Name: 使用 COMSTAT 软件量化抗菌剂对 体外 生物膜结构的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学习使用COMSTAT软件量化抗菌剂对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响。该方法结合共聚焦显微镜成像技术，为评估抗感染药物疗效提供标准化分析框架。

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作者谨感谢囊性纤维化基金会为本研究提供的资助。

1. 细菌分离株收集
<ol>
	<li>从多伦多病童医院（SickKids）接受吸入性妥布霉素根除治疗的一组囊性纤维化（CF）儿科患者中获取P. aeruginosa分离株。将分离株在甘油柠檬酸盐中于 -80 °C 冻存，并在使用前至少传代三次。</li>
</ol>
2. 体外 生物膜形成
注意：采用腔室载玻片法1 用于 体外 生物膜形成的改良方法。该模型的整体工作流程如图所示。 图1.
<ol>
	<li>培养 P. aeruginosa 过夜分离于 37 &#176;C 在由胰蛋白酶大豆琼脂和5%绵羊血制备的血琼脂上（参见 材料清单).</li>
	<li>接种1–2个血琼脂上的细菌菌落至4 mL溶菌肉汤（LB）中，37°C过夜培养 37 &#176;C 在设定为 225 rpm 的摇床上。</li>
	<li>通过添加制备过夜接种物的1:100稀释液 40 &#956;L 4 mL新鲜LB培养基中培养，于3–4小时内生长 37 &#176;C 在设定为225 rpm的摇床上振荡，使600 nm处的光密度达到约0.1（OD600（对数生长期早期）</li>
	<li>转移 220 &#956;L 将接种物加入到8孔盖玻片培养板的每孔中。静置孵育于 37 &#176;C 24 小时。</li>
	<li>缓慢从每个孔中移除培养基，以防止生物膜在底部脱落。 
	注意：将载玻片向前倾斜 45&#176; 倾斜并从每个分隔孔的底部角落吸出培养基，注意移液枪头不要接触孔底。</li>
	<li>制备并缓慢加入 100 &#956;L 的 56 &#956;g/mL 荧光的&#160;标记的单克隆抗体（mAb）（参见 材料清单) 加至指定的多孔板孔侧壁。室温（RT）孵育1 h，使抗体结合细菌抗原表位。 
	注意：使用前需将荧光染料稀释&#160;标记（红色）的单克隆抗体 Psl0096 加入 LB 中，以获得最终浓度 56 &#956;g/mLPsl0096 是一种抗 Psl 单克隆抗体（Cam003 的亲和力优化衍生物），可结合 I 类 Psl 表位——这是胞外多糖基质的关键组分 P. aeruginosa 参与初始细胞附着和维持结构完整性的生物膜15.</li>
	<li>制备并缓慢加入 100 &#956;L 的 1000 &#956;g/mL 抗生素溶液（参见 材料清单) 置于指定的带孔板孔侧壁。静置孵育于 37 &#176;C 24小时。 
	注意：使用前，将50 mg/mL的妥布霉素抗生素储备液用LB培养基稀释，以获得最终浓度 1000 &#956;g/mL.</li>
</ol>
3. 生物膜荧光染色
<ol>
	<li>制备0.01 mM的活细胞染色荧光染料溶液。缓慢移除腔室孔板中的培养基，并向每孔加入200 μL染料混合液。在室温下避光孵育45分钟。 
	注意：使用前，通过将4 μL的5 mM母液加入2 mL LB培养基中，制备活细胞染色（绿色）荧光染料。</li>
	<li>缓慢移除每孔中的培养基，并用200 μL新鲜LB培养基洗涤2次。</li>
	<li>向每孔加入200 μL新鲜LB培养基，随后通过共聚焦显微镜进行观察。</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜图像采集
注意：图像处理与COMSTAT分析流程见于 图2获取&#160;图像&#160;同一天进行生物膜染色时使用各孔。若观察延迟超过1小时，应将带孔载玻片置于暗处冷藏，直至后续处理。
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜系统获取孔板图像（参见 材料表) 采用适当的激光激发波长和滤光片组进行采集。 
	注意：此处激发荧光&#160;使用561 nm和491 nm激发波长分别对标记（红色）的单克隆抗体和活细胞（绿色）染色。</li>
	<li>以基质为起点至每个生物膜段顶部，逐层采集z轴堆叠图像，步长为 0.3 &#956;m 使用20–25倍水浸物镜，每孔至少采集6个图像堆栈。 
	注意：此处使用25倍水浸物镜的高分辨率相机拍摄图像，并通过图像分析软件进行处理（参见 材料表）。保持软件设置和数字成像参数（即，亮度和灵敏度）在单次实验的所有采集过程中保持恒定。</li>
	<li>将图像保存为用于 COMSTAT 分析的 OME-TIFF 格式。 
	注意：确保将每个通道的 OME-TIFF 文件分别保存即，红色和绿色）。此步骤根据所使用的图像分析软件而有所不同。</li>
