Name: 研究结肠癌干细胞的球体三维模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学习使用Caco2结肠腺癌细胞建立三维球体培养系统，用于研究癌症干细胞生物学及其对化疗的反应。该方法可生成均一尺寸的球体，适用于高通量药物筛选和肿瘤发生性研究。

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我们感谢CRCL和CLB的影像学与Anipath病理学研究平台。我们衷心感谢里昂贝拉德中心（CLB）医院药房慷慨提供FOLFOX和FOLFIRI。我们还要感谢Brigitte Manship对本文手稿的审阅。本研究得到了法国医学研究基金会（FRM）（FRM研究团队2018，DEQ20181039598）和法国国家癌症研究所（Inca）（PLBIO19-289）的资助。MVG和LC获得了法国医学研究基金会（FRM）的支持，CF获得了抗癌研究基金会（ARC foundation）和里昂贝拉德中心的支持。

注意：所有试剂和材料的详细信息均列在材料表中。
1. 类球体形成
<ol>
	<li>类球体培养基
	<ol>
		<li>制备基础培养基，包含添加了4 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
		<li>在步骤1.1.1的基础培养基中加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Pen/Strep），配制DMEM完全培养基。</li>
		<li>在步骤1.1.1的基础培养基中加入2.5%基底膜基质、10% FBS和1% Pen/Strep，配制DMEM/基底膜基质培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体形成用培养板的准备
	<ol>
		<li>将基础培养基和DMEM/基底膜基质培养基在室温（RT）下预热约20分钟。</li>
		<li>向专用于类球体形成的24孔板的每个孔中加入500 µL抗黏附冲洗液，进行预处理。 
		注：这些板的每个孔包含1,200个微孔。</li>
		<li>使用带板适配器的摆动转子，在1,200 × g 条件下离心5分钟。 
		注：若仅使用一块板，需另准备一块装满水的标准板以平衡重量。</li>
		<li>用2 mL温热的基础培养基冲洗每个孔，并吸除孔中的培养基。</li>
		<li>在显微镜下观察培养板，确保微孔中的气泡已完全去除。若仍有气泡滞留，再次以1,200 × g 离心5分钟以消除气泡。</li>
		<li>重复步骤1.2.4–1.2.5的冲洗操作。</li>
		<li>向每个孔中加入1 mL温热的DMEM/基底膜基质培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体的生成
	<ol>
		<li>将Caco2细胞在含10% FBS和1% Pen/Strep的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的湿润环境中（以下简称37 °C/5% CO2）以二维单层方式培养。 
		注：细胞传代次数最多不超过80代。</li>
		<li>当细胞融合度达到80%时，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）（10 cm培养皿使用5 mL）洗涤细胞，加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（10 cm培养皿使用2 mL），于37 °C/5% CO2条件下孵育2–5分钟。</li>
		<li>在显微镜下检查细胞脱落情况，并通过每10 cm培养皿加入4 mL DMEM完全培养基中和胰蛋白酶活性。</li>
		<li>使用血细胞计数板计数细胞，确定细胞总数。</li>
		<li>将细胞悬液在1,200 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，并将沉淀重悬于适量体积的DMEM/基底膜基质培养基中。</li>
		<li>参考表1确定每孔所需细胞数量，以实现每个微孔中期望的细胞数。或者，根据以下公式计算24孔板每孔所需细胞数（每个孔含1,200个微孔）： 
		每孔所需细胞数 = 每微孔期望细胞数 × 1,200</li>
		<li>向每个孔中加入所需体积的细胞悬液，使最终体积为1 mL，并达到目标细胞数量。</li>
		<li>向每个孔中再加入1 mL DMEM/基底膜基质培养基，使每孔最终体积达到2 mL（参见步骤1.2.7）。 
		注：注意避免将气泡引入微孔中。</li>
		<li>立即在1,200 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉降至微孔中。如有需要，使用装满水的标准板平衡离心机。</li>
