Name: 将3D多细胞乳房球体直接生物打印到内皮网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学习将乳腺上皮细胞球体直接生物打印到预形成的内皮网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型。该方法可用于药物筛选和个性化精准医学研究，为体外组织建模提供高效平台。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：1R01HL140239-01，授予AMC）。我们感谢德雷塞尔大学细胞成像中心的支持。

1. 乳腺上皮细胞培养与检测培养基
<ol>
	<li>MCF10A 乳腺上皮细胞 
	注：该非致瘤性永生化乳腺上皮细胞系来源于患有纤维囊性疾病的患者43。该细胞不表达雌激素受体。
	<ol>
		<li>配制 20 μg/mL 表皮生长因子（EGF）：将 100 μg 冻干 EGF 溶解于 500 µL 无菌 dH2O 中，配制成 200 μg/mL EGF 溶液。取 500 μL 的 200 μg/mL EGF 溶液加入 4.5 mL 无菌 0.1% BSA（溶于 dH2O）中，得到 20 μg/mL EGF 储存液。将配制好的 20 μg/mL EGF 分装后于 -20 °C 保存，最长可保存 12 个月。</li>
		<li>配制 500 μg/mL 氢化可的松：将 1 mg 氢化可的松溶解于 1 mL 无水乙醇（200 证明度）中。向此溶液中加入 1 mL 无菌 DMEM F:12 培养基，配制成 500 μg/mL 氢化可的松储存液。将氢化可的松储存液分装后于 -80 °C 保存，最长可保存 12 个月。</li>
		<li>配制 10 μg/mL 霍乱毒素：将 1 mg 霍乱毒素冻干粉溶解于 1 mL 无菌 dH2O 中，配制成 1 mg/mL 霍乱毒素储存液。将霍乱毒素储存液分装后于 -80 °C 保存，最长可保存 12 个月。</li>
		<li>配制生长培养基：在 500 mL DMEM F:12 培养基中加入 500 µL EGF（20 μg/mL）、500 µL 氢化可的松（500 μg/mL）、5 μL 霍乱毒素（1 mg/mL）、500 µL 牛胰岛素（10 mg/mL）、10 mL 青霉素-链霉素溶液和 25 mL 马血清，终浓度分别为 20 ng/mL EGF、500 ng/mL 氢化可的松、10 ng/mL 霍乱毒素、10 ng/mL 牛胰岛素、2% v/v 青霉素-链霉素和 5% v/v 马血清。为应对生物打印过程中无菌性降低的问题，抗生素浓度提高至 2%；但可根据需要将抗生素浓度降低至 1%。</li>
		<li>配制检测培养基：在 500 mL DMEM F:12 培养基中加入 500 µL 氢化可的松（500 μg/mL）、5 μL 霍乱毒素（1 mg/mL）、500 µL 牛胰岛素（10 mg/mL）、10 mL 青霉素-链霉素溶液和 25 mL 马血清，终浓度分别为 500 ng/mL 氢化可的松、10 ng/mL 霍乱毒素、10 ng/mL 牛胰岛素、2% v/v 青霉素-链霉素和 5% v/v 马血清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MDA-MB-231 
	注：该三阴性（缺乏雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体 2）乳腺癌上皮细胞系来源于一位患有转移性乳腺腺癌女性患者的胸腔积液44。该细胞代表一种侵袭性强、分化程度低的乳腺癌类型。
	<ol>
		<li>配制生长培养基和检测培养基：在 500 mL DMEM 培养基中加入 50 mL 胎牛血清、10 mL 青霉素-链霉素溶液和 25 mL 马血清，终浓度分别为 10% v/v 胎牛血清、2% v/v 青霉素-链霉素和 5% v/v 马血清。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 乳腺上皮细胞培养
<ol>
	<li>在10 cm（P100）组织培养皿中加入10 mL MCF10A或MDA-MB-231生长培养基，接种500,000个MCF10A或MDA-MB-231细胞。MCF10A和MDA-MB-231细胞在48小时内达到&#62;90%融合度。</li>
	<li>为传代乳腺上皮细胞，首先用10 mL预热的PBS洗涤细胞。</li>
	<li>向培养皿中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，使乳腺上皮细胞脱落。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育20–25分钟。</li>
	<li>向消化后的细胞中加入5 mL MCF10A或MDA-MB-231生长培养基以中和胰蛋白酶。用移液器反复吹打细胞-培养基混合液，使细胞重悬并分散细胞团块。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在1,200 × g条件下离心3分钟。小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 mL MCF10A或MDA-MB-231生长培养基中。</li>
