Name: 肽聚糖的液相色谱质谱和生物信息学半定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 了解肽聚糖组分的液相色谱质谱与生物信息学半定量分析方法。该技术结合高效生物信息学算法，可同时处理多组数据文件，显著降低工作量并提高分析准确性，为研究细菌细胞壁结构与抗菌机制提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢Jennifer Geddes-McAlister博士和Anthony Clarke博士在完善本方案过程中所做的贡献。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）向C.M.K.（项目号：PJT 156111）提供的运营资助，以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）授予E.M.A.的亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金（CGS D）。插图使用BioRender.com制作。

<ol><li>Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+structure+and+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan structure and architecture.</a> FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).</li>
<li>Pazos, M., Peters, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan%5BTitle%5D)+AND+%22Sub-cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan.</a> Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).</li>
<li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+regulation+of+peptidoglycan+synthesis+to+bacterial+growth+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology.</a> Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).</li>
<li>Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+strategies+to+preserve+cell+wall+integrity+against+environmental+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2064(2018).</li>
<li>Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+pathogenic+staphylococci+so+lysozyme+resistant%3F+The+peptidoglycan+O-acetyltransferase+OatA+is+the+major+determinant+for+lysozyme+resistance+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).</li>
<li>Brott, A. S., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+O-acetylation+as+a+virulence+factor%3A+its+effect+on+lysozyme+in+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system.</a> Antibiotics. 8 (3), 94(2019).</li>
<li>Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+assay+for+D-Ala-D-Lac%3A+A+key+intermediate+for+vancomycin+resistance+in+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci.</a> Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).</li>
<li>Arthur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vivo+incorporation+of+D-lactate+into+peptidoglycan+precursors+of+vancomycin-resistant+Enterococci%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).</li>
<li>Mardarowicz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolierung+und+Charakterisierung+des+Murein-Sacculus+von+Brucella%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Naturforsdig%22%5BJournal%5D)">Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella.</a> Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+of+the+murein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The composition of the murein of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).</li>
<li>Glauner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+quantification+of+muropeptides+with+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).</li>
<li>Anderson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycomics+reveals+compositional+changes+in+peptidoglycan+between+biofilm-+and+planktonic-derived+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa.</a> The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).</li>
<li>van der Aart, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+the+peptidoglycan+composition+in+Streptomyces+coelicolor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290(2018).</li>
<li>Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+automated+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).</li>
<li>Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+for+the+enzymes+catalyzing+the+O-acetylation+of+bacterial+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides.</a> Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).</li>
<li>Clarke, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+analysis+of+peptidoglycan+by+high-performance+anion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography.</a> Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).</li>
<li>Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+sodium+dodecyl+sulfate+in+microliter-volume+biochemical+samples+by+visible+light+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy.</a> Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).</li>
<li>Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+fragmentation+of+Escherichia+coli+sacculi+by+sonication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication.</a> Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).</li>
<li>Benjamini, Y., Hochberg, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+false+discovery+rate%3A+A+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Statistical+Society%3A+Series+B+%28Methodological%29%22%5BJournal%5D)">Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).</li>
<li>Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+in+untargeted+metabolomics%3A+state+of+the+art+in+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23(2015).</li>
<li>Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+analysis+and+modeling+of+mass+spectrometry-based+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data.</a> Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1D+and+2D+annotation+enrichment%3A+a+statistical+method+integrating+quantitative+proteomics+with+complementary+high-throughput+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.</a> BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12(2012).</li>
<li>Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+biosynthesis+by+desleucyl-oritavancin%3A+A+quantitative+peptidoglycan+composition+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278(2017).</li>
<li>Glauner, B., Höltje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+pattern+of+the+murein+sacculus+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).</li>
<li>Espaillat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemometric+analysis+of+bacterial+peptidoglycan+reveals+atypical+modifications+that+empower+the+cell+wall+against+predatory+enzymes+and+fly+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).</li>
<li>Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+peptidoglycan+structural+parameters+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).</li>
<li>Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+structural+divergence+among+Thermus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Cell wall structural divergence among Thermus spp.</a> FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).</li>
<li>Torrens, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+peptidoglycans+from+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+recovered+from+chronic+and+acute+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 0868(2019).</li>
<li>Antignac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+structural+analysis+of+the+peptidoglycan+of+the+human+pathogen+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).</li>
<li>De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+composition+of+a+highly+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+strain.+The+role+of+penicillin+binding+protein+2A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muropeptides+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+their+role+as+elicitors+of+%CE%B2-lactam-antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+-+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance.</a> Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).</li>
<li>Schumann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidoglycan+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Peptidoglycan Structure.</a> Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).</li>
<li>Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+of+peptidoglycan+in+cell+walls+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种从细菌培养物中纯化肽聚糖、进行液相色谱-质谱（LC-MS）检测前处理，并利用生物信息学技术分析其组成的实验方法。本文重点针对革兰氏阴性菌，若需分析革兰氏阳性菌，需进行一些轻微的修改。
自20世纪60年代首次制备以来，肽聚糖片段的制备方法几乎未发生变化9,11,15。一旦获得纯化的囊状物（第1.2.18节），便使用来自Streptomyces&#160;globisporus的溶菌酶——溶壁酶（mutanolysin），将囊状物消化为单个的肽聚糖片段。溶壁酶通过断裂β-1,4-糖苷键，释放出由N-乙酰葡萄糖胺- N-乙酰胞壁酸二糖以及连接的肽侧链组成的单个肽聚糖片段，其中包含任何修饰或交联结构（图1）。
以往研究肽聚糖（PG）组成的方...

