通过质量光度法快速测定抗体抗原亲和力
February 8th, 2021
我们使用质量光度测量 （MP） 来描述抗原-抗体亲和力测量的单分子方法。基于MP的协议是快速，准确，使用非常少量的材料，不需要蛋白质修改。
抗体通常用于实验室技术，其治疗和诊断应用正在迅速扩大。快速准确的抗原-抗体结合特性对于这些应用至关重要。质量光度测量使用极少量的材料快速测量结合亲缘性。
无需贴标签或固定，也可以从同一实验中获得蛋白质寡聚化和纯度信息。该协议不仅可用于研究抗体，还可用于测量分子质量大于50千吨（50千吨）的蛋白质的强蛋白结合。首先使用软尖钳和洗瓶，用蒸馏水、乙醇、蒸馏水、异丙醇和蒸馏水从上到下依次冲洗 24 个 50 毫米的盖玻片。
上次洗涤后，用同一方向的清洁氮气流干燥盖玻片，以避免从钳子中转移污染。如证明，用蒸馏水和乙醇冲洗 24 由 24 毫米盖玻片，然后用干净的氮气流干燥。干燥后，将 24 到 24 毫米的盖玻片放在一块铝箔上，并在盖玻片上放置双面胶带。
然后从铝箔上切出 24 由 24 毫米盖玻片，然后轻轻地将铝箔压在 24 的 50 毫米盖玻片的工作侧。为了准备抗体抗原样本进行亲和力测量，通过0.22微米注射器过滤器过滤至少两毫升PBS，以去除灰尘颗粒和聚集物，并离心机感兴趣的抗体和抗原库存。测量抗体和抗原库存的 280 纳米紫外线吸收度，以确定其实际浓度，并在适当的抗原浓度范围内，以每样本 50 微升的最终体积制备抗体抗原混合物的滴定序列。
然后在室温下孵育抗原-抗体混合物约10分钟，使结合反应达到化学平衡。要通过质量光度测量评估抗体抗原亲和力，在仪器目标上涂抹一滴显微镜浸入油，然后将流室放在显微镜的舞台上。在流室通道的一端添加 10 微升过滤 PBS。
缓冲器将通过毛细管作用进入通道。在数据收集软件的对焦控制选项卡中，使用粗糙的阶段上下移动按钮进行初始调整，单击锐度以查看锐度信号读出。使用精细的上下调整按钮最大化锐度值，然后单击设置焦点和锁定焦点以激活焦点跟踪功能。
干净的幻灯片的图像应具有等于或低于 0.05% 负载 20 微升的第一个抗体抗原样品，如所示，用一小块印迹纸从另一端印迹液体。加载后立即单击记录以获取相当于 100 秒数据的适当帧数。在数据收集期结束时，输入数据的文件名，然后单击"确定"，然后对示例进行采样以保存文件。
要分析大量光度测量数据，请打开感兴趣的文件并单击分析。单击加载以加载校准功能，然后单击文件并保存结果以保存分析的数据。要获取样本中每个物种的相对浓度，请打开拟合的事件。
csv 文件，将 M 列中的数据复制到相应的绘图和分析软件中，并使用绘图统计直方图函数绘制分子质量分布图。双击直方图以打开绘图属性窗口，禁用自动装箱，并选择 2.5 千元大小的 bin 大小。若要创建 bin 中心和计数数据，请单击"应用并转到"。
要将直方图与高斯函数拟合，请选择条柱中心和计数列，然后单击分析峰值和基线多峰拟合菜单功能。双击以指示分布图上的近似峰值位置，然后单击打开 NL 拟合。检查 XC 峰中心的固定复选框，并设置其值，以自由抗体和单抗原-抗体复合物的预期分子质量。
检查共享选项的宽度参数，然后单击"拟合"。高斯分量的拟合峰值高度值表示样品中每个物种的相对浓度。然后使用方程计算每个物种的浓度分数从峰值高度值。
要使用电子表格程序计算平衡常数，请打开分离常数。xlsx 工作表。在此工作表中，可以修改行 1 到 10 中的黄色突出显示单元格值以执行均衡常量计算。
输入以纳米摩尔单位为单位的估计分离常量值到单元格 B1 和 B2 中。如果估计的分离常量值为不知道，请保持单元格 B1 和 B2 中的默认值不变。将纳米摩尔单位的总抗体和总抗原浓度输入细胞D2和E2，并在细胞F2、G2和H2中输入每个物种的计算分数值。执行滴定全局分析时，将适当的数据分数值添加到第 2 行到第 10 行中。在解算器参数窗口中，通过更改可变单元格框，为 设置的目标框选择单元格 B15，选择单元格 B1 到 B2。
选择"执行"选项的最小值按钮并选中"使无约束变量非负"复选框，然后选择 GRG 非线性作为求解方法，然后单击求解。最佳拟合分离常量值将显示在单元格 B1 和 B2 中。平方误差的最终总和将显示在单元格 B15 中。在这个具有代表性的实验中，在固定的25纳米摩尔浓度和0、7.5、15、30、60和120纳米摩尔人α-血栓浓度下，进行了抗人血栓抗体的滴定序列，以获得抗原抗体混合物和抗体样本的分子质量分布。
对高斯成分的最佳拟合峰值高度参数进行规范化，以获得物种浓度分数。然后，浓度分数值适合全球，以获得抗原-抗体结合亲和力。然后可以绘制自由抗体、单抗原抗体复合物和双抗原复合物的实验浓度分数和全球拟合结果。
为了获得准确的KD值，必须仔细选择蛋白质浓度，以填充所有反应物种。我们建议使用一系列抗原浓度制备滴定序列。拟合数据后，可以使用误差投影方法获取拟合误差，但最好重复实验并计算平均结合相关性值的标准偏差。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文介绍了一种使用质量光度法（MP）测量抗原-抗体亲和力的单分子方法。MP协议高效、准确，且不需要蛋白质修饰，只需最少的样本材料。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 免疫学
背景
- 抗体在各种实验室技术中至关重要。
- 对快速和精确的结合特性表征的需求正在增加。
- 质量光度法可以快速测量结合亲和力。
- 这种技术还可以提供有关蛋白质寡聚化和纯度的见解。
研究目的
- 开发一种快速准确的测量抗原-抗体相互作用的方法。
- 利用质量光度法研究蛋白质-蛋白质相互作用。
- 最小化样本需求并消除标记的需要。
使用的方法
- 质量光度法用于测量结合亲和力。
- 使用软头镊子和洗涤瓶进行样品制备。
- 用各种溶剂顺序冲洗盖玻片。
- 分析分子量大于50千道尔顿的蛋白质。
主要结果
- 基于MP的协议快速且准确。
- 它需要非常少量的材料。
- 不需要蛋白质修饰。
- 可以获得有关蛋白质寡聚化和纯度的信息。
结论
- 质量光度法是抗原-抗体亲和力测量的有价值工具。
- 该方法提高了研究蛋白质相互作用的效率。