	<li>重复步骤 2.1–4.3&#160;从总共3个生物学重复中采集图像（即每株细菌分离物进行3次独立实验。</li>
</ol>
5. COMSTAT 分析
注意：使用免费的计算机程序 COMSTAT16,17 对图像进行定量分析，该程序已被重写为 ImageJ 的插件（Comstat2）。请阅读所下载软件包中关于分析生物膜图像堆栈的一般说明。本文提供了一个简要的实验方案，并推荐了部分 ImageJ 图像处理步骤和 COMSTAT 功能，用于定量评估抗菌剂对生物膜形成的影响。
<ol>
	<li>从 http://www.comstat.dk/ 下载 Comstat2 软件包。在已安装的文件夹中找到 ImageJ 并运行。</li>
	<li>在桌面创建源文件夹，并将单个 OME-TIFF 文件添加至该文件夹。</li>
	<li>打开源文件夹中的 OME-TIFF 文件，并删除所有不含生物质的空白层。这些层通常位于 z 堆栈的首层或末层。 
	注意：用户有时会高估显微镜定义的 z 轴堆叠边界。删除这些空层可为 COMSTAT 分析建立更精确的 z 轴堆叠边界。</li>
	<li>通过选择菜单导入 OME-TIFF 文件至 ImageJ 文件 | 导入 | 图像序列定位源文件夹，高亮选中但不打开，然后点击 选择“序列选项”窗口将出现。选择 好的。. 
	注意：若需在ImageJ中导入其他图像，请先将源文件夹中的旧版OME-TIFF文件移除，随后将新版OME-TIFF文件添加至该文件夹，并重复步骤5.3与5.4。</li>
	<li>通过选择翻转生物膜的方向 图像 | 变换 | 沿 Z 轴翻转&#160;将基底定位为第一个（最顶层）堆栈。 
	注意：COMSTAT 算法沿 z 轴方向从上（堆栈 1）到下读取生物膜。根据所使用的共聚焦显微镜系统，OME-TIFF 输出可能发生反转。因此，&#160;必须反转切片顺序，将基底层设置为图像堆栈1，以防止输出数据出现错误。</li>
	<li>通过选择定义图像属性 图像 | 属性将出现一个“源”窗口。
	<ol>
		<li>将“长度单位”指定为“micron”。</li>
		<li>通过以下公式计算"像素宽度"与"像素高度"： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/61759/61759equ01.jpg" /> (1) 
		此处，“像素宽度”与“像素高度”定义为 0.427，即电荷耦合器件（CCD）上一个像素的物理长度。 16 &#956;m总放大倍率为25倍；放大镜位置为1.5倍。 
		注：用于计算每个像素对应细胞尺寸的公式可能因显微镜相机制造商而异。或者，“像素宽度”和“像素高度”可通过空间校准进行定义（参见 https://imagej.net/Spatial_Calibration）。</li>
		<li>将“体素深度”定义为 0.3（即每个 z 轴堆叠层之间的增量间距）。选择 好的 在“源”窗口中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过选择调整图像阈值 图像 | 调整 | 阈值将出现一个“阈值”窗口。 
	注意：图像中的对象将呈现红色，背景为灰度。或者，&#160;阈值可在黑白模式下通过调整&#160;在“阈值”窗口的下拉菜单中，将“红色”更改为“B&amp;#38;W’。
	<ol>
		<li>在图像窗口中，将滑块调整至最右侧即（生物膜最上层）。为消除背景噪声，请使用“阈值”窗口（该窗口显示图像的直方图）手动设置最大和最小阈值。首先，将下方滑块尽可能向右调整以设置最大阈值。其次，使用上方滑块调整最小阈值，该操作将图像分割为两个独立的相：红色生物质和灰度区域。&#160;背景图 3). 
		注意： 体外 本文所述的生物膜形成与荧光显微镜操作流程，在理想情况下可生成 OME-TIFF 格式图像，使得通过简单的直方图阈值法即可将图像分割为两个不同相。然而在某些情况下，不同相之间的直方图区分并不清晰。这可能是由于存在大量背景噪声、背景强度不均一，或生物质与背景之间的强度对比度较低所致。在此类情况下，用户应采用增强型分割流程。18,19.
		<ol>
			<li>或者，也可通过“阈值”窗口中左侧设为“默认”的下拉菜单，对单张图像进行算法阈值调整。此功能提供17种不同的算法阈值选项以供选择（参见 https://imagej.net/Auto_Threshold）。选择最适用的选项，然后点击“自动”以设置阈值。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>调整阈值后，请使用图像窗口中的滑块逐层滚动浏览，以确保背景噪声在各层中均被充分去除。</li>
		<li>选择 设置 在“阈值”窗口中，首先固定下限阈值。随后将出现“设置阈值水平”窗口。选择 好的。选择 设置 再次重复此步骤以确定最大阈值。 
		注意：每次选择“设定”时，下方滑块可能会自动调整。此时，需手动重新调整滑块（若使用算法阈值之一，可选择“自动”），并重复步骤5.6.2–5.6.3。核心原则是，每当滑块被自动重新调整后，应额外再选择两次“设定”，以确保上下两个阈值均被固定。</li>
