脂结合蛋白和过敏原中内源性配体的去除与替换

许多过敏原可结合疏水性分子。本方案能够完全去除并替换这些配体，从而系统性地研究它们对结构和免疫原性的影响。采用反相高效液相色谱结合热退火处理具有两个优势。

它可去除内源性配体，并有助于溶解配体，从而暴露原本无法接近的结合位点。如果我们能够确定导致过敏性的因素，就有可能设计出规避这些因素的治疗方法。许多蛋白质会结合脂质配体，这些配体结合牢固，可能影响蛋白质的结构与功能。

我们的方法能够系统地研究这些相互作用。许多脂质货物的溶解度和可及性有限，可能会抑制加载过程。在制备这些配体时务必谨慎，并考虑根据具体系统进行相应调整的必要性。

由于处理疏水性和不溶性配体对一些过敏学家和生物化学家而言需要适应，观察样品在不同阶段的外观可能会有所帮助。在完成克隆、表达和纯化后，将12毫升经切割处理的Bla g 1加入截留分子量低于10千道尔顿的离心过滤装置中，在摆动转子中进行多次离心，直至总体积减少至少于2毫升。将所得浓缩液上样至配备C18反相色谱柱（以97%缓冲液A和3%缓冲液B平衡）的250 × 10毫米高效液相色谱（HPLC）系统中。按照表格所示，以每分钟1.5至4毫升的流速洗脱Bla g 1，并利用280纳米处的荧光吸光度监测洗脱过程。

从大约34至40分钟开始，当B缓冲液浓度超过74%时，每种Bla g 1组分收集量不超过四毫升。将合并的Bla g 1组分分装至玻璃试管中。用石蜡膜覆盖试管，并在膜上打两个孔。

然后，将样品在零下80摄氏度冷冻一小时，并使用冻干机干燥所得的去脂蛋白样品。为确定预期的Bla g 1产量，将一份冻干的去脂蛋白测试等分试样重新悬浮于5毫升复性缓冲液中。将混合物置于含有250毫升水的500毫升烧杯中，在加热板上加热至95摄氏度，同时搅拌并间歇性涡旋振荡。

将溶液在95摄氏度下保持30至60分钟，然后让水浴锅缓慢恢复至室温。当溶液冷却后，将退火后的Bla g 1脂质混合物通过0.22微米的注射器滤器，以去除颗粒物，并使用新的截留分子量为10千道尔顿的离心滤器，将滤过的蛋白在PBS中置换缓冲液三次，以去除任何残留的游离脂肪酸和有机溶剂。随后，采用标准蛋白分析方法测定蛋白浓度，以确定剩余Bla g 1分装样品的预期产量。

为了重建Apo-Bla g 1，将每份Bla g 1分装样品用5毫升复性缓冲液重悬，并按所示方法对样品进行退火。为了使Bla g 1负载磷脂，将10毫克所需货物加入玻璃试管中，用氯仿溶解，随后蒸发氯仿以形成脂质膜。然后向试管中加入PBS，使磷脂终浓度为20毫摩尔。

将磷脂加热至脂质载荷的相变温度以上，以再水合脂膜，并涡旋至溶液变浑浊。然后加入磷脂载荷，使配体相对于Bla g 1的摩尔过量达到20倍，该计算基于预期产量。可能会形成沉淀。

按照所示方法，在退火蛋白前涡旋混匀。为通过磷-31核磁共振（³¹P NMR）确认载荷的去除或加载，请使用离心滤膜将样品浓缩至浓度高于100 µmol/L，操作如所示。按指示在PBS缓冲液中配制已知浓度的磷脂参考样品，并将Bla g 1终末参考样品用胆酸盐缓冲液按1:1比例稀释，总体积约为600 µL。

使用宽带探针获取经溶解处理的 Bla g 1 样品及参考磷脂标准品的一维 31-磷核磁共振（NMR）谱图，将 Bla g 1 的 31-磷 NMR 谱图与磷脂参考样品的谱图进行比较，通过观察可见峰的化学位移，确认内源性结合配体的去除或目标配体的成功结合；随后比较 Bla g 1 谱图与磷脂参考标准品的峰强度，以确认配体完全结合的化学计量比。通过亲和层析法，可高效纯化重组 GST 标签的 Bla g 1，每升细胞培养物可获得 2 至 4 毫克的蛋白产量。在 4°C 条件下过夜孵育 TEV 蛋白酶，足以切除 GST 标签，最终获得分子量约为 24 千道尔顿的产物。

将Bla g 1上样至反相C18柱可得到特征性的洗脱曲线，在50%缓冲液B条件下出现两个较大的峰，另有一个较大的峰出现在75%缓冲液B条件下。Apo-Bla g 1的磷-31核磁共振（³¹P NMR）谱图显示无明显磷脂信号。可通过已知浓度的二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）参考样品，利用核磁共振数据绘制标准曲线。将DSPC-Bla g 1样品测得的磷-31信号强度与该标准曲线进行比较，可计算出每分子蛋白结合脂质的化学计量比。

蟑螂过敏原Bla g 1在无辅基（Apo）状态及结合脂质状态下测得的圆二色光谱在220纳米和210纳米处均显示极小值，表明其具有以α-螺旋为主的二级结构。基于圆二色光谱的热变性实验也显示α-螺旋二级结构呈协同性丧失，提示存在一个折叠的球状结构域。此外，对所得熔解温度的分析表明，当Bla g 1结合nMix配体后，其熔解温度显著升高，这与从天然过敏原来源中提取的Bla g 1特性一致。

本方案的成功依赖于克服疏水性配体溶解度有限以及美洲大蠊过敏原Bla g 1结合腔难以接近这两个难题。该实验流程为开展免疫学研究（如T细胞增殖实验）奠定了基础，可用于评估脂质配体对致敏作用的影响及其分子机制。结合进一步的生物物理实验方法，我们已证实疏水性配体的结合可增强Bla g 1的稳定性，这可能对表位生成及致敏性产生后续影响。