		<li>在显微镜下观察培养板，确认细胞在微孔中均匀分布。</li>
		<li>将培养板置于37 °C/5% CO2条件下孵育48小时，期间避免扰动。 
		注：根据原始方案21，尽管许多细胞系可在24小时内形成类球体，但部分细胞系需要更长的孵育时间。本方案中，48小时足以完成类球体形成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从微孔中收获类球体
	<ol>
		<li>将基础培养基和DMEM/基底膜基质培养基在室温下预热约20分钟。</li>
		<li>使用移液管从每个孔中移除一半培养基（1 mL）。</li>
		<li>将培养基重新加回到孔表面，以使类球体从微孔中脱离。 
		注：不要触碰或吹打类球体。</li>
		<li>将一个37 µm可逆滤网（或40 µm标准滤网）置于15 mL锥形管上方，用于收集类球体。 
		注：若使用40 µm标准滤网，请将其倒置放置。</li>
		<li>轻柔地吸取已脱离的类球体（来自步骤1.4.3），并将类球体悬液通过滤网。 
		注：类球体会留在滤膜上；单个细胞则随培养基穿过滤膜。</li>
		<li>使用移液管将1 mL温热的基础培养基均匀加至孔的整个表面，以脱离残留的类球体并将其回收至滤网上。</li>
		<li>重复步骤1.4.6的洗涤操作两次。</li>
		<li>在显微镜下观察培养板，确认所有类球体均已从微孔中移除。如有必要，重复洗涤步骤（步骤1.4.6–1.4.7）。</li>
		<li>将滤网翻转，放置于新的15 mL锥形管上，用DMEM/基底膜基质培养基冲洗滤网，收集类球体。 
		注：所收集的类球体可用于后续实验与分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体的长期培养
	<ol>
		<li>在基础培养基中配制1.5%琼脂糖溶液，并通过高压灭菌（标准程序）进行灭菌。</li>
		<li>在琼脂糖溶液仍保持温热且呈液态时，按照表2所述方法对标准培养板或培养皿的孔进行包被。 
		注：将培养皿/板在烘箱中预热有助于包被操作。包被后的培养皿/板可在无菌环境中、避光条件下室温保存最多10天。</li>
		<li>将收获的类球体（来自步骤1.4.9）接种至琼脂糖包被的培养板中，并根据培养板大小加入DMEM/基底膜基质培养基，达到最终体积。 
		注：为避免类球体聚集，应以22个类球体/cm2的最佳密度接种。注意包被层并非完全平整，边缘略高，中心形成轻微凹陷。若类球体数量过多，则更易相互黏附。</li>
		<li>将培养板置于37 °C/5% CO2条件下孵育，直至进行特定分析时回收类球体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用化疗药物处理类球体
	<ol>
		<li>将来自步骤1.5.4的类球体接种后培养2天。从第3天（D3）开始，使用临床上常用于治疗结直肠癌（CRC）患者的FOLFIRI（5-氟尿嘧啶，50 µg/mL；伊立替康，100 µg/mL；亚叶酸钙，25 µg/mL）或FOLFOX（5-氟尿嘧啶，50 µg/mL；奥沙利铂，10 µg/mL；亚叶酸钙，25 µg/mL）化疗方案进行处理22,23,24,25，或维持在未处理（NT）对照条件下。</li>
		<li>处理3天后，使用剪去尖端的移液枪头（1,000 µL枪头）收集类球体，确保每种处理条件至少包含三个重复。在1,000 × g 条件下离心3分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀用2%多聚甲醛（PFA）固定，用于组织学分析（见第3节），或用于RNA提取（见第4节）。</li>
		<li>为分析细胞死亡，将来自步骤1.6.1的类球体置于黑色培养板中，在DMEM/基底膜基质培养基中与一种核酸染料（1:5000稀释）共同孵育30分钟；该染料不能穿透活细胞膜，但可进入膜受损的死细胞26。使用酶标仪检测荧光积累情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 监测类球体生长
<ol>
	<li>使用倒置显微镜，在培养期间的不同时间点获取在不同条件下维持的类球体的代表性图像。</li>
	<li>使用适当的软件，通过测量每个类球体三个不同方向的代表性直径来分析图像。</li>
	<li>使用以下公式计算估计的球体体积。 
	<img alt="体积估算公式，4/3π(d1/2)(d2/2)(d3/2)，数学方程。" src="/files/ftp_upload/61783/61783eq1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"> 
	 