	<li>将1 mL细胞悬液接种至5个新的10 cm组织培养皿中，并加入MCF10A或MDA-MB-231生长培养基。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。细胞将在2–3天后再次达到可传代状态。MCF10A细胞可维持至第35代，之后会出现形态学变化。MDA-MB-231细胞可维持至第24代，之后会出现形态学变化。</li>
</ol>
3. 乳腺上皮球状体形成
<ol>
	<li>实验开始前，将200 μL吸头置于-20 °C冷冻30分钟。整个操作过程中，将生长因子减少型基质溶液（例如Matrigel）（10 mg/mL）置于冰上保存。</li>
	<li>使用预冷的200 μL吸头，缓慢吸取30 μL冰上保存的基质溶液，加入8孔培养板的每个孔中。从孔壁边缘开始，沿孔角拖动吸头，最后在孔中央加入一滴，以确保每个孔内形成均匀的涂层。此步骤应避免产生气泡，以保证基质溶液层均匀。每个孔均需使用新的吸头。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育15–20分钟，使基质溶液聚合。</li>
	<li>将经胰酶消化的MCF10A细胞用MCF10A检测培养基重悬至200,000个细胞/mL，或将经胰酶消化的MDA-MB-231细胞用MDA-MB-231生长培养基重悬至200,000个细胞/mL。</li>
	<li>若使用MCF10A细胞，需新鲜配制MCF10A球体生长培养基：向5 mL检测培养基中加入5 μL EGF（20 μg/mL）和100 μL基质溶液，终浓度为2%基质溶液。</li>
	<li>从培养箱中取出已预包被基质溶液的培养板。向每孔加入50 μL MCF10A或MDA-MB-231细胞悬液（含10,000个细胞）。若使用MCF10A细胞，向每孔加入450 μL MCF10A球体生长培养基；若使用MDA-MB-231细胞，则向每孔加入450 μL预先与2%基质溶液（9 μL）混合的MDA-MB-231生长培养基。立即放入37 °C、5% CO2培养箱中孵育。</li>
	<li>每4天更换一次培养基。使用200 μL吸头从每孔的一角小心吸出200 μL旧培养基。操作过程中，将培养板倾斜45°，以避免扰动球体结构。在孔的角落逐滴加入200 μL新鲜配制的MCF10A球体生长培养基或已与2%基质溶液混合的MDA-MB-231生长培养基，确保球体仍附着于基质层。仅更换约50%的培养基，以避免完全耗尽球体分泌的细胞因子。 
	注意：MCF10A乳腺上皮球体需要长达8天才能完成极化并形成中空结构；MDA-MB-231乳腺上皮球体形成需约5天，且无中空结构。</li>
</ol>
4. 内皮细胞网络形成
<ol>
	<li>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养
	<ol>
		<li>将一套内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）试剂盒中的全部组分（包括胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、抗坏血酸、表皮生长因子、肝素和两性霉素B-庆大霉素），与50 mL胎牛血清、5 mL青霉素-链霉素及5 mL 200 mM谷氨酰胺一同加入500 mL内皮基础培养基-2（EBM-2）中，配制成完全内皮细胞生长培养基（EGM-2）。</li>
		<li>在10 cm组织培养皿中加入10 mL EGM-2，接种500,000个内皮细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养，直至细胞融合度达到&#62;80%（约48小时）。</li>
		<li>传代时，用10 mL预温的PBS洗涤内皮细胞。向10 cm组织培养皿中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液以解离HUVEC。通过相差显微镜密切观察细胞状态。当细胞呈圆球状但仍附着于培养皿表面时，即为解离完成。</li>
		<li>小心吸除胰蛋白酶溶液。向培养皿中加入8 mL EGM-2，用移液器反复吹打整个皿面，使细胞脱离皿壁并悬浮于培养基中。</li>
		<li>或者，向已消化的细胞中加入5 mL EGM-2以中和胰蛋白酶活性。反复吹打细胞-培养基混合液，使细胞重悬并分散细胞团块。将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中，在1,200 × g条件下离心3分钟。小心吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL EGM-2中。</li>
