Name: 从细胞和组织样本中分离和功能评估人类乳腺癌干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习从乳腺癌细胞和组织样本中分离高纯度、高活性的乳腺癌干细胞，并进行体外和体内功能评估实验。该方法有助于阐明肿瘤发生和转移的分子机制，为开发靶向治疗策略提供重要基础。

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感谢我们实验室的成员提供的有益讨论和支持。我们关于乳腺癌干细胞和肿瘤微环境的研究由加拿大癌症研究学会研究所和美国国防部乳腺癌项目（资助号 # BC160912）的资助支持。V.B. 获得西安大略大学西部博士后奖学金的支持，A.L.A. 和 V.B. 均获得加拿大乳腺癌协会的支持。C.L. 获得加拿大政府提供的加拿大范尔研究生奖学金的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

乳腺癌转移及治疗耐药已成为全球女性死亡的主要原因。乳腺癌干细胞（BCSCs）亚群的存在导致转移能力增强26,43,44,45,46以及治疗耐药性21,47,48。因此，未来治疗的重点应是根除BCSCs以改善治疗效果，而这需要借助体外（in vitro）和体内（in vivo）方法，准确分离并表征BCSCs的功能特性。
源自不同乳腺癌亚型的永生化细胞系已被证明是研究乳腺癌生物学（包括乳腺癌干细胞（BCSCs）的分离与鉴定）的可行模型<sup ...

了解人类乳腺癌干细胞（BCSCs）的细胞与分子机制，对于应对乳腺癌治疗中所面临的挑战至关重要。BCSC 概念的提出可追溯至21世纪初。st 世纪，其中一小群CD44+CD24-/low 乳腺癌细胞被发现能够在小鼠体内形成异质性肿瘤1,2随后观察到，醛脱氢酶（ALDH）酶活性较高的人类乳腺癌细胞高也表现出类似的干细胞样特性3这些乳腺癌干细胞（BCSCs）代表了一小群具有自我更新和分化能力的细胞，有助于形成肿瘤组织的异质性。1,2,3越来越多的证据表明，进化上保守的信号通路的改变是驱动乳腺癌干细胞存活与维持的关键因素4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14此外，细胞外在微环境已被证明在调控不同乳腺癌干细胞功能方面发挥关键作用15,16,17这些分子通路及调控乳腺癌干细胞功能的外部因素导致乳腺癌复发和转移18 以及对治疗产生耐药性的机制研究19,20,21，治疗后乳腺癌干细胞（BCSCs）的残留存在对乳腺癌患者的总体生存率构成重大挑战22,23因此，对这些因素进行临床前评估对于鉴定靶向乳腺癌干细胞的治疗策略至关重要，有望改善乳腺癌患者的治疗效果和总体生存率。
若干 体外 人乳腺癌细胞系模型及 体内 人源异种移植模型已被用于表征乳腺癌干细胞24,25,26,27,28,29细胞系在每次连续传代后均能持续增殖的特性使其成为开展组学和药物基因组学研究的理想模型系统。然而，细胞系往往难以重现患者样本中所观察到的异质性，因此有必要将细胞系数据与患者来源样本的数据相互补充。以最纯的形式分离乳腺癌干细胞（BCSCs）对于实现对BCSCs的深入表征至关重要。实现高纯度分离的关键在于选择特异于BCSCs的表型标志物。目前，ALDH高CD44+CD24- 细胞表型最常用于通过荧光激活细胞分选（FACS）从大量乳腺癌细胞群体中区分和分离人乳腺癌干细胞（BCSCs），以获得最高纯度1,3,26此外，可通过体外实验评估分离得到的BCSCs的自我更新、增殖和分化等特性。 体内 技术。
例如，体外集落形成实验可用于评估单个细胞在不同处理条件下自我更新形成包含50个或更多细胞的集落的能力30乳腺球形成实验也可用于评估乳腺癌细胞在非贴壁条件下的自我更新潜能。该实验通过在无血清、非黏附性培养条件下连续传代，检测单个细胞形成并生长为球体（包含乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞的混合群体）的能力。31此外，三维（3D）培养模型可用于评估乳腺癌干细胞（BCSC）功能，包括能够高度模拟体内微环境的细胞间及细胞-基质相互作用 体内 微环境，并允许对潜在的乳腺癌干细胞靶向治疗的活性进行研究32尽管体外模型具有多样的应用，但难以模拟其复杂的体内环境 体内 仅使用体外实验评估BCSC行为的条件。这一挑战可通过使用小鼠异种移植模型来克服 体内特别是，此类模型可作为评估乳腺癌转移的理想体系33，研究疾病进展过程中与微环境的相互作用34, 体内 成像35，以及预测抗肿瘤药物对特定患者的毒性和疗效34.
本方案详细描述了人源ALDH的分离方法高CD44+CD24- 从异质性乳腺癌细胞群体中获得高纯度的乳腺癌干细胞（BCSCs）。我们还详细描述了三种体外技术（集落形成实验、乳腺球形成实验和三维培养模型）以及一个 体内 可用于评估乳腺癌干细胞（BCSCs）不同功能的肿瘤异种移植实验。这些方法适用于有意从人乳腺癌细胞系或患者原代来源的乳腺癌细胞及肿瘤组织中分离和鉴定BCSCs的研究人员，以期深入理解BCSC生物学特性，和/或探索靶向BCSC的新型治疗策略。

