用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

这种新的类球体培养方法可用于研究肿瘤发生能力，以分析不同类型的肿瘤干细胞群体的存在情况，也可很好地应用于高通量筛选新药。这是一种稳定且可重复的培养体系，能够生成大量大小均一的类球体。此外，这些类球体还可用于研究癌干细胞。

该方法旨在研究慢性癌症生物学，但通过改变三维培养条件，也可轻松用于研究其他类型的癌症。操作过程中需注意培养基中是否存在气泡，成球期间避免过度移动培养板，并在将类球体收集至滤网时小心操作。首先，向24孔板的每个孔中加入500 µL抗黏附冲洗液进行预处理。

离心几秒后，使用摆桶式转子离心板，并用2毫升温热的基础培养基冲洗每个孔。在显微镜下观察培养板，确保微孔中的气泡已完全去除。若未观察到气泡，在每个孔中加入1毫升温热的DMEM基底膜基质培养基之前，再次冲洗各孔。

为诱导球体形成，将所需浓度的Caco-2细胞接种于含DMEM培养基（补充10% FBS和1%抗生素）的10厘米培养皿中，形成二维单层细胞。在37°C、5%二氧化碳的湿润环境中培养。当细胞达到80%融合度时，用5毫升PBS洗涤细胞，随后加入2毫升胰蛋白酶-EDTA，在37°C、5%二氧化碳条件下处理2至5分钟。

待细胞脱落后，加入四毫升完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶。计数后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适当体积的DMEM基底膜基质培养基中，使每毫升培养基中的细胞浓度达到所需浓度。向预包被的24孔板的每个孔中加入一毫升细胞悬液，随后向每个孔中加入一毫升DMEM基底膜基质培养基。

接种后，立即离心培养板，并使用光学显微镜确认细胞已均匀分布于微孔中。随后将培养板放入细胞培养箱中孵育48小时，在此期间勿扰动细胞。孵育结束后，用移液管吸取每孔一半的上清液，轻轻吹打以将类球体从微孔中分离。

当所有类球体均已脱离后，使用移液器小心地将每个孔中的3D培养物转移至置于15毫升锥形管上方的37微米可逆滤筛中。每次用1毫升预热的基础培养基洗涤各孔，共洗涤三次，以收集任何残留的类球体，并将这些额外的类球体加入滤筛中。最后一次洗涤后，在显微镜下检查培养板，确认所有类球体均已从微孔中移除。

然后将滤网倒置在新的15毫升离心管上，用新鲜的DMEM基底膜基质培养基冲洗滤网底部，以将球体收集到离心管中。由500个细胞形成的球体随时间表现出最均一的体积增长。每球体500至600个细胞被确定为实现良好生长和低变异性的最佳细胞数量。

添加基底膜基质可促进球体的生长和均一性。在长期培养中，细胞在第3天呈现为致密的多层结构，而在第10天则可明显观察到排列成单层的扁平细胞。

有趣的是，从第5天开始，球状体内部出现管腔结构。此外，在第5天和第7天观察到增殖细胞核抗原阳性细胞数量明显增加，到第10天则有所减少。令人意外的是，活化的Caspase 3仅在第3天和第5天的极少数细胞中被检测到。

尽管在每个时间点均观察到高水平的β-catenin表达，类球体向成骨细胞分化的潜能可通过其碱性磷酸酶及溶质载体家族2A5 mRNA的表达得以证实。此外，这些类球体表达典型癌症干细胞标志物，并对临床上常规用于结直肠癌患者的联合化疗方案具有响应性。

因此，类球体由不同的细胞群体组成，可用于很好地分析细胞对刺激物（如折射剂）以及药物反应的特异性响应。