		<li>取1 mL细胞悬液加入含9 mL EGM-2的10 cm组织培养皿中。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。每隔2天更换2/3的新鲜EGM-2培养基。细胞将在3–5天后达到再次传代的密度。HUVEC可维持培养至第8代，之后其形成网络的能力将显著下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮细胞（HUVEC）网络形成</li>
	<li>实验开始前，将200 μL枪头置于冷冻环境中30分钟。全程保持低生长因子基质胶溶液（10 mg/mL）置于冰上。</li>
	<li>使用预冷的200 μL枪头，缓慢吸取30 μL冰上保存的基质胶溶液，加入8孔细胞培养腔载玻片的每一孔中。从孔壁边缘开始，沿角落拖动枪头，并在孔中央滴加最后一滴，以确保各孔均匀覆盖。此步骤应避免产生气泡，以保证基质胶形成均匀涂层。每孔均需使用新的枪头。</li>
	<li>将培养腔载玻片置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育15–20分钟，使Matrigel聚合。
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2培养箱中，用10 μL红色细胞示踪剂（1:1000稀释）对10 cm培养皿中的HUVEC预染色30分钟。</li>
		<li>用10 mL预温的PBS洗涤内皮细胞。向10 cm组织培养皿中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟，使细胞完全解离。</li>
		<li>向培养皿中加入5 mL EGM-2以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至25 mL锥形离心管中，在1,200 × g条件下离心5分钟。吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL无血清EBM-2培养基中。</li>
		<li>使用台盼蓝染色法计数细胞，确定活细胞数量，并配制成浓度为1 × 106 个/mL的细胞悬液。</li>
		<li>向每孔加入100,000个HUVEC及200 μL无血清EBM-2培养基。若细胞数量过多，将形成单层细胞而非管状网络结构。</li>
		<li>将HUVEC置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。6小时后，通过相差显微镜观察HUVEC形成的网络结构。此时网络已形成，可用于与乳腺球状体共培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 在预先形成的 HUVEC 网络上进行乳腺上皮球体的生物打印
注意：生物制造过程应使用双喷嘴生物沉积系统。本实验所用系统配备三个运动臂，可实现材料沉积的微米级空间控制，同时还配有两台螺杆驱动电机，用于从10 mL注射器中沉积生物墨水。该系统应配备高效微粒空气过滤装置以及紫外灭菌功能，以在生物打印过程中维持无菌环境。打印开始前，需对生物打印机进行一小时的紫外灭菌处理。
<ol>
	<li>按照先前所述方法制备乳腺上皮球状体和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）网络。通过计数代表性相差显微镜图像中的球状体，估算每个孔中的乳腺上皮球状体数量。</li>
	<li>将1000 µL移液枪头末端剪去0.5 cm。使用剪裁后的移液枪头小心地将所有球状体从8孔腔室载玻片中转移至50 mL离心管中。用选定的生物墨水重悬球状体，浓度为100个球状体/100 µL。 
	注意：球状体浓度过高可能导致球状体聚集，从而妨碍观察球状体与内皮网络之间的相互作用。</li>
	<li>将球状体混合液通过70 µm细胞滤网，以去除任何过大或聚集的球状体。</li>
	<li>将汇集的球状体装入10 mL无菌注射器中，并用25号无菌针头封口。将注射器连接至生物沉积系统。</li>
	<li>吸除8孔腔室载玻片中HUVEC网络上的培养基。</li>
	<li>以1 mL/min的流速，将100 µL乳腺上皮球状体挤出至6个孔的HUVEC网络上。保留2个孔的HUVEC网络作为对照。</li>
	<li>若使用打印在HUVEC网络上的MCF10A球状体，则每孔加入400 µL MCF10A球状体生长培养基；若使用打印在HUVEC网络上的MDA-MB-231球状体，则每孔加入400 µL预先与2%基质溶液混合的MDA-MB-231生长培养基。HUVEC对照孔中应使用相应的球状体生长培养基。</li>
	<li>将共培养体系置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24–96小时，期间不更换培养基。共培养体系在原始培养基中可保持活性长达四天。</li>
</ol>
6. 共聚焦显微镜
<ol>
	<li>免疫荧光与 PBS-甘氨酸洗涤缓冲液的制备
	<ol>
