Name: 成人小鼠卵巢中的精确卵泡图解 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解小鼠卵巢卵泡计数的两种精确方法：体视学技术具有高灵敏度和准确性，而直接计数法更快捷简便。研究人员可根据实验需求选择合适方法，提高卵巢生物学研究的可重复性。

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本研究得益于维多利亚州政府运营基础设施支持和澳大利亚政府国家健康与医学研究委员会（NHMRC）独立研究机构支持计划（IRIISS）的资助，并获得了国家健康与医学研究委员会（ALW #1120300）和澳大利亚研究理事会（KJH #FT190100265）的资金支持。作者谨此感谢莫纳什大学动物研究平台、莫纳什组织学平台和莫纳什显微成像中心提供的技术支持。

从雌性C57BL6J小鼠中采集卵巢。所有动物操作和实验均遵循澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）发布的《动物护理与使用实践规范》，并经莫纳什大学动物研究平台动物伦理委员会批准。
注意：本研究使用了一种已通过体视学11和直接计数法12,13证实可耗竭原始卵泡卵母细胞的化疗药物，以在同一动物中比较两种计数方法。选用8周龄（年轻成年）雌性小鼠，在单次腹腔注射75 mg/kg体重的环磷酰胺或等量生理盐水对照（每组n=5）前进行称重。该剂量已被证实可导致原始卵泡数量减少约50%，但未见引起小鼠发病或死亡的报道14。处理48小时后采集卵巢组织。每只小鼠的一个卵巢用10%（v/v）中性缓冲甲醛溶液固定24小时，另一个则用Bouin氏液固定24小时。组织随后被包埋于甲基丙烯酸羟乙酯树脂中并连续切片至20 µm，或包埋于石蜡中并连续切片至5 µm。所有组织切片均采用过碘酸雪夫（PAS）和苏木精染色。
1. 组织学制备：小鼠卵巢的固定、处理、包埋与切片
<ol>
	<li>用解剖显微镜和精细刀片修剪输卵管及周围所有脂肪组织，分离小鼠卵巢，注意不要损伤或切到卵巢本身。如有需要，此步骤可使用解剖显微镜和精细刀片图1A).</li>
	<li>立即将组织放入含有Bouin固定液（用于体视学分析）或福尔马林固定液（用于直接计数）的小型标记管中固定24小时图1B)，然后将组织转移至70%乙醇中。 
	注意：卵泡形态在经Bouin液固定的卵巢组织中保存最为完好，该组织包埋于甲基丙烯酸羟乙酯树脂中图2).</li>
	<li>固定卵巢组织的整体处理及甲基丙烯酸羟乙酯树脂包埋用于体视学分析补充文件 1），或使用标准组织学方案对石蜡包埋样本进行直接计数。 
	警告：树脂具有毒性，因此所有组织处理步骤均须在通风橱中进行，并始终佩戴手套。</li>
	<li>使用专用树脂甲基丙烯酸甲酯切片机（图1C）配有一个玻璃刀（图1D) 以彻底切割较厚的甲基丙烯酸乙二醇酯树脂切片（例如 20 &#181;m）。以固定间隔收集切片（例如，每3个rd 将切片置于玻璃显微镜载玻片上用于体视学分析。</li>
	<li>使用标准切片机切割薄的石蜡切片（例如，4-6 &#181;m）。以固定间隔收集组织切片（例如，每隔9th 将样本置于玻璃显微镜载玻片上，用于直接进行卵泡计数。</li>
	<li>用高碘酸-希夫染液和苏木精对玻片进行染色（补充文件 2).</li>
	<li>用于石蜡切片的标准DPX封片剂，或用于乙二醇甲基丙烯酸酯树脂切片的厚型DPX封片剂（图1E). 
	注意：甲基丙烯酸甘油酯树脂DPX具有危险性，因此该步骤需在通风橱中进行。 
	注意：糖甲基丙烯酸酯树脂DPX黏度极高。必须用刮刀用力按压盖玻片，使其牢固粘附，确保DPX均匀且薄层分散，并保证盖玻片下无气泡产生（图1F).</li>
</ol>
2. 使用光学分数法对原始卵泡数量进行体视学估计
<ol>
	<li>打开计算机、多控单元、相机和体视学装置内的光源，并将显微镜物镜调至低倍放大（例如 10x）。</li>
	<li>打开体视学软件。</li>
	<li>将第一张载玻片牢固地放置在显微镜载物台上。</li>
	<li>通过检查调整光照暴露 自动的 在……下方 暴露 在 相机设置 面板（补充图 1A）。或者，手动调节光照曝光。</li>
	<li>使用操纵杆定位第一个组织样本，并将样本调至清晰对焦。</li>
	<li>调整白平衡，可通过单击 更多设置 （位于右下角） 相机设置 面板），然后单击 白平衡 并点击 自动的 (补充图1B）。或者，单击 白平衡 按钮，位于其旁边 更多设置 按钮（或 选择区域 在 更多设置），通过选择切片上的白色区域手动设置白平衡。</li>
	<li>前往 探针 下拉菜单并点击 光学分馏器工作流程然后点击 开始新项目 并点击 好的。
	<ol>
		<li>如果已保存现有的采样配置，在 采样参数 点击 是 | &#8230; 并选择所需的采样配置。</li>
		<li>如果否，请点击 无 并手动输入连续切片信息（补充图1C）并在第 2.13 步定义探针配置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 下一步，将显微镜设置为 低倍率 并选择 10x 从下拉菜单中选择放大倍数。</li>
	<li>点击 下一步，然后围绕整个卵巢切片进行描迹——首先用左键点击切片周围开始描迹，最后右键点击并选择 闭合轮廓.</li>
	<li>点击 下一步，将显微镜设置为 高倍放大 并选择 100倍油镜放大 从下拉菜单中。</li>
	<li>在载玻片的组织切片上滴加一滴油，将显微镜物镜切换至100倍放大倍数。</li>
	<li>调整光照（如步骤 2.4 所述），然后点击 下一步.</li>
	<li>设置 采样参数 以定义探针配置。此处，计数框架被设定为 47.5 &#181;m x 47.5 &#181;m (2,256.25 &#181;m2）且步长设置为 100 &#181;m x 100 &#181;m (10,000 &#181;m2) (补充图2）确定采样参数后，保存模板，并在后续分析会话的第 2.7 步重新打开。</li>
	<li>点击 开始计数 (补充图1D。聚焦到样品顶部，点击 好的 并开始计数。</li>
	<li>使用调焦旋钮逐层移动观察 10 &#181;m 采样深度，并计数所有卵母细胞核进入焦平面的原始卵泡。点击 下一步 移动到下一个区域。
	<ol>
		<li>将卵泡分类为原始卵泡的标准是：卵母细胞周围仅被鳞状（扁平）颗粒细胞包围，而无立方形颗粒细胞。图 2A). 
		注意：原始卵泡与中间/过渡卵泡不同，后者由立方形和扁平形颗粒细胞混合组成。图2B），以及主要由立方形颗粒细胞包围的初级卵泡（图2C这些卵泡类别应分别进行定量。</li>