肽聚糖（PG）是细菌的典型特征，具有维持细胞形态的作用，同时为蛋白质及其他细胞组分提供结构支撑1,2聚糖骨架由交替的β-1,4-连接的 NN-乙酰胞壁酸（MurNAc）和 N乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）1,2每个MurNAc在D-乳酸残基上连接有一个短肽，该短肽可与相邻双糖连接的肽链发生交联图1A，B）。这种交联形成一种网状结构，包裹整个细胞，通常被称为囊状体（sacculus）。图1C）。在肽聚糖合成过程中，前体物质在细胞质中生成，随后由翻转酶转运通过细胞膜。这些前体物质接着由转糖基酶和转肽酶分别催化整合到成熟的肽聚糖中，形成糖苷键和肽键3然而，一旦肽聚糖组装完成，细菌会产生多种酶对其进行修饰和/或降解，以执行包括生长和分裂在内的多种细胞过程。此外，肽聚糖的多种修饰已被证明可赋予细菌特定于菌株、生长条件和环境胁迫的适应性，这些修饰与细胞信号传导、抗菌药物耐药性以及宿主免疫逃逸密切相关。4例如，一种常见的修饰是在MurNAc上添加一个C6乙酰基，这种修饰可通过限制宿主产生的溶菌酶对肽聚糖β-1,4糖苷键的接触，从而赋予抗性4,5,6。在 肠球菌，将肽侧链末端的ᴅ-Ala替换为ᴅ-Lac可增强对万古霉素这一抗菌药物的耐药性7,8.
自20世纪60年代首次描述以来，肽聚糖（PG）的分离与纯化通用流程基本保持不变9。首先通过SDS加热处理溶解细菌膜，随后利用酶法去除结合的蛋白质、糖脂以及残留的DNA。纯化后可获得完整的细胞壁囊状结构，再通过水解N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）与N-乙酰胞壁酸（MurNAc）之间的β-1,4糖苷键，将其降解为单独的组分。该降解过程产生含有完整结构修饰和/或交联结构的GlcNAc-MurNAc二糖单元，称为胞壁肽（muropeptides）（图1B）。
最初通过高效液相色谱分离（HPLC）对肽聚糖（PG）进行组分分析，以纯化各个肽聚糖单体，随后手动鉴定这些肽聚糖单体10,11。此后，该方法已被液相色谱-串联质谱法（LC-MS）所取代，后者提高了检测灵敏度，并减少了对每个单独肽聚糖单体进行纯化的手工工作量。然而，肽聚糖单体的手动鉴定过程依然耗时且复杂，仍是限制相关研究数量的主要因素。近年来，随着“组学”技术的兴起，自动化的LC-MS特征提取已成为一种强大工具，能够从大规模数据集中快速检测并鉴定复杂样品中的各个化合物。在特征被识别后，生物信息学软件通过差异分析对样本间的差异进行统计比较，识别出复杂数据集中的细微差异，并以图形方式呈现给用户。将特征提取软件应用于肽聚糖组成分析的研究才刚刚起步12,13,14，并开始与生物信息学分析相结合12。与蛋白质组学分析不同，后者可借助现成的蛋白质数据库预测肽段碎裂模式，从而实现完全自动化鉴定；目前尚无适用于肽聚糖组学的碎片化谱图数据库。然而，特征提取可结合已知和预测的结构数据库，用于预测肽聚糖单体的鉴定结果12。本文中，我们提供了一套详细的操作流程，介绍如何结合基于LC-MS的特征提取与肽聚糖单体数据库，实现肽聚糖组成的自动化鉴定及生物信息学差异分析（图2）。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18反相色谱柱 - AdvanceBio Peptide色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.7 &amp;micro;m）</td><td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS数据采集</td></tr><tr><td>加热套控制器，Optichem</td><td>Fisher</td><td>50-401-788</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>加热套，1000 mL半球形</td><td>Fisher</td><td>CG1000008</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C培养箱</td><td></td><td></td><td>用于囊泡纯化和质谱样品制备</td></tr><tr><td>李比希冷凝管，300 mm，24/40</td><td>Fisher</td><td>CG121805</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td></td><td>用于囊泡的冷冻干燥</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Fisher</td><td>90-691-18</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>质谱仪 Q-Tof 型号 UHD 6530</td><td>Agilent</td><td></td><td>LC-MS数据采集</td></tr><tr><td>微量离心过滤器，Nanosep MF 0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher</td><td>50-197-9573</td><td>质谱进样前样品净化</td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher</td><td>12-000-102</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>铁夹</td><td>Fisher</td><td>S02629</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>圆底烧瓶 - 1升Pyrex</td><td>Fisher</td><td>07-250-084</td><td>用于4% SDS煮沸</td></tr><tr><td>超声破碎仪型号120</td><td>Fisher</td><td>FB120</td><td>用于囊泡纯化</td></tr><tr><td>超声破碎仪 - 微量探头</td><td>Fisher</td><td>FB4422</td><td>用于囊泡纯化</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td></td><td>囊泡洗涤步骤</td></tr><tr><td>超速离心瓶，Ti45</td><td>Fisher</td><td>NC9691797</td><td>囊泡洗涤步骤</td></tr><tr><td>供水系统</td><td>城市供水</td><td></td><td>用于水冷式冷凝器</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemDraw</td><td>Cambridgesoft</td><td></td><td>用于肽聚糖片段断裂预测的分子编辑器</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>查看注释后的肽聚糖列表、丰度、同位素模式等</td></tr><tr><td>MassHunter Acquisition</td><td>Agilent</td><td></td><td>运行QTOF仪器</td></tr><tr><td>MassHunter Mass Profiler Professional</td><td>Agilent</td><td></td><td>生物信息学差异分析</td></tr><tr><td>MassHunter Personal Compound Database and Library Manager</td><td>Agilent</td><td></td><td>肽聚糖m/z质谱数据库</td></tr><tr><td>MassHunter Profinder</td><td>Agilent</td><td></td><td>递归特征提取</td></tr><tr><td>MassHunter Qualitative Analysis</td><td>Agilent</td><td></td><td>查看MS和MS/MS色谱图</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>绘图软件</td></tr><tr><td>Perseus</td><td>马克斯·普朗克生物化学研究所</td><td></td><td>一维注释</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Fisher</td><td>A637</td><td></td></tr><tr><td>淀粉酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6380</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher</td><td>BP168-1</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Fisher</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27001-500ML-R</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS调谐混合液 - HP0321</td><td>Agilent</td><td>G1969-85000</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>来自链球菌Streptomyces globisporus ATCC 21553的溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td></td></tr><tr><td>氮气（&gt;99%纯度）</td><td>Praxair</td><td>NI 5.0UH-T</td><td></td></tr><tr><td>磷酸</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>来自灰色链霉菌Streptomyces griseus的蛋白酶E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher</td><td>S0489</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452890</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>Stains-all</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9379</td><td></td></tr></tbody></table>