	注意：d1、d2 和 d3 为类球体的三个直径。</li>
</ol>
3. 免疫荧光（IF）和组织学染色
<ol>
	<li>固定与石蜡包埋
	<ol>
		<li>使用剪去尖端的移液器吸头，按照步骤 1.6.2 所述方法，在选定的时间点收集类球体，并在 2% 多聚甲醛（PFA）中于室温固定 30 分钟。 
		注意：或者，可在此步骤将样品在 4 °C 保存，以备后续使用。</li>
		<li>进行石蜡包埋时，用 1× PBS 洗涤类球体 3 次，然后重悬于 70% 乙醇中。完成石蜡包埋与切片后，进行苏木精-伊红（H&E）染色，用于组织学分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡切片的免疫标记 
	​注意：间接免疫染色应使用厚度为 5 μm 的切片。
	<ol>
		<li>将载玻片在 60 °C 孵育 2 小时，以熔化石蜡并改善脱蜡效果。</li>
		<li>用甲基环己烷洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗两次。</li>
		<li>用 1:1 的甲基环己烷与 100% 乙醇混合液洗涤载玻片 3 分钟。</li>
		<li>用 100% 乙醇洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗两次。 
		注意：步骤 3.2.2 至步骤 3.2.4 的所有操作均应在化学通风橱中进行。</li>
		<li>用 90% 乙醇洗涤载玻片 3 分钟。</li>
		<li>用 75% 乙醇洗涤载玻片 3 分钟。</li>
		<li>用 50% 乙醇洗涤载玻片 3 分钟。</li>
		<li>在自来水下冲洗载玻片。</li>
		<li>将载玻片在蒸馏水中再水化 5 分钟。</li>
		<li>配制 700 mL 的 0.01 M 枸橼酸缓冲液（pH 6.0），加入合适的容器中（宽：11.5 cm，长：17 cm，高：7 cm）；将载玻片完全浸入其中。将容器放入微波炉中，以 700 W 加热 9–10 分钟，待开始沸腾后，将功率降至 400–450 W，继续孵育 10 分钟。</li>
		<li>让载玻片在缓冲液中自然冷却至室温，约需 30–40 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用记号笔在组织切片周围画出圆圈，以形成液体屏障，防止试剂扩散。</li>
		<li>每张切片加入 50 µL 封闭缓冲液（含 10% 正常山羊血清、1% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.02% Triton X-100 的 PBS 溶液），于室温孵育至少 30 分钟。</li>
		<li>去除封闭缓冲液，每张切片加入 50 µL 用孵育缓冲液（含 1% 正常山羊血清、0.1% BSA 和 0.02% Triton X-100 的 PBS 溶液）稀释的一抗，于室温孵育 2 小时或 4 °C 过夜。</li>
		<li>去除一抗，用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>每张切片加入 50 µL 用孵育缓冲液稀释的荧光二抗，于室温孵育 1 小时。</li>
		<li>去除二抗，用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>每张切片加入 50 µL 含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂，然后盖上盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. RNA 提取、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和定量 RT-PCR（qRT-PCR）
<ol>
	<li>在不同时间点收集类球体，每个时间点至少设三个重复。以 1,000 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。 
	注意：沉淀可直接用于 RNA 提取，或保存于 -20 °C 以备后续使用。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用商用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA。</li>
	<li>使用商用试剂盒，按照制造商说明书将每份 RNA 样品中的 500 ng 反转录为互补 DNA（cDNA）。</li>
	<li>反转录完成后，取 1 µL cDNA 进行 PCR 扩增，使用位于不同外显子上的引物扩增看家基因。 
	注意：此步骤用于验证 RNA 样品中是否存在基因组 DNA 污染。本实验方案中使用了肽基脯氨酰异构酶 B（PPIB）引物。</li>
	<li>取先前稀释的 cDNA（用无 RNA 酶的双蒸水按 1:10 稀释）4 µL，使用目的基因特异性引物进行 qPCR 扩增。通过 ΔΔCt 法对各样品中的特定 mRNA 表达量进行定量，并以看家基因表达水平进行归一化处理。 
	注意：本实验方案中选用 β-肌动蛋白（ACTB）作为内参基因。本方案所用引物列于表 3中。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露