		<li>仅计数卵母细胞核可见的卵泡。卵母细胞核必须位于计数框内，或与计数框的绿色允许线相接触。补充图 1E、F).</li>
		<li>如果卵母细胞核位于计数框之外（补充图 1G若卵泡接触计数框的红色排除线，则不计入该卵泡。</li>
		<li>在评估外源性化学物质（如化疗药物）引起的原始卵泡耗竭时，应确保所计数的所有卵泡均为健康卵泡，即具有正常形态（图2）。分别计数异常或闭锁卵泡。通常，卵泡死亡可由化疗等损伤因素诱导，因此应单独量化闭锁卵泡，以区分健康卵泡与闭锁卵泡，因为只有健康卵泡才构成卵巢储备15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成该区域计数后，执行以下操作之一：
	<ol>
		<li>点击 添加新部分，然后返回步骤 2.3，准备下一个计数区域。</li>
		<li>点击 我已经完成计数 结束实验。将物镜转回10倍，退出体视学软件，关闭光源、相机、多功能控制单元和计算机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从整个卵巢取样的每个组织切片中获取原始卵泡总数（Q），然后使用电子表格，根据以下公式计算每个重复动物个体（N）的最终数值4. 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg" />，其中： 
	N = 卵巢内卵泡总数的估算值 
	Q 原始原始卵泡计数。 
	f1 = 采样间隔。每 3rd 因此对部分进行了取样 <img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg" />. 
	f2 计数框（样本区域）与步进器之间的关系，通过以下方式计算得出 <img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg" />. 由于样品区域是 2256 &#181;m2 (47.5 &#181;m x 47.5 &#181;m）以及步进区域 10000 &#181;m2 (100 &#181;m x 100 &#181;m), <img alt="公式 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg" />. 
	f3 = 所取卵巢切片的取样比例。由于 10 &#181;m 的 20 &#181;m 切片取样， <img alt="公式 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg" />. 
	因此， <img alt="公式 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg" />. 
	注意：本方案描述了如何使用一种被广泛引用的体视学软件来应用这些体视学分析原理。材料表）；然而，也可使用其他体视学软件。无论使用何种软件设置参数，卵巢卵泡体视学分析中应用的原理均相同。在成年小鼠卵巢中，当计数的物体数量达到100个或以上时，体视学结果最为准确。4，因为这能使估计值的误差系数低于10%16. 此处列出的采样参数已优化，以确保在对照组成年野生型 C57BL6J 卵巢中可计数至少约 100 个结构（即原始卵泡、过渡卵泡和初级卵泡）。可先开展一项小样本量的预实验，以确定最佳采样参数，例如分析切片的间隔、切片数量以及在采样切片中设置的光学分离器数量。17.</li>
</ol>
3. 通过直接卵巢卵泡计数估算原始卵泡数量
<ol>
	<li>将载玻片牢固地置于标准光学显微镜下，进行直接计数以获得原始卵泡的原始数量。
	<ol>
		<li>将卵泡归类为原始卵泡的条件是：卵母细胞清晰可见，且周围仅被单层扁平（鳞状）颗粒细胞包绕，无立方状颗粒细胞。图 2D). 
		注意：原始卵泡与中间型/过渡型卵泡不同，后者由立方形和扁平的颗粒细胞共同组成（图 2E），以及主要由立方形颗粒细胞包围的初级卵泡（图2F）。这些卵泡类别应分别进行定量。</li>
		<li>确保所计数的所有卵泡均为健康状态，即具有正常形态（图2）。分别计数任何异常或闭锁的卵泡，因为只有健康卵泡才构成卵巢储备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，可拍摄多张高倍（如20x）显微照片，或将多张图像拼接，覆盖整个卵巢组织切片，然后通过打开图像文件进行计数。此步骤可手动完成，也可使用自动切片扫描仪实现。</li>
	<li>从整个卵巢按预定间隔采集的每个组织切片中获取原始卵泡总数（Q）。将该数值乘以取样分数的倒数，以根据以下公式获得每只重复实验动物的最终值（N）。 
	<img alt="方程 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg" />，其中： 
	N = 卵巢内卵泡总数的估算值。 
	Q 原始卵泡计数（每种类型分别计算）。 
	f1 = 采样间隔。每 9th 因此对部分进行了取样 <img alt="方程 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg" />. 
	因此， <img alt="公式 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg" />.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文提供了一种逐步操作方案，用于小鼠原始卵泡计数的金标准技术——体视学方法，以及更常使用的直接卵泡计数法。通过化疗处理，比较并对比了同一动物左右卵巢中采用这两种不同方法所获得的结果。两种方法均显示出个体间原始卵泡数量存在高度变异性。体视学方法记录到卵巢储备显著减少，但在化疗处理组与对照组相比，直接计数法未能检测出原始卵泡数量的显著降低。
值得注意的是，即使在近交系小鼠（如 C57BL6J）中，年轻成年野生型（对照）雌性个体的卵巢储备也呈现出广泛分布，这与人类的情况相似。影响这一现象并参与卵巢储备建立的因素仍有待进一步研究18。目前小鼠卵巢功能研究之间存在高度变异性，这给领域内数据的比较或重复带来诸多挑战，也阻碍了保护卵母细胞数量和质量的新疗法向临床转化的进程4。这种变异性可能源于多种因素，不仅包括所采用的计数方法，还包括动物品系和年龄的差异，以及处理方案（如剂量和时间）的不同。在比较不同研究的数据时，必须综合考虑上述所有因素。尽管如此，本研究中采用的卵泡耗竭模型总体上突显了体视学方案的准...