		<li>通过在 500 mL 10x PBS 中加入 2.5 g 叠氮化钠、5 g 牛血清白蛋白、10 mL Triton X-100 和 2.05 mL Tween-20，配制免疫荧光（IF）缓冲液 10x 储存液。调节 pH 至 7.4。将储存液在 4 °C 保存，最长可达一年，以避免沉淀。</li>
		<li>通过将 50 mL 10x IF 缓冲液加入 450 mL 无菌去离子水中稀释，制备工作浓度 IF 缓冲液。工作液可在室温下保存最多一周。</li>
		<li>通过在 500 mL 10x PBS 中加入 37.5 g 甘氨酸，配制 10x PBS-甘氨酸缓冲液储存液。调节 pH 至 7.4。将储存液在 4 °C 保存，最长可达六个月，以避免沉淀。</li>
		<li>通过将 50 mL 10x PBS-甘氨酸缓冲液加入 450 mL 无菌去离子水中稀释，制备工作浓度 PBS-甘氨酸溶液。工作液在 4 °C 保存，最长可达一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记生物打印样品并进行共聚焦显微镜成像
	<ol>
		<li>吸除生物打印的三维共培养体系中的培养基，用预热的 PBS 洗涤 3 次。在室温下用 4% 多聚甲醛固定生物打印的三维共培养体系 1 小时。用 1x PBS-甘氨酸溶液避光洗涤样品 3 次，每次 20 分钟。</li>
		<li>用含 10% 山羊血清的 IF 缓冲液封闭样品 90 分钟（一抗封闭），随后用含 10% 山羊血清和 Afﬁnipure Fab 片段（1:100）的 IF 缓冲液再封闭 40 分钟（二抗封闭）。</li>
		<li>若使用 MCF10A 类球体，将样品在二抗封闭缓冲液中与整合素 α6 一抗（1:100）4 °C 孵育过夜，随后在室温避光条件下与 Alexa Fluor 488 二抗（1:200）和 Hoescht 33342（1:1000）孵育 1 小时。MCF10A 细胞系高表达整合素 α6，这对于显示类球体的极化状态和形态至关重要。</li>
		<li>若使用整合素 α6 表达水平较低的 MDA-MB-231 类球体，则在二抗封闭缓冲液中加入 Alexa Fluor 488 标记的鬼笔环肽（1:100）和 Hoescht 33342（1:1000），在室温避光条件下孵育 4 小时。鬼笔环肽可使肌动蛋白丝可视化，从而评估类球体的无定形和侵袭性形态。</li>
		<li>用 1x PBS-甘氨酸溶液洗涤样品 3 次，每次 20 分钟。</li>
		<li>使用厂家提供的工具取下腔室载玻片，准备封片。在每个孔中加入少量抗荧光淬灭封片液。将 22 mm × 60 mm 的盖玻片覆盖在每个腔室载玻片上，并用透明指甲油小心封边。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜以 Z 轴堆栈方式成像，约 10 层，步长为 5 μm。如需要，可在细胞成像软件中使用“扩展聚焦”（Extended Focus）命令将 Z 轴层面压缩为单个平面。</li>
		<li>使用 Image J 定量分析类球体与内皮网络的黏附情况。可通过分析插件，根据适当的颗粒大小和圆形度参数，对黏附的类球体数量进行定量。将黏附类球体数量归一化至图像面积。</li>
		<li>为确保可重复性，对共培养体系的 4 × 4 拼接图像进行类球体黏附数量的定量。若类球体数量显著低于其他实验结果，则应重复实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案首次实现了在三维结构中对类球体进行生物打印，以与同样具有三维结构的内皮细胞共培养。关键实验步骤包括乳腺上皮类球体和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）网络的初始形成。在对乳腺上皮类球体进行换液时必须格外小心，因为它们容易从基质溶液中被破坏。同样，在将乳腺上皮类球体通过移液从基质溶液中转移并混入网络结构时，也必须谨慎操作。HUVEC网络的接种密度不宜过高，培养时间不应超过16小时，否则将分别形成单层细胞或发生细胞死亡。最后，所有生物打印操作均应在37 °C的无菌环境中进行，以最大程度地维持细胞活性。
除了Matrigel外，乳腺上皮类球体还可使用多种生物墨水进行生物打印，包括海藻酸盐以及海藻酸盐-胶原蛋白混合物。我们已证明，在基于海藻酸盐的生物墨水中打印的类球体具有活性，并能维持其形态结构41。因此，尽管本文介绍的是基于基质溶液型生物墨水的生物打印方法，但其他成本更低、操作更简便的生物墨水同样可行。我们还成功使用了其他乳腺癌细胞系，包括MCF-7和基因修饰的MCF10A-NeuN细胞38<...

三维体外血管化肿瘤模型是研究癌症生长和转移机制的重要工具。特别是对于乳腺癌，乳腺上皮细胞在Matrigel中培养时可形成极化的球状结构，更接近体内乳腺腺泡的结构1,2,3,4,5,6,7,8。三维乳腺上皮细胞培养也影响细胞功能，与二维培养相比，三维培养在表皮生长因子（EGF）受体调控8,9、癌基因功能（如ErbB2）10、生长与凋亡信号传导11,12以及化疗耐药性13,14等方面均表现出差异。血管内皮细胞在三维与传统二维培养条件下对环境刺激的反应同样存在差异15,16,17,18。然而，目前对血管内皮细胞与乳腺上皮细胞相互作用的理解大多来源于使用条件培养基或Transwell小室的二维共培养系统，或两种细胞在空间上被物理分隔的三维模型19,20,21,22,23。这些共培养模型提供的生理学信息有限，因为三维培养环境和细胞间的直接接触对于血管内皮细胞与乳腺上皮细胞之间的相互作用至关重要24,25,26。
