td>单位</td>
			<td>数值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>间隔层厚度</td>
			<td>µm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检测器流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>横向流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0（持续8分钟）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚焦流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延迟时间 / 稳定时间</td>
			<td>min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过渡时间</td>
			<td>min</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样时间</td>
			<td>min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱步骤</td>
			<td>min</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清洗步骤时间</td>
			<td>min</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清洗步骤流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样体积</td>
			<td>µL</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样品浓度</td>
			<td>mg L-1</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜类型</td>
			<td></td>
			<td>再生纤维素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜分子量截留值</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱液</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 表面活性剂混合物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>紫外-可见光波长</td>
			<td>nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>紫外-可见光灵敏度</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 采用直接进样运行（不施加分离力）的场流分离-紫外-可见光检测（AF4-UV-vis）分级方法参数汇总。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AF4-UV-vis 参数</td>
			<td>单位</td>
			<td>数值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>间隔层厚度</td>
			<td>µm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>检测器流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>横向流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>1（60 分钟恒定，10 分钟线性）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>聚焦流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>延迟时间 / 稳定时间</td>
			<td>min</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>过渡时间</td>
			<td>min</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样时间</td>
			<td>min</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱步骤</td>
			<td>min</td>
			<td>70（60 分钟恒定，10 分钟线性）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清洗步骤</td>
			<td>min</td>
			<td>9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>清洗步骤流速</td>
			<td>mL min-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进样体积</td>
			<td>µL</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>样品浓度</td>
			<td>mg L-1</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜类型</td>
			<td></td>
			<td>再生纤维素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>膜分子量截断值</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗脱液</td>
			<td></td>
			<td>0.025% (v/v) 表面活性剂混合物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis 波长</td>
			<td>nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis 灵敏度</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3： 采用交叉流作为分离力进行分离运行的AF4-UV-vis分离方法参数汇总。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>校准标准</td>
			<td>封端剂</td>
			<td>平均尺寸（TEM）（nm）</td>
			<td>CV（TEM平均尺寸）（%）</td>
			<td>Zeta电位（mV）</td>
			<td>SD（Zeta电位）（mV）</td>
			<td>流体动力学半径（DLS）（nm）</td>
			<td>SD（流体动力学半径）（nm）</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SD（PDI）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>柠檬酸盐</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>柠檬酸盐</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>柠檬酸盐</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>柠檬酸盐</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：所用金纳米颗粒（AuNP）校准标准品的理化参数汇总，包括表面包覆剂、透射电镜（TEM）平均粒径、原液中的Zeta电位，以及在洗脱液中测得的动态光散射（DLS）流体动力学半径和多分散性指数（PDI）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>校准标准</td>
			<td>运行次数</td>
			<td>峰最大值处的保留时间（min）</td>
			<td>峰最大值处的净保留时间（min）</td>
			<td>平均净保留时间（min）</td>
			<td>净保留时间的标准偏差（%）</td>
			<td>净保留时间的标准偏差（min）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5： 使用表3中所述方法，通过相应的AF4-UV-vis fractogram在各自UV-Vis峰最大值处测得的AuNP校准标准品的保留时间。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品编号</td>
			<td>运行次数</td>
			<td>峰最大值保留时间（min）</td>
			<td>峰最大值平均保留时间（min）</td>
			<td>峰最大值净保留时间（min）</td>
			<td>保留时间标准偏差（%）</td>
			<td>流体动力学半径（nm）</td>
			<td>回收率（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6： 未知金纳米颗粒样品经场流分离-紫外-可见光谱分析得到的各紫外-可见光吸收峰最大值处的保留时间、由外部尺寸校准（图2）计算出的流体动力学半径以及回收率的汇总结果。