储存在卵巢原始卵泡中的未成熟、处于减数分裂停滞状态的卵母细胞是雌性生殖系的储存单位，构成了个体一生的卵巢储备。原始卵泡数量会随着年龄增长而自然减少1，也可能因接触外源性化学物质（包括某些药物以及空气、食物和水中的环境毒物）而提前耗竭2。由于原始卵泡的数量是有限的，卵巢内卵泡的数量和质量在很大程度上决定了雌性的生育能力以及子代健康。因此，准确量化女性原始卵泡数量对于评估外源性损伤对卵巢储备的非靶向影响至关重要。
在女性中，通常无法对整个卵巢进行分析，因此在临床环境中必须采用非侵入性的卵巢储备替代评估指标。抗M&#971;抗苗勒管激素（AMH）是临床上最常用的替代生物标志物3血清抗缪勒管激素（AMH）水平常在高龄孕妇女性中，或癌症治疗（如化疗）前后进行检测。然而，AMH由生长中的卵泡产生，而非由原始卵泡产生，因此血清AMH水平无法反映原始卵泡的绝对数量。
由于目前尚无准确测定女性原始卵泡数量的方法 原位在小型动物模型（如啮齿类动物）中计数卵巢卵泡，仍是评估外源性损伤对原始卵泡及生育力影响程度的重要研究工具。然而，文献中关于啮齿类动物模型原始卵泡数量的报道存在高度变异性4造成这一现象的主要原因是所采用的计数方法在技术上存在广泛报道的差异。目前文献中主要描述了两种用于统计小鼠原始卵泡数量的不同技术，包括采用分级光学分离器法的体视学方法和直接卵泡计数法。
立体学被广泛认为是金标准，因为它采用系统性均匀随机取样方法5，使其成为定量整只小鼠或大鼠卵巢中原始卵泡数量的最准确方法4,6,7. 体视学是无偏倚的，因为它考虑了目标物体的三维结构8采用光学分离器/分层法，利用厚组织切片（例如 20 μm）通过三个采样层级对原始卵泡进行定量 &#181;m）在已知比例的小鼠卵巢组织中。首先选择取样间隔（例如，每3个rd 随机起始位置（取样分数1，f1)4从该点开始，以系统且均匀的方式对整个卵巢进行切片取样。然后，将无偏计数框叠加在卵巢切片上，并沿预定的随机化计数网格（取样分数2，f）逐步移动2)8最后，对切片厚度的已知部分进行光学取样（例如，10 &#181;m），并计数该区域内的卵泡（取样分数3，f3)4原始卵泡数量需乘以这些取样比例的倒数，以获得最终数值。该方法需要经过专业培训并配备专门设备，包括配备由体视学软件驱动的电动载物台的显微镜。组织应使用特殊的Bouin固定液保存，并包埋于甲基丙烯酸羟乙酯树脂中，以便使用玻璃刀在甲基丙烯酸羟乙酯树脂切片机上切出较厚的组织切片。该方法旨在校正组织收缩与变形，最大程度地保留卵巢及卵泡的三维形态结构9.
直接计数卵泡是目前最常用的卵泡计数方法10。该方法可使用常规固定剂（如甲醛）固定组织，随后进行石蜡包埋，并用普通切片机连续切片，切片厚度为4–6 µm。在整个组织切片中，按照设定的间隔系统性地计数卵泡，再乘以取样间隔的倒数，从而估算卵泡总数。该方法快速、简便，可利用存档组织样本，并采用标准组织学技术制备，仅需配备常规成像功能的光学显微镜即可完成。然而，尽管具有上述优势，直接卵泡计数法在准确性和计数参数的严格性方面不及体视学方法，因而更容易受到研究者主观偏差的影响。此外，组织在处理过程中可能发生收缩和变形，破坏卵巢结构的完整性和形态，从而增加卵泡分类与定量的难度。
本文旨在介绍两种常用于定量评估小鼠卵巢中原始卵泡数量的方法：体视学法和直接计数法。我们将为这两种方法提供详细的实验方案，并阐述各自的优缺点，以提高本领域的可重复性，并帮助研究人员为其研究选择最合适的计数方法。