已采用多种技术制备三维癌症模型，包括悬滴法形成类球体、生物打印、磁力组装，以及在水凝胶中或工程化支架上进行培养5,27,28,29。近年来，研究人员构建了包含多种细胞类型并各自形成三维结构的三维肿瘤模型。例如，在一种“芯片上肿瘤”平台中，将癌细胞、内皮细胞和间质细胞混合于基质中，随后注入聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置的三个中央组织腔室。这些组织腔室两侧毗邻两个外侧通道，分别模拟动脉和小静脉。经过5至7天的培养后，内皮细胞形成微血管网络，癌细胞增殖并在血管结构附近形成小肿瘤。该平台随后被用于筛选药物及药物组合30。此外，已有其他“芯片上肿瘤”平台被开发用于研究转移过程，以及在特定机械刺激条件下（例如肺部的机械应变）的癌症类型31,32。然而，这些平台通常并未同时将血管系统和癌组织各自以三维结构形式整合其中。
生物制造在推动三维体外血管化肿瘤模型的发展方面展现出巨大潜力，因为它能够精确控制细胞的空间位置。尽管过去十年中生物打印技术不断发展，但专门针对肿瘤的研究仍较少33,34。例如，有研究利用明胶/海藻酸盐/纤维蛋白原水凝胶对HeLa细胞进行3D打印，构建了一种体外宫颈癌模型。肿瘤细胞以单细胞形式被生物打印后自发聚集成球状体，其增殖速率更高，基质金属蛋白酶表达增强，且相较于二维培养中的细胞具有更强的耐药性35。在这些研究以及许多其他研究中36,37，均是将离散的细胞悬液进行生物打印，随后为细胞培养提供必要的力学和生化信号，以促使细胞自组装形成三维结构。然而，细胞自组装可能需要数天甚至数周时间，可能依赖复杂的时空环境信号，或在两种细胞共培养时无法发生。例如，在二维共培养条件下，乳腺上皮细胞会诱导内皮细胞死亡；而离散的乳腺上皮细胞在海藻酸盐/明胶水凝胶中进行生物打印时无法形成三维球状体38。仅当被包裹在环形PDMS模具中时，离散的乳腺上皮细胞或癌细胞才能在基于海藻酸盐的生物墨水中形成球状体。在其他情况下，球状体是通过在超低吸附力的圆形孔板中悬浮液滴法形成，再混入基于海藻酸盐的生物墨水中39,40。
本方案中，我们介绍一种替代性的三维组织生物制造方法。该方法无需接种解离的细胞并等待其自组装形成三维结构，而是描述如何在&#160;血管管状网络上构建并进行三维肿瘤球体的生物打印，从而快速建立可用于实验的肿瘤共培养模型。肿瘤球体可在体外培养获得，也可来源于人体组织（类器官）。同样，血管管状结构既可通过体外培养生成，也可来源于脂肪组织中的微血管片段。生物墨水的选择范围广泛，可从生物学惰性的海藻酸盐到高度生物活性的Matrigel41。由于该三维肿瘤共培养模型可结合多种细胞结构和生物墨水构建，因此能够整合多种细胞类型、细胞外基质以及趋化因子梯度15,42。尽管目前该模型中的内皮网络尚不能实现灌注，但未来的改进版本可将此方法与微流控或“芯片上器官”系统相结合。将三维乳腺上皮球体生物打印至内皮网络上，可实现人类乳腺模型的快速生物制造，用于药物筛选和个体化精准医疗研究27。

<table><tbody><tr><td>37&amp;deg;C 培养箱，5% CO2 和 95% 湿度</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>3D 生物打印机</td><td>定制</td><td>无</td><td>用于生物打印</td></tr><tr><td>8 孔培养板</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>用于接种球状体</td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>生物打印用注射器针头</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 证明）</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>培养基成分的重悬</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&amp;prime;)2 片段山羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115006020</td><td>免疫荧光二级封闭抗体</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488（1:200）</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>免疫荧光二级抗体</td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A2153-500G</td><td>免疫荧光封闭剂</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>352350</td><td>去除大块或聚集的球状体</td></tr><tr><td>CellTracker&amp;trade; Red