		<li>选择 施加 随后将出现“将堆栈转换为二值图像”窗口。请选择 好的。然后退出“阈值”窗口。</li>
		<li>保存新调整的OME-TIFF文件，请选择 插件 | Bio-Formats | Bio-Formats 导出器输入新文件名，并在源文件夹中保存为 OME-TIFF 格式。随后将出现“Bio-Formats 导出器 – 多文件”窗口。选择 好的。随后将出现“Bio-Formats 导出器选项”窗口。请选择 好的。. 
		注意：在开始 COMSTAT 分析前，请确保源文件夹中仅保存新调整后的黑白 OME-TIFF 文件。请将所有原始 OME-TIFF 文件移出该文件夹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 COMSTAT 软件，请选择 插件 | Comstat2 |将显示“关于”窗口。选择 好的将出现三个窗口。
	<ol>
		<li>在“已观察目录”窗口（右上角）中，选择 添加定位源文件夹，高亮选中但不打开，然后选择&#160;选择随后将出现“目录中的图像”窗口（左上角），其中列出了待通过 COMSTAT 分析的 OME-TIFF 文件。</li>
		<li>在“Comstat 2.1”窗口（右下角），取消选择“自动阈值（大津法）”，以确保软件使用先前为各个OME-TIFF文件设置的阈值。同时，取消选择 连接体积过滤g（CVF）以确保分析中涵盖生物膜极薄部分以及生物膜结构空隙内发现的游离漂浮细胞或生物质。 
		注意：此处取消选择 CVF，因为 COMSTAT 分析针对的是极早期生物膜（初始生长 24 小时）以及抗菌处理后残留的浮游细胞/菌落。对于成熟生物膜，请选择 CVF 以确保仅对与生物膜结构相连的生物量进行定量分析。</li>
		<li>在“Comstat 2.1”窗口（右下角），选择用于定量分析的所需特征。此处，选择 生物量，厚度分布 与 表面积。选择 前往 运行程序。在“日志”窗口（左下角）中，输出数据显示处理过程，直至出现“所选功能/图像处理完成！”。记录 COMSTAT 测量结果。这些测量结果也会自动以 TXT 文件形式保存在源文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Mah, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426, 306-310 (2003).</li>
<li>Srinandan, C. S., Jadav, V., Cecilia, D., Nerurkar, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrients+determine+the+spatial+architecture+of+Paracoccus+sp.+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp. biofilm.</a> Biofouling. 26, 449-459 (2010).</li>
<li>Ramos, I., Dietrich, L. E., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenazines+affect+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+similar+ways+at+various+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phenazines affect biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa in similar ways at various scales.</a> Research in Microbiology. 161, 187-191 (2010).</li>
<li>Ma, L., Jackson, K. D., Landry, R. M., Parsek, M. R., Wozniak, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+aeruginosa+conditional+psl+variants+reveals+roles+for+the+psl+polysaccharide+in+adhesion+and+maintaining+biofilm+structure+postattachment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure postattachment.</a> Journal of Bacteriology. 188, 8213-8221 (2006).</li>
</ol>