<table><tbody><tr><td>1-丁醇（HPLC）</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>酸性酒精</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>布因液&amp;rsquo;固定剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>苦味酸 0.9%（w/v），甲醛 9%（v/v），乙酸 5%（w/v）</td></tr><tr><td>环磷酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯二甲苯（DPX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>乙醇 100%</td></tr><tr><td>铝柄微型羽毛眼科手术刀</td><td>视觉设计</td><td>#FEA-745-SR</td><td>解剖用刀片（见图1）</td></tr><tr><td>福尔马林固定液</td><td>澳大利亚生物染色公司</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm × 50 mm</td></tr><tr><td>糖甲基丙烯酸酯树脂 RM2165 切片机</td><td>徕卡显微系统</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>糖甲基丙烯酸酯 DPX</td><td>*自制</td><td></td><td>混合1.5 L二甲苯；800 g聚苯乙烯颗粒；100 mL邻苯二甲酸二丁酯，持续3周</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>特拉扬</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;苏木精染色</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 BX50 显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>#BX50</td><td>配备10倍干镜的明场显微镜 &amp;& 100倍油镜物镜（数值孔径1.3）</td></tr><tr><td>奥林巴斯浸油 F型</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯 TH4-200 光源</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸</td><td>特拉扬</td><td>#PERI1%</td><td>1% 过碘酸</td></tr><tr><td>旋转式切片机 CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>用于切割石蜡切片</td></tr><tr><td>希夫&amp;rsquo;s 试剂</td><td>特拉扬</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>斯科特氏自来水</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>碳酸钾，硫酸镁，水</td></tr><tr><td>StereoInvestigator 体视学系统</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>包含 StereoInvestigator 软件、多控制单元、自动载物台和操纵杆</td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm，72 个</td></tr><tr><td>Technovit 7100 塑料包埋系统</td><td>Emgrid 澳大利亚</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 黄色</td><td>Emgrid 澳大利亚</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