本方案描述了采用不对称流场-流场分离技术结合紫外-可见光检测法测定未知金纳米颗粒样品尺寸的方法。

粒径可以说是与纳米颗粒概念相关的最重要的理化参数。对粒径及……的精确了解

采用不对称流场-流场分离技术结合外部尺寸校准，是准确测定悬浮液中金纳米颗粒尺寸分布的有力工具。AF4 覆盖了从 1 到 1000 纳米的完整尺寸范围。该方法不受样品组分组成的限制，即使对于分散性较差或复杂的样品也可适用。AF4 的优势在于其极为广泛的应用范围，不仅涵盖不同性质和尺寸的纳米颗粒，还包括蛋白质、病毒以及合成或天然的大分子。首先，将任意尺寸的金纳米颗粒标准品以 50 毫克每升的浓度涡旋振荡两分钟，然后用超纯水按 1 比 4 的比例稀释该标准品。随后，将稀释后的溶液再涡旋振荡两分钟，以获得均一的悬浮液。清洗系统后，打开 AF4 装置以更换 AF4 膜。用超纯水冲洗新膜，重新组装装置，然后将装置重新连接至 AF4-UV-vis 系统。使用经过滤并脱气的洗脱液冲洗清洁后的 AF4-UV-vis 系统至少 30 分钟，设置进样尖端流速为 1 毫升/分钟，聚焦流速为 1 毫升/分钟，横向流速为 1.5 毫升/分钟，以平衡膜、稳定系统并检查是否存在潜在泄漏。系统压力应稳定在 4 至 12 bar 之间。为验证 AF4-UV-vis 系统性能，采用任意一种金纳米颗粒尺寸标准品，在不施加分离力的条件下进行直接进样运行，以测定质量回收率和保留时间的变异情况。然后施加分离力进行一次分级运行。为制备用于外部分子量校准的金纳米颗粒尺寸标准品，将所有50毫克/升的金纳米颗粒尺寸标准品涡旋混匀2分钟，并用超纯水以1:4的比例稀释各相应样品用于分析。尺寸标准品制备完成后，在FFF方法选项卡中，将检测器流速设为500微升/分钟，进样流速设为500微升/分钟，进样时间设为0.1分钟。设定洗脱时间为八分钟，不设定分离力，向系统中注入10微升第一种标准品。当所有尺寸标准品测定完成后，向系统中注入50微升第一种标准品。将检测器流速设定为500微升每分钟。将延迟时间设为两分钟，进样流速设为每分钟200微升，持续五分钟，过渡时间为0.2分钟。聚焦流速将自动计算。设洗脱时间为60分钟，横向流速为每分钟一毫升。该AF4方法采用恒定的横向流速，随后在10分钟内线性衰减至每分钟零微升。设置清洗步骤为9分钟，针尖流速为每分钟500微升。当所有金纳米颗粒尺寸标准品完成分离后，制备待测金纳米颗粒样品，并按照前述方法对未知金纳米颗粒样品进行直接进样测定及分离。为分析数据，需将数据文件导入系统软件。在概览选项卡中显示测量结果，并从检测器列表中选择紫外-可见光检测器信号。为每次测量定义感兴趣的区域和基线，并根据需要调整信号和基线显示。使用信号处理工具箱对任何含噪声的信号进行平滑处理，并使用“将处理参数分配给其他运行”功能，以便将参数应用于其他测量数据。要执行质量回收计算，请打开直接进样测量数据和分级分离数据。插入一次直接进样校准，并在直接进样校准设置视图中选择相应的直接进样测量数据。将使用样品的进样体积和浓度来关联峰面积与进样量。接下来，使用“分配至选定粒子预设”功能，将获得的校准函数分配给相应的分级测量。然后，利用该方程通过比较分级测量与直接进样测量中相应紫外-可见光谱峰的峰面积，计算金纳米颗粒的质量回收率。要显示结果，请打开定量结果计算。将根据峰面积显示质量浓度。通过将该值与注入浓度进行比较，可获得质量回收率。在粒径校准窗口的“粒径”选项卡下，单击“选择用于校准的参考”表格中每个相应的测量项，以选择所有校准运行。所选的测量结果将显示在表格中。输入所有校准测量的水动力学半径。函数和方程将显示在粒径校准函数窗口中。要将校准函数应用于未知金纳米颗粒样品的测量，请在“选择运行以分配”列表中选择相应的分级部分，并打开粒径分布计算以显示结果。计算得到的粒径将在尺寸分布窗口中显示，并标注在峰的最大值处。先前创建的粒径校准将被列为未知金纳米颗粒样品测量的校准标准。要对一个样品的所有测量结果进行平均，请选中“对样品信号取平均”复选框。结果将显示在“峰最大值”标签中。此处展示了一个典型的金纳米颗粒尺寸标准品通过场流分离（AF4）分离，并利用紫外-可见光谱在532纳米波长处检测其吸光度所得的叠加图谱。通过三次重复测量获得的每种纳米颗粒在其相应紫外-可见光谱峰最大值处的保留时间，其相对标准偏差均低于1.1%。对这些数据进行线性回归分析，得到线性校准函数，其平方相关系数（R²）为0.9958。随后对九个未知金纳米颗粒样品进行AF4-紫外-可见光谱分析，获得的相应保留时间的相对标准偏差显著较低，介于0.1%至0.5%之间。利用金纳米颗粒尺寸标准品分离所得的粒径校准函数，并将该函数与未知金纳米颗粒样品在紫外-可见光谱峰最大值处测得的保留时间相关联，可计算出其总体平均水力学半径。此外，可获得合理的质量回收率，表明金纳米颗粒样品未发生显著的团聚或溶解，也未在膜表面发生明显的颗粒吸附。当使用外部尺寸校准和场流分离（AF4）分析时，至关重要的是将相同的AF4方法一致地应用于所有尺寸标准品和样品本身。AF4技术可帮助研究人员更深入地理解其纳米颗粒样品的特性。因此，它是一种重要的质量控制工具，最终有助于提高纳米技术产品的功效。

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