目前尚无定量比较三维图像的既定方法 体外 生物膜结构以及本文所述的操作步骤常因操作者间的差异而难以实现标准化20因此，本方案为旨在量化变化的 COMSTAT 应用提供了一个简单且可重复的框架 体外 不同抗菌条件下生物膜结构的构建。该技术的优势通过使用CF进行建模 P. aeruginosa 分离后以生物膜形式培养的复孔，暴露于妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096。
在本方案以及相关研究中，最关键的步骤之一是图像阈值化13,21。图像阈值化是一种分割技术，可将灰度图像转换为COMSTAT算法可读的黑白格式。在此过程中，必须有效区分哪些灰度像素应被视为生物膜（黑色）而哪些属于背景噪声（白色），否则阈值的选择将改变单个生物膜图像所对应的体积和形态22。在ImageJ中，阈值化可通过多种方式实现：手动设置，或从17种算法...

生物膜是由微生物在自身产生的胞外聚合物基质（EPS）中定向聚集而成的结构。EPS基质极为复杂，主要由细菌细胞、水、蛋白质、多糖、脂类和核酸1组成，这些成分使生物膜与自由生活的浮游细胞显著不同。生物膜中的EPS相互黏附，并可附着于各种表面。EPS基质具有介导细胞间代谢物、遗传物质以及用于细胞间信号传递和防御的化合物交换的特性2。这些特性共同赋予生物膜结构完整性，并使其能够抵御外界胁迫因素，从而有助于逃避免疫识别并产生抗微生物能力3。
Pseudomonas aeruginosa 是一种公认的医院内病原菌，已知其在面对抗菌药物时会采取逃避性的生物膜生长策略。一个典型的例子是囊性纤维化（CF）患者，这是一种隐性遗传病。生物膜在耐抗菌药物的 P. aeruginosa4 的形成过程中起着关键作用，并促使 CF 患者发生慢性肺部感染，导致肺功能加速下降以及过早死亡5。因此，通常开展体外（in vitro）生物膜研究，以评估抗生素及新型抗感染药物对从 CF 患者体内分离的 P. aeruginosa 菌株的作用效果6,7。在生物膜形成后，将抗菌药物外加于生物膜结构，随后利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对生物膜片段进行高分辨率的三维重建。随后通常使用计算机软件 COMSTAT（作为 ImageJ 的插件）来定量分析生物膜结构的变化8,9,10,11。
尽管 COMSTAT 是&#160;有用的&#160;用于量化生物膜结构的图像分析的可重复性与标准化&#160;较少受到关注。例如，在运行 COMSTAT 之前进行的图像处理步骤在操作上是客观的，但在设定图像阈值时包含一定的主观性12,13以类似方式，COMSTAT 程序允许操作者从基础到高级的条件和参数中选择用于图像分割的选项，以及十种定量分析功能（例如，厚度分布、表面积、生物量、无量纲粗糙度系数）。用户可选参数众多，加之操作者技术水平参差，可能导致对生物膜行为的误报。
因此，本实验方案的目标是提供一种相对简单的方法，用于定量比较 体外 使用 COMSTAT 分析生物膜结构。在此，来自囊性纤维化患者样本的生物膜片段的三维图像 P. aeruginosa 使用腔室盖玻片模型，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）捕获分离的细胞14——一种用于实现可重复操作的成熟技术 体外 生物膜实验。利用COMSTAT作为ImageJ的插件，该方法可使研究人员在不同条件下定量识别抗菌剂存在时生物膜结构的变化。总体而言，该方法旨在消除与COMSTAT手动操作相关的主观差异，从而促进各研究机构间实验方案的标准化。

