高维流式细胞术用于解剖种植体组织的免疫功能分析

从解剖的植入物中分离细胞并通过流式细胞术对其进行表征，可以显著有助于了解针对植入物的免疫反应模式。本文描述了一种从解剖植入物中分离细胞及其染色以进行流式细胞术分析的精确方法。

该协议可以帮助我们表征宿主对不同生物材料的免疫反应，从而有助于设计更好的未来医疗植入物。流式细胞术为我们提供了有关免疫细胞浸润生物材料的信息，这有助于我们确定细胞如何响应损伤和材料植入的机制，以及改进治疗的靶点。可以修改相同的方案以表征不同环境中的免疫反应。

解剖一周前接受ECM植入物的小鼠的股四头肌，并收集在含有5毫升无血清培养基的50毫升管中。最后用剪刀将组织切成小块。接下来，向试管中加入 5 毫升消化酶培养基。

将装有消化培养基和切块组织的试管置于 37 摄氏度和 100 RPM 的振荡培养箱中 45 分钟。在孵育结束时，将消化的组织悬浮液通过 70 微米过滤器过滤到单独的 50 毫升管中。使用五毫升注射器头捣碎任何固体组织块，并用室温PBS清洗过滤器。

丢弃过滤器中任何剩余的残留物，并用室温 PBS 将管的体积调节至 50 毫升。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于PBS中的10毫升冷的5毫摩尔EDTA溶液中。如果样品中存在血细胞，则将沉淀重悬于一毫升红细胞裂解缓冲液中，孵育 10 分钟，然后加入 9 毫升 EDTA。

将悬浮液放在冰上 10 分钟。然后用冷PBS将音量调节至50毫升。通过离心收集细胞并重悬沉淀和 100 微升冷 PBS。

将 10 微升悬浮液转移到单独的微量离心管中，并与 10 微升的 trip 和 blue 混合进行计数。将剩余体积的细胞分配到V形底96孔板的每个孔中。从孔中取出 20 微升细胞，并将它们添加到新孔中以用作未染色的对照。

然后使用PBS使每个孔中的最终体积达到200微升。通过离心收集板孔底部的细胞，并将细胞重悬于每孔1至1000浓度的100微升活性染料中。在孵育结束时，用 100 微升新鲜 PBS 洗涤每个孔，并将沉淀重悬于每孔 200 微升染色缓冲液中。

第二次离心后，将细胞重悬于50μL的1至100稀释的单核细胞阻滞剂中。将细胞悬液在冰上孵育 5 分钟，然后加入 50 微升抗体混合物。在避光的冰上孵育 30 分钟。

然后用每孔 100 微升染色缓冲液洗涤孔。再次离心细胞并用 200 微升染色缓冲液洗涤。再重复该过程两次，然后将细胞重悬于 400 微升染色缓冲液中。

在分析样品之前，运行未染色的样品，以便在侧向散射图与前向散射图上调整细胞群。接下来，运行染色的样品。提取自发荧光特征。

然后导入 FCS 文件以将其用作解压缩控件。单击解调图标以打开解调向导，并通过对正负群体进行选通，使用所有单色控件执行解调。接下来，单击"QC"部分并查看复杂性指数。

复杂度指数是衡量光谱特征集合在光谱特征未混合在一起时的可区分程度的指标。最后，通过单击实时解混来解调样品。在这里，可以观察到对照小鼠组织上的14种颜色事实的结果。

在该分析中，可以观察到几个游说者群体，例如 ly6g 阳性中性粒细胞和 ly6c 中高表达单核细胞类别。CD11c 高 MHC 两个阳性树突状细胞在针对 CD11b 进行门控以排除巨噬细胞和其他髓系细胞（如中性粒细胞和单核细胞）时很容易显现。通过关注该 CD11c 阳性细胞群，可以鉴定 CD206 阳性 CD86 阳性树突状细胞的子集，其中包括 CD86 高 M1 样树突状细胞和 CD206 高 M2 样树突状细胞群。

F4/80 表现出在各种巨噬细胞群体中常见的表达梯度。Siglec-F 存在于 F4-80 阳性和阴性群体中，最有可能分别对应于巨噬细胞亚群和嗜酸性粒细胞。尽管用细胞表面标记物染色可以对细胞类型进行这些指定，但重要的是要注意，表达不同标记物的细胞应以功能性方式观察，而不是更二元分类。

尝试此方案时，请记住，在设计检测组合之前了解未染色样品的自发荧光特征是实现更好混合的关键。除了分析细胞外，还可以将分离的细胞分类到特定的群体中，以便通过细胞测定、体外转录组学分析进行下游评估，或进行显微镜分析以评估细胞形态。生物材料流式细胞术分析的复杂性不断增加，有助于弥合基础免疫学研究与新疗法工程之间的差距。