利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

肽聚糖是细菌细胞壁的重要组分，也是抗菌药物常见的细胞靶点。尽管所有细菌的肽聚糖结构在某些方面相对保守，但在革兰氏阳性菌与阴性菌之间以及不同物种之间仍存在显著差异。此外，已知在细菌物种内部，肽聚糖可因生长阶段和/或环境刺激而发生多种变异、修饰或适应性改变。这些变化形成了一种高度动态的结构，已知其参与多种细胞功能，包括生长/分裂、抗生素耐药以及逃避宿主免疫防御。为了理解肽聚糖内部的变异，必须将其整体结构分解为基本组成单元（称为肽聚糖单体，muropeptides），并评估其在细胞内的总体组成。肽聚糖组学（Peptidoglycomics）结合先进的质谱技术与高通量生物信息学数据分析，以精细解析肽聚糖的组成。以下实验方案描述了从细菌培养物中纯化肽聚糖、通过液相色谱—质谱联用仪获取肽聚糖单体的强度数据，以及利用生物信息学对肽聚糖组成进行差异分析的方法。

质谱仪检测灵敏度的提升，结合高性能的峰识别软件，显著增强了对复杂样品中物质组成进行精细分离、监测和分析的能力。利用这些技术进步，近期关于肽聚糖组成的研究所采用的自动化液相色谱-质谱（LC-MS）特征提取技术12,13,14,24，已逐步取代早期基于高效液相色谱（HPLC）的方法11,25,26,27,28,29,30<sup...

本方案涵盖了利用液相色谱-质谱联用技术，并结合高级特征提取和生物信息学分析软件，对肽聚糖组成进行的详细分析。

肽聚糖是细菌细胞壁的重要组分，也是抗菌药物常见的细胞作用靶点。尽管肽聚糖的某些方面……

肽聚糖组学采用先进的质谱技术，结合高性能的生物信息学数据分析，以精细解析肽聚糖的组成。利用生物信息学算法可对多个数据文件中的质谱数据进行同步分析、提取和比较，从而降低工作量并提高准确性。深入了解肽聚糖的多种变异与修饰，有助于理解细胞过程，包括细胞生长与分裂、宿主免疫逃逸以及抗菌耐药性。我们建议首先制备并分析少量样本，以熟悉本实验方案，并作为预实验项目来评估实验参数。由于质谱数据分析软件在描述特征和功能时所使用的定义常有差异，因此可视化演示将有助于用户在不同平台上应用本方案。对于肽聚糖囊泡的提取，需在4°C条件下，用约相当于原始培养体积1/10至1倍体积的20毫摩尔磷酸钠缓冲液重悬冷冻的细胞沉淀，然后将细胞悬液逐滴加入到含有20毫摩尔磷酸钠缓冲液的沸水中8% SDS溶液中，最终体积比为1:1。轻轻煮沸30分钟至3小时，同时搅拌，以确保膜完全解离。最终混合物应完全澄清，无残留细胞团块或黏性物质。当溶液冷却至室温后，通过超速离心收集囊状体，随后每次用约50毫升室温的20毫摩尔磷酸钠溶液洗涤5至7次，每次洗涤直至洗脱缓冲液中的SDS浓度降至约0.001%（通过比色染料法测定）。最后一次洗涤后，将囊泡重悬于5至10毫升室温的20毫摩尔磷酸钠溶液中，并在10毫摩尔硫酸镁存在下，加入终浓度为每毫升50微克的淀粉酶、DNase和RNase，在37摄氏度下振荡或摇摆孵育1小时。孵育结束后，在37摄氏度下加入终浓度为每毫升100微克的蛋白酶K消化过夜。超速离心后的次日早晨，将样品置于25毫升含2% SDS和20毫摩尔磷酸钠的溶液中，在蒸锅中煮沸1小时。孵育结束后，如图所示，用50毫升室温的双蒸水洗涤样品5至7次。