CMTPX 染料</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>C34552</td><td>HUVEC 管预染色</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>Hermle- Labnet, Edison, NJ</td><td>Z206A</td><td>用于细胞离心</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>收集和重悬细胞</td></tr><tr><td>Countess II-FL 细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>玻璃移液管（10 mL）</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>细胞重悬</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A 基础培养基</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 基础培养基</td></tr><tr><td>内皮基础培养基-2（EBM-2）</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC 基础培养基</td></tr><tr><td>内皮生长培养基-2（EGM-2）</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>配套 Bulletkit（含生长因子）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>标记 MDA-MB-231 球状体</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>HUVEC/MDA-MB-231 培养基添加剂</td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16210064</td><td>免疫荧光标记组分</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>G8898-500G</td><td>免疫荧光缓冲液组分</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>细胞核染色（免疫荧光）</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>人脐静脉内皮细胞（HUVECs）</td><td>Cell applications, San Diego, CA</td><td>200-05f</td><td>内皮细胞系</td></tr><tr><td>整合素 &amp;alpha;6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>免疫荧光球状体标记组分</td></tr><tr><td>活/死细胞检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>细胞活力检测（活/死细胞染色）</td></tr><tr><td>LSM 700 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>用于细胞成像</td></tr><tr><td>Matrigel — 生长因子减少型，10 mg/mL</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>球状体形成</td></tr><tr><td>MCF10A 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>乳腺细胞系</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 细胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>乳腺细胞系</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>158127-500G</td><td>细胞固定剂</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC 培养基添加剂</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>7001106</td><td>胰酶消化前细胞洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>10× 磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>AM9625</td><td>免疫荧光缓冲液组分</td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>P36934</td><td>免疫荧光封片介质</td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子（EGF）</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A / 检测培养基组分</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>S2002-25G</td><td>免疫荧光缓冲液组分</td></tr><tr><td>无菌注射器（10 mL）</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>生物打印过程</td></tr><tr><td>组织培养皿（10 cm）</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>单层细胞培养</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>T8787-250ML</td><td>免疫荧光缓冲液组分</td></tr><tr><td>台盼蓝 0.4%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>15250061</td><td>细胞计数添加剂</td></tr><tr><td>胰酶-EDTA 0.05%</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>25300054</td><td>细胞解离</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>85113</td><td>免疫荧光缓冲液组分</td></tr><tr><td>血管内皮生长因子（VEGF&lt;sub&gt;165&lt;/sub&gt;）</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>HUVEC 管形成添加剂</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 细胞成像软件</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z 轴图像压缩工具</td></tr></tbody></table>

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

生物打印正成为一种前景广阔的工具，可用于构建更准确模拟体内组织结构关键特征的三维人类癌症模型。在当前逐层挤出式生物打印技术中，单个细胞与复杂的时空信号一同被包裹在生物墨水中，以促进层次性组织的自组装。然而，这种生物制造技术依赖于细胞、生物墨水以及生化和生物物理信号之间的复杂相互作用。因此，自组装过程可能需要数天甚至数周时间，通常需要特定的生物墨水，且在涉及多种细胞类型时未必总能成功。为此，我们开发了一种新技术，可直接将预先形成的三维乳腺上皮球体在多种生物墨水中进行生物打印。打印后的预形成三维乳腺上皮球体在打印后仍保持其活性和极性结构。此外，我们将这些三维球体打印到血管内皮细胞网络上，构建了一种共培养模型。因此，这种新型生物打印技术相较于传统方法，能够以更低的成本和更高的灵活性快速构建更具生理相关性的三维人类乳腺模型。该多功能生物打印技术可进一步推广应用于其他组织的三维建模，并适用于更多类型的生物墨水。

乳腺上皮细胞在基质溶液上培养5-8天，并在含有2%基质溶液的培养基中培养后，应能自组织形成三维球状体。非致瘤性MCF10A乳腺上皮细胞球状体应呈圆形，具有中空的中心结构，整合素α6极性分布于球状体外缘（图1，插图显示中空中心）。高侵袭性的MDA-MB-231乳腺癌上皮细胞则形成不规则的球状体。球状体直径在约100–300 µm时可用于实验。当球状体过大并相互靠近时，会融合形成巨大的多细胞球状体（megaspheroids）。此外，若MDA-MB-231乳腺上皮细胞球状体在Matrigel培养体系中维持时间过长，可能出现细胞从球状体向外迁移的现象。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在稀疏、无血清培养条件下培养6-8小时后应自组织形成管状网络。样本将呈现多细胞节点，并由1-3个细胞并列组成的条状结构相互连接。可通过相差显微镜观察HUVEC网络，若使用Cell Tracker和Hoescht标记，则也可通过共聚焦显微镜观察（图2）。可使用ImageJ血管生成分析器对网络的...