<table><tbody><tr><td>7-氨基放线菌素 D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>建议用量：0.25 &amp;micro;g/1x10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>醛脱氢酶 (ALDH) 底物</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 ALDH 底物</td></tr><tr><td>基底膜提取物 (BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>商品名为 Matrigel 出售</td></tr><tr><td>细胞培养板：6 孔</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板：60 mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板：96 孔超低吸附</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤器：40 微米</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>将 3 mg/mL 的胶原蛋白用 PBS 稀释至 1:30</td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>锥形管：50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma</td><td>C6158</td><td>使用水中 0.05% 的结晶紫溶液进行染色</td></tr><tr><td>中性蛋白酶</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 (DNAse)</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>终浓度为 0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>流式管：5 mL</td><td>BD</td><td>352063</td><td>聚丙烯圆底管</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD24 抗体</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-藻红蛋白与花青染料偶联，克隆号：ML5</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD44 抗体</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-藻红蛋白偶联，克隆号：G44-26</td></tr><tr><td>N,N-二乙基氨基苯甲醛 (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>作为 ALDEFLOUR 检测试剂盒的组成部分商业出售；请按照制造商说明配制 DEAB</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x，不含钙和镁</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乳腺球培养基组成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>0.4%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;三维类器官培养基组成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>神经调节蛋白 &amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R&amp;D</td><td>3500</td><td>250 ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &amp;micro;M</td></tr></tbody></table>

从细胞和组织样本中分离与功能评估人乳腺癌干细胞

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

乳腺癌干细胞（BCSCs）是一类具有遗传性或获得性干细胞样特性的癌细胞。尽管其数量稀少，但它们在乳腺癌的发生、复发、转移以及治疗耐药中起着关键作用。为了发现治疗乳腺癌的新靶点，深入理解乳腺癌干细胞的生物学特性至关重要。乳腺癌干细胞通常根据其特异性细胞表面标志物（如CD44、CD24）以及醛脱氢酶（ALDH）的酶活性来进行分离与鉴定。这些ALDH高CD44+CD24- 细胞构成了BCSC群体，可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行分离，用于后续功能研究。根据具体的科学问题，可采用不同的 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞（BCSCs）的功能特性。本文提供了从乳腺癌细胞的异质性群体以及乳腺癌患者原发肿瘤组织中分离人源BCSCs的详细实验方案。此外，我们还强调了后续分析 体外 和 体内 包括集落形成实验、乳腺球形成实验、三维培养模型和肿瘤异种移植实验在内的功能检测方法，可用于评估乳腺癌干细胞功能。

本方案可用于从异质性的乳腺癌细胞群体（包括细胞系或解离的肿瘤组织）中分离人乳腺癌干细胞（BCSCs）。对于任一特定的细胞系或组织样本，生成均一的单细胞悬液至关重要，以最大限度地提高BCSC的纯度，因为非BCSC群体的污染可能导致细胞反应的变异性，尤其是在研究目的是评估靶向BCSC治疗剂疗效的情况下。采用严格的分选策略可最大限度减少非BCSC的污染，从而能够富集具有干细胞样特征的乳腺癌细胞亚群，这些细胞在表型上可区别于肿瘤细胞主体群体。具有增强的ALDH酶活性、高表达细胞表面标志物CD44以及低表达或不表达CD24的人乳腺癌细胞，表现为ALDHhighCD44+CD24-表型，可被归类为BCSCs。BCSC在肿瘤细胞主体群体中的比例因细胞系或患者而异（图2），通常取决于疾病阶段，侵袭性更强的乳腺癌通常含有更高比例的BCSCs26,36,37<...

