量化抗菌剂的影响 体外 使用 COMSTAT 软件分析生物膜结构

本方案的意义在于，它提供了一个简单且可重复的框架，用于在不同抗菌条件下对体外生物膜结构进行定量分析。该技术的主要优势在于有助于消除与手动操作COMSTAT相关的主观差异，从而促进各研究中心之间实验的标准化和透明化。为成像铜绿假单胞菌培养物，需将培养板放置于共聚焦显微镜载物台上，并配备适当的激光激发波长和滤光片组。

使用20至25倍水浸物镜，以0.3微米为步进，从基底至每个生物膜片段顶端采集至少六层z轴层析图像。然后将图像保存为OME-TIFF格式，用于COMSTAT分析。当所有图像采集完成后，在ImageJ中打开COMSTAT2软件包，并在桌面上创建一个源文件夹。

向文件夹中添加单个 OME-TIFF 文件，并从源文件夹打开 OME-TIFF。删除任何不包含生物量的空白图层。选择“文件”、“导入”和“图像序列”以将文件导入 ImageJ。

找到源文件夹并选中它（不要打开），然后点击“选择”。此时将出现序列选项窗口，点击“确定”。选择“图像”、“变换”、“Z轴翻转”，以翻转生物膜的方向，使基底位于图像堆栈的顶部。为定义图像属性，请选择“图像”和“属性”，此时将出现源窗口。

将长度单位指定为微米，将体素深度定义为0.3，然后单击“确定”。选择“图像”、“调整”和“阈值”。在阈值窗口中调整图像阈值时，将下部滑块移至最右侧，以手动设置最大阈值，使用上部滑块设置最小阈值。然后使用图像窗口中的滑块逐层滚动，确保在整个图像栈中充分去除背景噪声，并选择“设置”以固定下部阈值。

在设置阈值水平窗口中，选择“确定”，并以类似方式设置并固定最大阈值值。选择“应用”，在出现的“将图像栈转换为二值图像”窗口中点击“确定”，然后退出阈值窗口。选择“插件”→“Bio-Formats”→“Bio-Formats 导出器”，将文件以新的文件名保存在源文件夹中。

将出现 Bio-Formats 导出器的多文件窗口，选择“确定”。随后将出现 Bio-Formats 导出器选项窗口，再次选择“确定”。运行 COMSTAT 时，选择“插件”和“COMSTAT2”，此时将弹出关于窗口，选择“确定”。在“已观察目录”窗口中，选择“添加”，找到并选中源文件夹，选中后点击“选择”。随后将出现“目录中的图像”窗口，列出待分析的 OME-TIFF 文件。

在 COMSTAT2.1 窗口中，取消选择“自动阈值设定奥茨方法”和“连通体积过滤”，以确保软件对各个 OME-TIFF 文件使用预设的阈值。在 COMSTAT2.1 窗口中，选择“生物量”、“厚度分布”和“表面积”，然后点击“运行”以执行程序。输出数据将在日志窗口中显示。

测量结果将自动保存为源文件夹中的 TXT 文件。在此代表性分析中，使用一株从感染的囊性纤维化患者中分离培养的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），以展示该方法在定量体外生物膜结构受抗菌药物诱导变化方面的优势。活细胞成像还可用于可视化铜绿假单胞菌生物膜结构在生物膜特异性单克隆抗体和妥布霉素处理前后的变化。

COMSTAT 数据分析显示，经处理的生物膜结构与对照组培养物之间存在显著差异。在妥布霉素处理的培养物中，平均厚度和生物量均明显减少。然而，在抗体存在的情况下，铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜对妥布霉素诱导的这些结构变化具有抗性。

在检测表面积与生物体积比时，无论是否暴露于妥布霉素，抗体存在条件下的生物膜均表现出显著降低，表明经抗体处理的培养物中形成了聚集体。该方法可用于定量评估或比较不同抗菌剂对生物膜基质的破坏作用。以该技术作为通用框架，研究人员可探索多种优化方案，例如在ImageJ中引入新的数学模型和算法插件，以更准确地描绘生物膜的异质性。