体外三维模型克服了二维肿瘤细胞培养的主要实验缺陷，因其在重现肿瘤典型特征（包括微环境和细胞异质性）方面表现出更高的可靠性。常用的类球体三维模型包括无支架模型（在低黏附条件下培养）和基于支架的模型（利用生物材料培养细胞）。这些方法各自存在不同缺点，例如依赖所用支架的性质，或产生的类球体在结构和大小上具有变异性。
本实验方案报告了利用无支架方法从结肠腺癌细胞系 Caco2 制备均一球状体的优化条件。这些球状体易于收获，并且与先前报道的一项研究41不同，它们能够成功生长，并可分析其在培养期间的生长特性。此外，采用这一新方法获得的球状体（a）具有活跃的增殖能力，（b）细胞死亡率极低，（c）可自组织形成球体内部的腔结构，以及（d）表现出组成细胞的分化潜能。鉴于该新方法的最终目标是用于肿瘤干细胞（CSC）生物学研究，因此分析了多种肿瘤干细胞标志物的表达。有趣的是，这些标志物的表达呈现动态变化模式，依赖于培养时间点，并定义了不同的肿瘤干细胞亚群。
尤为重要的是，通过本方案生成的类球体可用于分析...

结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症相关死亡的第二大原因1。CRC的发生是由于遗传突变和/或表观遗传改变逐步获得并累积的结果2,3，包括癌基因的激活以及肿瘤抑制基因的失活3,4。此外，非遗传因素（例如微环境）也可促进癌变过程，从而参与CRC的演化5。重要的是，CRC由不同的细胞群体组成，包括未分化的CSCs和表现出一定分化特征的大量肿瘤细胞，这些细胞构成了一种层级结构，类似于正常结肠隐窝上皮的组织结构6,7。
肿瘤干细胞（CSCs）被认为与肿瘤的发生8、维持与生长、转移能力以及对常规治疗的耐药性密切相关6,7。在肿瘤内部，包括CSCs在内的癌细胞在突变特征和表观遗传谱、形态学与表型差异、基因表达、代谢、增殖速率以及转移潜能等方面表现出高度的异质性和复杂性9。因此，为了更好地理解癌症生物学、肿瘤进展、治疗耐药性的获得机制，并将其转化为有效的治疗策略，建立能够模拟这种癌症异质性和层级结构的人源临床前模型显得尤为重要10,11。
体外二维癌细胞系已被长期使用，为肿瘤发生及治疗分子作用机制的研究提供了重要见解。然而，目前人们已普遍认识到，这类模型存在局限性，无法体现原始肿瘤中所具有的表型和遗传异质性12。此外，它们未能重现营养物质、氧气、pH梯度以及肿瘤微环境，而微环境对于包括肿瘤干细胞（CSCs）在内的多种细胞类型的维持尤为重要11,12。为了克服这些主要缺陷，研究人员已开发出多种三维模型，以在实验中更好地模拟癌症的复杂性和异质性。事实上，这些模型能够重现肿瘤的细胞异质性、细胞间相互作用以及空间结构，与体内观察到的情况相似12,13,14。目前广泛使用从新鲜肿瘤组织建立的原代肿瘤类器官以及由细胞系衍生的球状体模型15,16。
类球体可通过无支架或基于支架的方法进行培养，以促使细胞形成并生长为细胞聚集体。无支架方法基于在非黏附条件下培养细胞（例如悬滴法或超低黏附培养板），而基于支架的模型则依赖天然、合成或杂交的生物材料来培养细胞12,13,14。基于支架的类球体存在多种缺点，因为最终的类球体形成将取决于所用（生物）材料的性质和组成。尽管目前可用的无支架类球体方法不依赖于基质的性质，但所产生的类球体在结构和大小上存在差异17,18。
本研究旨在设计一种稳健且可重复的球形体三维培养系统，该系统由大小均一的Caco2结肠腺癌细胞组成，用于研究肿瘤干细胞（CSC）生物学特性。Caco2细胞因其能够随时间推移发生分化而具有特殊研究价值19,20，这强烈提示其具有类似干细胞的潜能。因此，球形体的长期培养揭示了存在不同类型的肿瘤干细胞亚群，且这些亚群对化疗表现出不同的反应。