- 它为治疗和诊断应用的研究开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid, label-free quantification of antibody-antigen affinity is essential for accelerating therapeutic antibody discovery and optimizing candidate selection. Mass photometry enables single-molecule resolution of binding events, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. This approach streamlines portfolio triage by delivering quantitative affinity and stoichiometry data with minimal sample requirements.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of antibody-antigen binding affinities without labeling artifacts.
- Provides quantitative stoichiometry and oligomeric state data for mechanistic de-risking.
- Supports rapid hypothesis testing and functional target validation with picomole-scale samples.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing high-affinity candidates early.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative affinity data for downstream screening workflows.
- Standardizes assay outputs by eliminating immobilization and label variability.
- Enables reproducible, scalable affinity measurements across antibody panels.
- Supports reliable compound evaluation by confirming binding specificity and purity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns affinity measurements with translational biomarker requirements when antigens are disease-relevant.
- Ensures continuity from discovery to preclinical validation by providing robust KD values.
- Reduces risk of late-stage attrition due to inaccurate binding characterization.
Pipeline & Workflow Integration
Mass photometry positions affinity determination at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid go/no-go decisions before resource-intensive preclinical work.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying binding events at single-molecule resolution.
- Screening: Provides reproducible, quantitative affinity outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Delivers molecular mass distributions, stoichiometry, and KD values for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant targets when sample purity and size criteria are met.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein-protein interaction studies above 50 kDa.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, standardized, and scalable affinity measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative binding data early in the pipeline.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-molecule data analysis and quantitative fitting.
- Needs access to mass photometry instrumentation and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and data interpretation.
- Best suited for proteins above 50 kDa and sub-micromolar affinities with high sample purity.
- Limited by reduced sensitivity for small antigens or low-affinity interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Flow Chamber Preparation and Assembly
2:02
Antibody-Antigen Samples Preparation
3:00
Mass Photometry Measurement
4:36
Mass Photometry Data Analysis
6:34
Equilibrium Constant Value Calculation
8:23
Results: Representative Antibody-Antigen Affinity
9:30
Conclusion