<table><tbody><tr><td>抗Psl单克隆抗体，Psl0096</td><td>Medimmune</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血琼脂培养基（含5%绵羊血的TSA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>八孔腔室盖玻片（不可拆卸孔）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SYTO 9绿色荧光核酸染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox型），液体，高压灭菌</td><td>BioShop Canada</td><td>LBL666</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素，900 &amp;micro;g/mg</td><td>Alfa Aesar by Thermo Fisher Scientific</td><td>J66040</td><td>建议对每批制备的妥布霉素进行最低抑菌浓度（MIC）测试，以确保抗菌活性的质量控制</td></tr><tr><td>Quorum Volocity 6.3</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr></tbody></table>

量化抗菌剂的影响 体外 使用 comstat 软件分析生物膜结构

Quantifying the Effects of Antimicrobials on In vitro Biofilm Architecture using COMSTAT Software

生物膜是由微生物聚集形成的群落，依赖自身产生的胞外聚合物基质来维持其保护功能和结构完整性。医院内病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）能够以生物膜形式生长，导致囊性纤维化（CF）患者发生慢性肺部感染。计算机程序COMSTAT是一种有效的工具，可通过提取三维共聚焦图像中的数据，定量分析抗菌剂诱导的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜结构变化。然而，该软件的标准化操作较少被关注，而标准化操作对于准确报告生物膜行为以及实现不同研究中心之间的数据比较至关重要。因此，本实验方案旨在提供一个简单且可重复的框架，利用COMSTAT对不同抗菌条件下体外（in vitro）培养的生物膜结构进行定量分析。本方法以一株来自囊性纤维化患者的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）分离株为模型，在形成生物膜复制品后，分别暴露于妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096中。该逐步操作流程旨在减少操作者的理解歧义，并最大限度降低遗漏关键图像处理步骤的可能性。具体而言，本方案强调消除与COMSTAT手动操作相关的主观差异，包括图像分割以及定量分析函数的合理选择。尽管该方法要求用户在运行COMSTAT前额外花费时间处理共聚焦图像，但有助于减少自动化输出中对生物膜异质性的误判。

A P. aeruginosa 从感染样本中分离培养&#160;用于展示该方法在准确量化抗菌治疗引起的变化方面的优势 体外 生物膜结构。该模型的整体工作流程如图所示。 图1图像处理与COMSTAT分析流程&#160;在 ImageJ 中的显示如图所示&#160;图2一种简单的直方图阈值分割方法在ImageJ中的应用，用于图像分割&#160;共聚焦激光扫描显微镜z轴层扫图像（保存为OME-TIFF格式）如图所示 图3由妥布霉素和抗Psl单克隆抗体Psl0096引起的生物膜结构变化如图所示 图4代表性共聚焦图像显示了生物膜片段的活细胞（绿色）和抗体（红色）通道分离结果 图4A相应的COMSTAT参数数据，包括平均生物膜厚度、生物量和表面积与生物体积比，如图所示。 图4<...

抗菌剂诱导的变化 铜绿假单胞菌 不同临床分离株在囊性纤维化及慢性肺部感染患者培养物中的生物膜结构存在差异。经共聚焦显微镜观察后，可利用 COMSTAT 软件对生物膜结构的差异进行定量分析。例如，表面积、厚度、生物量）以评估抗感染药物对单个分离株的疗效。