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。

生物打印正作为一种前景广阔的工具出现，可用于构建更好地模拟体内组织关键特征的三维人类癌症模型……

本方案可实现预成型三维细胞结构（如乳腺上皮球状体）的打印，从而快速构建具有生物学相关性的模型及多种生物墨水。该技术的主要优势在于，能够将三维肿瘤球状体直接生物打印至血管网络上，所得模型几乎可立即用于各类实验研究。这些三维生物打印组织模型提供了一个快速的体外研究平台，未来可进一步拓展应用于个体化精准医疗。这种高度通用的3D生物打印方法可应用于其他血管系统相互作用重要的生理系统。在形成乳腺上皮球体时，首先将200微升移液器吸头冷冻30分钟，并将生长因子减少的基质溶液置于冰上。当吸头完全冻结后，每个孔使用一个全新的冰冻移液器吸头，将30微升冰冻基质溶液加入八孔腔室载玻片每个孔的侧壁及角落，最后在中心位置加入一滴，以确保形成均匀的包被层。所有孔包被完成后，将玻片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15至20分钟。在基质聚合的同时，将MCF 10A细胞以每毫升2×10⁵个细胞的浓度重悬于MCF 10A检测培养基中。孵育结束时，向每孔加入50微升细胞悬液和450微升MCF 10A类球体生长培养基，并立即将玻片放回孵箱中。每四天将培养 chamber 载玻片倾斜至 45 度角，使每孔中的上清液更换 200 微升，并补充新鲜的类球体生长培养基。对于 HUVEC 网络形成，按所示方法制备包被基质溶液的八孔 chamber 载玻片，并在细胞培养孵育箱中用 10 微升红色细胞示踪染料对 10 厘米培养皿中的 HUVEC 细胞进行 30 分钟预染色。孵育结束后，用 10 毫升预温的 PBS 洗涤内皮细胞，然后加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 进行处理。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟后，加入5毫升内皮细胞生长培养基2（endothelial growth medium 2）中和胰蛋白酶，并将细胞转移至25毫升锥形管中进行离心。用5毫升无血清内皮细胞基础培养基2（serum-free endothelial basal medium 2）重悬细胞沉淀，进行细胞计数，并将细胞稀释至浓度为1×10⁶个细胞/毫升。随后，向每孔加入1×10⁵个HUVECs，并将培养板放入细胞培养箱中孵育6小时。培养5至8天后，在代表性相差显微镜图像中计数每个孔中的类球体数量，并使用剪去末端0.5厘米的1,000微升移液枪头，小心地将八孔腔室载玻片中每个孔的所有类球体收集至一个50微升离心管中。将类球体重悬于适量的生物墨水中，浓度为每100微升墨水中含100个类球体，然后将合并的类球体装入一个10毫升无菌注射器中。为注射器安装一根25号无菌针头，并将注射器连接至生物沉积系统。从每孔HUVEC网络中移除培养基，并以每分钟1毫升类球体的流速，向HUVEC网络腔室载玻片的六个孔中各注入100微升乳腺上皮类球体。然后向每孔加入400微升MCF 10A类球体生长培养基，将共培养物置于细胞培养孵育箱中培养24至96小时。如图所示，经过5至8天的培养后，非致瘤性MCF 10A乳腺上皮类球体应呈圆形，具有中空的中心结构，且整合素α-6极化分布于类球体的外缘。高侵袭性的 MDA-MB-231 乳腺癌上皮细胞会形成不规则的球状体，若在 Matrigel 培养中维持时间过长，可能出现细胞从球状体迁移出来的现象。如图所示，在无血清稀疏培养 6 至 8 小时后，可通过相差显微镜或共聚焦显微镜观察 HUVEC 网络结构。将乳腺上皮球状体生物打印至 HUVEC 网络上后，球状体与网络结构均应至少在 24 小时内保持其原始形态。进行本实验方案时需要牢记的主要事项是在打印前小心操作类球体，以避免聚集。在完成生物打印和共培养后，可检测肿瘤细胞的活性、增殖、迁移及其与内皮网络之间的其他生化相互作用，这些检测可在有或无药物处理的条件下进行。我们已证明，药物测试最早可在共培养生物打印后两小时开始，并已利用抗癌药物紫杉醇对类球体添加至内皮网络的过程进行了测试。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

将3D多细胞乳房球体直接生物打印到内皮网络

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无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

学习将乳腺上皮细胞球体直接生物打印到预形成的内皮网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型。该方法可用于药物筛选和个性化精准医学研究，为体外组织建模提供高效平台。

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

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