成年小鼠卵巢中卵泡的精确计数

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

进行有性繁殖的雌性哺乳动物在出生时便已拥有其一生所需的全部卵母细胞。未成熟且处于静止状态的卵母细胞存在于原始卵泡中，原始卵泡是雌性生殖系的储存单位。这些卵母细胞不可再生，因此其出生时的数量及后续的损耗速率在很大程度上决定了雌性的生育寿命。准确量化女性和动物原始卵泡的数量，对于评估药物和毒性物质对卵巢储备功能的影响至关重要。同时，这也是评价现有及新兴生育力保存技术是否必要及其成功率所必需的。目前尚无方法能够准确测量女性卵巢储备中原始卵泡的数量。此外，从大型动物或濒危物种获取卵巢组织用于实验研究通常不可行。因此，小鼠已成为此类研究的关键模型，而能够评估整只小鼠卵巢中原始卵泡数量的技术便成为一项至关重要的工具。然而，文献中关于小鼠卵巢绝对卵泡数量的报道差异极大，导致数据难以比较或重复。这种差异源于多种因素，包括品系、年龄、处理组以及计数方法在技术上的不同。本文提供了一份逐步操作指南，介绍如何制备小鼠卵巢的组织学切片，并采用两种不同方法对原始卵泡进行计数：[1] 体视学方法，基于分层器/光学分离器技术；[2] 直接计数法。本文将重点阐述每种方法的主要优势与局限性，以期提高该领域的可重复性，并帮助研究人员为其研究选择最合适的方法。

采用了一种特征明确的卵泡耗竭模型，对年轻成年雌性小鼠单次给予环磷酰胺化疗药物或生理盐水对照溶剂（每组 n=5），并在给药后 48 小时采集每只动物的双侧卵巢。每只动物的一个卵巢按步骤 1 所述方法分别用于两种分析方式：体视学法或直接计数法。每只动物的左侧和右侧卵巢被随机分配至各组。这些数据表明，采用体视学方法时，化疗处理后可检测到小鼠原始卵泡数量显著减少（387 ± 11 个卵泡），而对照组为（1043 ± 149；p=0.0024）（图 3）。相比之下，使用同一批动物的对侧卵巢进行直接卵泡计数时，化疗组（490 ± 40）与对照组（752 ± 139；p=0.1063）相比，并未检测到卵巢储备的显著降低（图 3）。值得注意的是，从生理盐水处理组动物的分布范围较环磷酰胺处理组更宽可以看出，年轻成年野生型动物的原始卵泡数量本身存在变异性，即使采用体视学方法进行计数，这一现象依然明显（图 3）。
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本文介绍、比较并对比了两种用于准确计数固定小鼠卵巢组织卵泡的不同技术。