本实验方案描述了从乳腺癌细胞和组织样本中分离乳腺癌干细胞（BCSCs）的方法以及相关步骤 体外 和 体内 可用于评估乳腺癌干细胞表型和功能的检测方法。

乳腺癌干细胞（BCSCs）是一类具有遗传性或获得性干细胞样特性的癌细胞。尽管其比例较低，但它们在肿瘤发生、发展和转移中起着关键作用。

该技术将使研究人员能够以最高纯度和活性分离乳腺癌干细胞，用于体外和体内功能表征实验。分离得到的乳腺癌干细胞还可用于帮助阐明调控肿瘤发生和转移的分子事件，并用于设计靶向这些细胞的治疗策略。通过针对特定细胞和组织类型进行少量修改后，该方法也可应用于其他系统。为了从细胞培养物中制备单细胞悬液，用 PBS 洗涤一个汇合度为 80% 的乳腺癌细胞培养物，并在室温下用适当的细胞解离溶液处理五分钟。待细胞脱落之后，加入五毫升培养基以中和细胞解离溶液，然后将细胞转移至 50 毫升锥形管中进行离心。用五毫升 PBS 重悬沉淀，用于细胞计数。计数后，再次离心细胞，然后将细胞重悬于醛脱氢酶底物缓冲液中，浓度为每毫升1×10⁶个细胞。为了从组织样本中制备单细胞悬液，使用手术刀采用交叉切割法将肿瘤组织切成约1毫米大小的组织块。将组织块置于含有10毫升解离缓冲液的50毫升锥形管中。用封口膜密封试管，在37摄氏度下振荡孵育40分钟，然后通过离心沉淀消化后的组织块。用5毫升移液器将沉淀重悬于5毫升胰蛋白酶中，并将组织在37摄氏度水浴中孵育5分钟。孵育结束后，剧烈吹打组织数次以释放单细胞，并加入足够的DMEM/F-12培养基，使试管内总体积达到25毫升。通过离心收集细胞，将沉淀重悬于1毫升Displace DNAse中，在37摄氏度水浴中孵育5分钟。孵育结束后，用PBS将总体积调至10毫升。用移液器吹打混匀细胞，并通过40微米细胞筛网转移至50毫升离心管中。离心后，将细胞重悬于 5 毫升新鲜 PBS 中用于计数。进行集落形成实验时，在分选后将细胞重悬于完全培养基中，并将适当数量的乳腺癌干细胞分别加入三个含有 2 毫升培养基/管的离心管中，标记为 1×10²、2×10² 或 5×10² 个细胞。轻轻吹打混匀 5 次，充分混匀细胞悬液，然后将细胞接种至 6 孔板的各个孔中。轻轻摇晃培养板以获得均匀的细胞分布，并将培养板放入细胞培养箱中孵育，直至菌落出现。孵育结束后，每孔用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，并每孔加入500微升0.05%结晶紫溶液染色30秒。染色结束后，每孔用两毫升水洗涤两次，以去除多余的染料，然后在光学显微镜下以4倍或10倍放大倍数观察，计数并记录每孔的菌落总数。进行乳腺球形成实验时，分选后将细胞重悬于完全型乳腺球培养基中，并以每平方厘米每孔5×10²个细胞的接种密度，接种至96孔超低吸附细胞培养板中。将培养板置于细胞培养箱中孵育5至10天后，再通过光学显微镜观察并计数每孔中的乳腺球数量。为建立三维培养模型，需小心地将50 µL基底膜提取物加入96孔板的每个孔中，避免产生气泡，并将培养板置于37°C孵育1小时，使溶液充分聚合。孵育10分钟后加入100微升PBS，以避免凝胶层干燥。孵育结束后，将分选后的细胞重悬于200微升3D培养基中，使细胞浓度达到每200微升含5 × 10³至50 × 10³个细胞，并将96孔板每孔中的PBS替换为含细胞的培养基200微升。随后将培养板置于细胞培养箱中培养10至14天，然后评估类器官的形成情况。具有增强的ALDH酶活性的人类乳腺癌细胞高表达CD44，且CD24表达水平低至无，可被归类为乳腺癌干细胞。在整体细胞群体中，乳腺癌干细胞所占比例因细胞系或患者而异，通常取决于疾病阶段，侵袭性更强的乳腺癌通常表现出更高比例的乳腺癌干细胞。通过集落形成实验，可评估单个乳腺癌细胞自我更新并形成包含50个细胞的集落的能力。在非贴壁依赖的实验条件下，可通过乳腺球形成实验评估乳腺癌干细胞的自我更新能力。将乳腺癌细胞与基底膜提取物共同培养，可使乳腺癌干细胞形成三维结构，以模拟体内环境。此外，还可利用体内小鼠异种移植模型，研究乳腺癌干细胞与非乳腺癌干细胞或普通细胞群体在生长、自我更新、分化能力及肿瘤起始能力方面的差异。采用此方法分离得到的乳腺癌干细胞可用于转录组学、激酶组学和代谢组学研究。该方法为研究人员探索乳腺癌干细胞在肿瘤发生、转移、复发及治疗耐药性中的作用提供了机会。

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Cancer Research

癌症研究

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分离与鉴定具有干细胞特性的头颈部鳞状细胞癌亚群

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合成与表征一种抑制NF-κB活性及乳腺癌干细胞的阿司匹林-富马酸前药

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从妇科及乳腺癌肿瘤中获取肿瘤干细胞球

利用人原代前列腺上皮细胞，我们报道了一种基于球体的、无需生物标志物的功能性鉴定干细胞样细胞的新方法，该方法通过标记保留实验实现。本文详细描述了BrdU、CFSE或Far...

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