当SDS浓度降至约0.001%时，将沉淀物重悬于足量双蒸水中以获得囊状物悬浮液，并冲洗容器。在–80 °C下过夜保存后，将冷冻样品进行冻干，然后将囊状物稀释至每毫升双蒸水中含10毫克肽聚糖的浓度。进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析时，在仪器软件中新建一个项目，并将相应的LC-MS QTOF数据文件分配给感兴趣的实验条件。运行数据处理向导的批量递归特征提取功能，并设置数据处理滤波器，使其与LC-MS条件和仪器参数相匹配，以准确识别组别并验证代表单个肽聚糖片段的质荷比峰。在特征提取结束后，审阅结果。如果某组中有大量特征未能成功比对，请调整递归过滤参数，以适当扩大或缩小检测窗口。然后将数据导出为化合物交换文件。进行差异谱图特征分析时，在系统软件中新建一个项目，并按照数据导入的说明进行操作。在数据分析过程中，选择差异分析的显著性水平和倍数变化，并将基线数据设置为所有数据文件中强度的中位数。分析完成后，查看生成的图形和统计分析结果，以鉴定在不同实验条件下丰度发生显著变化的肽聚糖片段。在项目导航器中，右键单击各项分析，选择导出选项，将特征详细信息保存为 tsv 文件。务必保存多次分析结果，以获取所有相关数据。在差异分析软件的结果解读部分，选择ID浏览器，添加预期的胞壁肽结构数据库，并选择与特征提取中所示相似的参数，从而为每个已鉴定的特征生成预测的胞壁肽注释。为手动确认预测的胞壁肽注释，需将串联质谱色谱图中的质荷比峰与已知胞壁肽结构所有可能碎片化的预测质荷比进行比对。使用分子编辑器绘制预测的肽聚糖单体结构，并利用质谱碎裂工具显示当各个化学键单独或组合断裂时，质谱碎片的质荷比。随后，将该肽聚糖单体结构所有可能的碎裂方式与串联质谱色谱图进行比对。为确认肽聚糖单体的注释，应在串联质谱色谱图中找到多个碎片的质荷比峰，且质荷比匹配窗口应尽可能小。为评估肽聚糖修饰的整体变化情况，需编辑具有显著高倍数变化的肽聚糖单体的 tsv 文件，为每种肽聚糖修饰添加单独的一列。在此列中填写每种标注的胞壁肽的标识，并将修改后的 tsv 文件上传至 Perseus。在“行注释”部分，单击“分类注释行”，并为每个实验参数添加数据文件。然后在“检验”部分，单击“双样本检验”以进行学生 t 检验，并单击“1D”以执行 1D 注释。质谱仪器检测灵敏度的提升，结合高性能峰识别软件，显著增强了对复杂样品中物质成分进行精细分离、监测和分析的能力。通过与已知和预测的胞壁肽结构数据库进行交叉比对，可将从质谱数据中提取的每个质荷比峰与特定的胞壁肽相对应。针对每个提取特征所获得的串联质谱碎片化色谱图，可与数据库中推定胞壁肽的碎片化谱图进行比对分析。火山图可用于突出显示在不同实验条件下丰度变化具有统计学显著性且变化幅度较大的肽聚糖片段。通过综合分析，可观察具有相同修饰的多个肽聚糖片段是否呈现出趋向于某一实验条件的规律，并对整个组别进行显著性评估。以这种方式追踪肽聚糖片段的修饰情况，有助于识别出受实验参数影响的特定酶活性。此外，偏离这一趋势的异常值可能揭示出具有特定特异性或生物学功能的酶活性。该方法通过检测聚合物的生化变化和生物学变异，从而深入了解体内作用于肽聚糖（PG）的酶活性。对肽聚糖组成进行细致验证分析，将有助于理解复杂的细胞结构，进而对许多关键生理过程提供重要启示。