<table><tbody><tr><td>37 &amp;micro;m 可逆滤网，大型&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27250</td><td>需与 50 mL 圆锥形离心管配合使用</td></tr><tr><td>5-氟尿嘧啶</td><td>由里昂贝拉德中心（CLB）药房赠送</td><td>-</td><td>储备液浓度为 5 mg/100 mL；终浓度为 50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 24 孔板</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34411</td><td>每孔含 1,200 个微孔，用于类球体的形成与生长</td></tr><tr><td>抗 Caspase3 - 兔源抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9661</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>抗 Musashi-1 (14H1) - 大鼠源抗体</td><td>eBioscience/Thermo Fisher</td><td>14-9896-82</td><td>稀释比例 1:500</td></tr><tr><td>防粘附冲洗液，100 mL</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD133 (13A4) - 大鼠源抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-133-82</td><td>稀释比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 CD44 - 兔源抗体</td><td>Abcam</td><td>ab157107</td><td>稀释比例 1:2000</td></tr><tr><td>抗 PCNA - 小鼠源抗体</td><td>Dako</td><td>M0879</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-catenin - 小鼠源抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7963</td><td>稀释比例 1:50</td></tr><tr><td>黑色多孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>一水柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar 仪器&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>微孔板读数仪</td></tr><tr><td>Dako 笔</td><td></td><td></td><td>用于在载玻片上标记圆形区域，以形成液体屏障的记号笔</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 568 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10037</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>含 Glutamax（L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluorogel 封片介质</td><td>Interchim</td><td>FP-DT094B</td><td></td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11077</td><td>稀释比例 1:1000</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td><td>类球体图像分析</td></tr><tr><td>伊立替康&amp;nbsp;</td><td>由 CLB 药房赠送</td><td>-</td><td>储备液浓度为 20 mg/mL；终浓度为 100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>iScript 逆转录酶&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸钙</td><td>由 CLB 药房赠送</td><td>-</td><td>储备液浓度为 50 mg/mL；终浓度为 25 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>Nucleospin RNA XS 试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740902 .250</td><td></td></tr><tr><td>奥沙利铂</td><td>由 CLB 药房赠送</td><td>-</td><td>储备液浓度为 100 mg/20 mL；终浓度为 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>SYBR qPCR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>核酸染料；稀释比例 1:5000</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05&amp;nbsp;%）</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss-Axiovert 显微镜</td><td></td><td></td><td>倒置显微镜，用于获取类球体图像</td></tr></tbody></table>

用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

结直肠癌具有异质性和层次性结构，其中包含一群负责肿瘤发生、维持以及耐药性的肿瘤干细胞（CSCs）。因此，深入了解CSC的特性并实现其特异性靶向，是实现有效治疗的前提。然而，目前适用于深入研究的合适临床前模型较为缺乏。尽管体外二维（2D）癌细胞系为肿瘤生物学提供了有价值的见解，但其无法模拟肿瘤在表型和遗传上的异质性。相比之下，三维（3D）模型能够更好地反映接近生理状态的肿瘤复杂性和细胞异质性。本研究旨在建立一种稳定且可重复的3D培养体系，用于研究CSC的生物学特性。本文所述方法介绍了从Caco2结肠腺癌细胞系建立和优化生成3D类球体的条件，该模型适用于长期培养。重要的是，在这些类球体中，细胞围绕类似腔样的结构排列，表现出不同的增殖模式，并含有表达多种标志物的CSCs。这些结果首次提供了概念验证，表明该3D方法适用于研究细胞异质性及CSC生物学特性，包括对化疗的反应。

由于类球体尺寸缺乏均一性是目前现有3D类球体培养系统的主要缺点之一13本研究旨在建立一种可靠且可重复的均一球状体培养方案。首先，为了确定理想的工作条件，使用专用培养板测试了不同数量的Caco2细胞，每个微孔/球状体的细胞接种量范围为50至2,000个细胞表1）。实际上，这些板中的每个孔包含1,200个微孔，可使每个孔内形成相同数量的球状体，更重要的是，可实现每个微孔中形成一个球状体21培养两天后，每球体含2,000个细胞的孔中细胞呈单层生长，而每球体含50个细胞的孔则形成较小且不均一的球体（图1A）。因此，这两种条件被排除在后续分析之外。为了建立长期培养，将类球体从微孔中收集，并接种于新制备的琼脂糖包被的非黏附性培养板中。随后在整个实验过程中通过测量体积变化来监测类球体的生长情况。为考虑其非球形形态，对每个类球体测量三个不同方向的直径，并代入体积计算公式进行计算<sup class="...