进行有性繁殖的雌性哺乳动物在出生时便已拥有其一生所需的全部卵母细胞。未成熟且处于静止状态的卵母细胞存在于原始卵泡中……

我们希望这些详细的实验方案能够帮助提高本领域的可重复性，同时使研究人员在为其研究选择计数方法时能够做出明智的决策。由于采用了多个采样参数，体视学方法具有高度的敏感性和准确性。然而，直接计数法更快捷、更简便，且可对采用标准组织学技术制备的样本进行操作。体视学用于卵巢生物学研究，以评估毒性物质对卵巢储备功能的影响。该方法也可应用于生命科学领域，用于肾脏和大脑的研究。熟悉卵泡形态需要一定的经验。参考以往研究以确定形态特征，并建立标准化的分类标准，有助于提高一致性。使用光学分数法通过体视学方法估算原始卵泡数量时，启动体视学设备中的计算机、多控单元、相机和光源，将显微镜物镜调至低倍放大倍数。打开体视学软件，将第一张玻片牢固地放置在显微镜载物台上。使用操纵杆定位第一个组织样本，并将样本调至焦点。在相机设置面板的曝光选项下，点击并拖动滑动条以调整曝光亮度。在相机设置面板中，点击白平衡按钮，然后点击切片的空白区域以调整白平衡。打开探针菜单，选择光学分馏器工作流程，然后单击“开始新样本”，再单击“确定”。如果已保存现有的采样配置，请在采样参数下点击“是”，并选择所需的采样配置。单击“下一步”，将显微镜调至低倍放大模式，并选择10倍放大倍数。单击下一步，然后单击鼠标左键以追踪整个卵巢切片。单击鼠标右键以结束选择并闭合轮廓。单击下一步，将显微镜调至高倍放大，选择100倍油镜放大。在载玻片的组织切片上滴加一滴油后，按照演示调整光照，重新对样本进行聚焦，然后单击下一步。接着，单击开始计数，将焦距调至样本顶部，单击确定，然后开始计数。使用聚焦旋钮移动通过10 µm的采样深度，并在计数框内寻找卵母细胞核清晰对焦的任何卵泡。然后，点击“下一步”进入下一个观察位点。若卵母细胞周围仅被扁平的鳞状颗粒细胞包围，而无立方状颗粒细胞，则将该卵泡分类为原始卵泡。仅计数可见卵母细胞核的卵泡。细胞核必须位于计数框内，或与计数框的绿色包含线相接触。如果卵母细胞的细胞核位于计数框之外，或与计数框的红色排除线相接触，则不应计数该卵泡。在评估外源性化学物质引起的原始卵泡耗竭时，应确保所有计数的卵泡均健康且具有正常形态。分别计数任何异常或闭锁的卵泡。当该切片的所有位点计数完成后，单击“添加新切片”以设置并计数下一个切片中的卵泡，或单击“我已完成计数”以结束本次会话并退出软件。随后，获取从整个卵巢取样的每个组织切片中的原始卵泡总数，并按照所示公式计算每只重复动物的最终数值。通过直接计数原始卵泡来估算其数量时，需获取整个卵巢组织切片的多个拼接高倍显微照片。分析图像时，在 ImageJ 软件中打开这些图像。要将卵泡分类为原始卵泡，必须能够清晰观察到卵母细胞，并且其周围仅被扁平的颗粒细胞包裹，而不被立方状的颗粒细胞包裹。使用计数工具获取从组织中采集的每个切片的原始原始卵泡数量。在获得所采组织切片的原始卵泡总数后，将该数值乘

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科研

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Developmental Biology

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成年小鼠卵巢中卵泡的精确计数

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