量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

生物膜是微生物的聚集体，依赖于自身产生的胞外聚合物基质提供保护和结构支撑……

本方案的意义在于，它提供了一个简单且可重复的框架，用于在不同抗菌条件下对体外生物膜结构进行定量分析。该技术的主要优势在于有助于消除与手动操作COMSTAT相关的主观差异，从而促进各研究中心之间实验的标准化和透明化。为成像铜绿假单胞菌培养物，需将培养板放置于共聚焦显微镜载物台上，并配备适当的激光激发波长和滤光片组。使用20至25倍水浸物镜，以0.3微米为步进，从基底至每个生物膜片段顶端采集至少六层z轴层析图像。然后将图像保存为OME-TIFF格式，用于COMSTAT分析。当所有图像采集完成后，在ImageJ中打开COMSTAT2软件包，并在桌面上创建一个源文件夹。向文件夹中添加单个 OME-TIFF 文件，并从源文件夹打开 OME-TIFF。删除任何不包含生物量的空白图层。选择“文件”、“导入”和“图像序列”以将文件导入 ImageJ。找到源文件夹并选中它（不要打开），然后点击“选择”。此时将出现序列选项窗口，点击“确定”。选择“图像”、“变换”、“Z轴翻转”，以翻转生物膜的方向，使基底位于图像堆栈的顶部。为定义图像属性，请选择“图像”和“属性”，此时将出现源窗口。将长度单位指定为微米，将体素深度定义为0.3，然后单击“确定”。选择“图像”、“调整”和“阈值”。在阈值窗口中调整图像阈值时，将下部滑块移至最右侧，以手动设置最大阈值，使用上部滑块设置最小阈值。然后使用图像窗口中的滑块逐层滚动，确保在整个图像栈中充分去除背景噪声，并选择“设置”以固定下部阈值。在设置阈值水平窗口中，选择“确定”，并以类似方式设置并固定最大阈值值。选择“应用”，在出现的“将图像栈转换为二值图像”窗口中点击“确定”，然后退出阈值窗口。选择“插件”→“Bio-Formats”→“Bio-Formats 导出器”，将文件以新的文件名保存在源文件夹中。将出现 Bio-Formats 导出器的多文件窗口，选择“确定”。随后将出现 Bio-Formats 导出器选项窗口，再次选择“确定”。运行 COMSTAT 时，选择“插件”和“COMSTAT2”，此时将弹出关于窗口，选择“确定”。在“已观察目录”窗口中，选择“添加”，找到并选中源文件夹，选中后点击“选择”。随后将出现“目录中的图像”窗口，列出待分析的 OME-TIFF 文件。在 COMSTAT2.1 窗口中，取消选择“自动阈值设定奥茨方法”和“连通体积过滤”，以确保软件对各个 OME-TIFF 文件使用预设的阈值。在 COMSTAT2.1 窗口中，选择“生物量”、“厚度分布”和“表面积”，然后点击“运行”以执行程序。输出数据将在日志窗口中显示。测量结果将自动保存为源文件夹中的 TXT 文件。在此代表性分析中，使用一株从感染的囊性纤维化患者中分离培养的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），以展示该方法在定量体外生物膜结构受抗菌药物诱导变化方面的优势。活细胞成像还可用于可视化铜绿假单胞菌生物膜结构在生物膜特异性单克隆抗体和妥布霉素处理前后的变化。COMSTAT 数据分析显示，经处理的生物膜结构与对照组培养物之间存在显著差异。在妥布霉素处理的培养物中，平均厚度和生物量均明显减少。然而，在抗体存在的情况下，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜对妥布霉素诱导的这些结构变化具有抗性。在检测表面积与生物体积比时，无论是否暴露于妥布霉素，抗体存在条件下的生物膜均表现出显著降低，表明经抗体处理的培养物中形成了聚集体。该方法可用于定量评估或比较不同抗菌剂对生物膜基质的破坏作用。以该技术作为通用框架，研究人员可探索多种优化方案，例如在ImageJ中引入新的数学模型和算法插件，以更准确地描绘生物膜的异质性。

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使用 COMSTAT 软件量化抗菌剂对 体外 生物膜结构的影响

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量化酶诱导的病原菌生物膜抑制作用

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酶介导抑制生物膜形成的显微评估

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学习使用COMSTAT软件量化抗菌剂对铜绿假单胞菌生物膜结构的影响。该方法结合共聚焦显微镜成像技术，为评估抗感染药物疗效提供标准化分析框架。

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