semi-quantitative-analysis-peptidoglycan-liquid-chromatography-mass

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

肽聚糖的液相色谱质谱和生物信息学半定量分析

考虑到唾液取样在未来的临床应用，研制了一种棒棒糖状的超滤（LLUF）探针，以适应人口腔结构。通过NanoLC-LTQ质谱对未经消化的唾液进行直接分析，证明LLUF探针能够去除大分子蛋白和高丰度蛋白，从而使低丰度肽段更易于被检测到。...

使用棒棒糖式超滤探针采集人口腔内源性唾液肽组：简化并增强临床质谱中的肽段检测

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。...

通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP...

捕获化合物质谱法——一种鉴定新型环二鸟苷酸效应蛋白的强大工具

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

采用基于质谱的系统发育蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp.

基于质谱的系统蛋白质组学（MSPP）对空肠弯曲菌多氏亚种（Campylobacter jejuni ssp. doylei）分离株进行分型

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文描述了一种通过质谱分析进行序列鉴定的寡聚肽拟物的手动合成方案。...

寡聚肽模拟物的合成与质谱分析

本文描述了使用非离子型表面活性剂相分离方法富集细菌脂蛋白，可直接用于Toll样受体（TLR）检测或其他应用。此外，还详细介绍了制备N端胰蛋白酶消化脂肽的后续步骤，以通过质谱法进行结构表征。...

细菌脂蛋白的富集及N端脂肽的制备用于质谱法结构鉴定

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。...

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

了解肽聚糖组分的液相色谱质谱与生物信息学半定量分析方法。该技术结合高效生物信息学算法，可同时处理多组数据文件，显著降低工作量并提高分析准确性，为研究细菌细胞壁结构与抗菌机制提供重要工具。

利用液相色谱质谱法与生物信息学对肽聚糖进行半定量分析

探索更多视频