本方案介绍了一种新颖、稳定且可重复的培养体系，用于从Caco2结肠腺癌细胞生成并培养三维球状体。研究结果首次证明了该方法适用于癌症干细胞生物学研究，包括对化疗反应的研究。

结直肠癌具有异质性和层级结构，包含一群负责……的肿瘤干细胞（CSCs）

这种新的类球体培养方法可用于研究肿瘤发生能力，以分析不同类型的肿瘤干细胞群体的存在情况，也可很好地应用于高通量筛选新药。这是一种稳定且可重复的培养体系，能够生成大量大小均一的类球体。此外，这些类球体还可用于研究癌干细胞。该方法旨在研究慢性癌症生物学，但通过改变三维培养条件，也可轻松用于研究其他类型的癌症。操作过程中需注意培养基中是否存在气泡，成球期间避免过度移动培养板，并在将类球体收集至滤网时小心操作。首先，向24孔板的每个孔中加入500 µL抗黏附冲洗液进行预处理。离心几秒后，使用摆桶式转子离心板，并用2毫升温热的基础培养基冲洗每个孔。在显微镜下观察培养板，确保微孔中的气泡已完全去除。若未观察到气泡，在每个孔中加入1毫升温热的DMEM基底膜基质培养基之前，再次冲洗各孔。为诱导球体形成，将所需浓度的Caco-2细胞接种于含DMEM培养基（补充10% FBS和1%抗生素）的10厘米培养皿中，形成二维单层细胞。在37°C、5%二氧化碳的湿润环境中培养。当细胞达到80%融合度时，用5毫升PBS洗涤细胞，随后加入2毫升胰蛋白酶-EDTA，在37°C、5%二氧化碳条件下处理2至5分钟。待细胞脱落后，加入四毫升完全DMEM培养基以中和胰蛋白酶。计数后，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于适当体积的DMEM基底膜基质培养基中，使每毫升培养基中的细胞浓度达到所需浓度。向预包被的24孔板的每个孔中加入一毫升细胞悬液，随后向每个孔中加入一毫升DMEM基底膜基质培养基。接种后，立即离心培养板，并使用光学显微镜确认细胞已均匀分布于微孔中。随后将培养板放入细胞培养箱中孵育48小时，在此期间勿扰动细胞。孵育结束后，用移液管吸取每孔一半的上清液，轻轻吹打以将类球体从微孔中分离。当所有类球体均已脱离后，使用移液器小心地将每个孔中的3D培养物转移至置于15毫升锥形管上方的37微米可逆滤筛中。每次用1毫升预热的基础培养基洗涤各孔，共洗涤三次，以收集任何残留的类球体，并将这些额外的类球体加入滤筛中。最后一次洗涤后，在显微镜下检查培养板，确认所有类球体均已从微孔中移除。然后将滤网倒置在新的15毫升离心管上，用新鲜的DMEM基底膜基质培养基冲洗滤网底部，以将球体收集到离心管中。由500个细胞形成的球体随时间表现出最均一的体积增长。每球体500至600个细胞被确定为实现良好生长和低变异性的最佳细胞数量。添加基底膜基质可促进球体的生长和均一性。在长期培养中，细胞在第3天呈现为致密的多层结构，而在第10天则可明显观察到排列成单层的扁平细胞。有趣的是，从第5天开始，球状体内部出现管腔结构。此外，在第5天和第7天观察到增殖细胞核抗原阳性细胞数量明显增加，到第10天则有所减少。令人意外的是，活化的Caspase 3仅在第3天和第5天的极少数细胞中被检测到。尽管在每个时间点均观察到高水平的β-catenin表达，类球体向成骨细胞分化的潜能可通过其碱性磷酸酶及溶质载体家族2A5 mRNA的表达得以证实。此外，这些类球体表达典型癌症干细胞标志物，并对临床上常规用于结直肠癌患者的联合化疗方案具有响应性。因此，类球体由不同的细胞群体组成，可用于很好地分析细胞对刺激物（如折射剂）以及药物反应的特异性响应。

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癌症研究

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本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

学习使用Caco2结肠腺癌细胞建立三维球体培养系统，用于研究癌症干细胞生物学及其对化疗的反应。该方法可生成均一尺寸的球体，适用于高通量药物筛选和肿瘤发生性研究。

用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

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