透射光辅助分离小鼠生精上皮周期特定阶段用于后续免疫染色分析

该方法有助于识别和分离特定发育阶段的曲细精管节段，从而研究精子发生过程中极为特定的步骤。曲细精管上皮周期的各个阶段可在新鲜未固定的管段中通过透射光模式进行辨认，因此我们能够仅选取感兴趣的阶段用于后续分析。尽管需要一定练习才能掌握基于透射光模式识别各阶段的技能，但本方案可确保您成功实现该目标。

演示该操作的是我实验室的博士生 Opeyemi Olotu。首先将一只至少8周龄的成年雄性小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对腹部腹侧进行消毒。使用无菌剪刀在腹部骨盆区域做V形切口，用无菌镊子牵拉附睾脂肪垫以定位睾丸。

使用剪刀解剖睾丸，将组织置于含有 PBS 的无菌 100 毫米培养皿中。用尖头剪刀在白膜（包裹睾丸的厚纤维层）上剪开一个小口，再用镊子撕开白膜并挤出曲细精管。将去被膜的曲细精管转移至新的培养皿中，并加入足量的无菌 PBS 以覆盖皿底。

然后，使用镊子轻轻将小管分开，注意不要损伤组织。进行小管解剖时，将培养皿用胶带固定在解剖显微镜的载物台上，并打开透射照明。使用精细的镊子小心移动小管束，以熟悉不同发育阶段的小管在光吸收和散射上的特征模式。

然后，使用尖端带钩的镊子提起目标小管，并用显微解剖剪剪取适当长度的片段。剪取特定发育阶段的小管片段后，用移液器吸取含有目标片段的10 µL PBS溶液，将片段转移至载玻片上。小心地将一块20 mm × 20 mm的盖玻片压在小管上，避免过度挤压细胞，随后将载玻片置于相差显微镜的载物台上。

将滤纸放在盖玻片边缘，以促进细胞铺展成单层，并使用40倍物镜确认细胞所处阶段。当细胞从曲细精管两端形成圆形单层后，将载玻片浸入液氮容器中10秒。用解剖刀将盖玻片从细胞上翻下，立即将载玻片放入90%乙醇中固定2至5分钟。

然后，将载玻片空气干燥，并在室温下保存数天。对于曲细精管的整体免疫染色，使用移液器将感兴趣的片段转移至预冷的15毫升圆底管中的冰上冷PBS中。待片段沉降后，小心移除PBS。

加入 10 毫升新鲜的预冷 PBS，通过倒置混匀。静置数分钟使小管沉淀，然后再次移除上清液，操作如图所示。当上清液完全移除后，在 4 摄氏度、20 至 30 转/分钟的条件下，用 5 毫升多聚甲醛固定小管 5 小时。

孵育结束后，让小管静置几分钟，然后在4摄氏度下用新鲜PBS洗涤样品三次，每次10分钟，同时旋转。最后一次洗涤后，使用1毫升移液器将10至20个固定的管状片段转移至一个2毫升圆底管中。待片段沉降后，弃去上清液，加入1毫升含2% BSA和10% FBS的PBSX，室温孵育1小时，转速为20至30转/分钟。

封闭孵育结束后，用1毫升PBSX洗涤样本。在用250微升一抗标记小管之前，将一抗用含1% BSA的PBSX稀释，于室温下以每分钟20至30转的速度孵育2小时。孵育结束后，用PBSX洗涤小管3次，随后在避光条件下，于室温下以每分钟20至30转的速度，加入250微升相应的二抗标记样本1小时。

孵育结束后，将小管洗涤三次，然后用少量上清液将小管倾注至显微镜载玻片上。接着，使用加样枪头将小管排列成线性条带，并吸去多余缓冲液。随后，加入1至2滴封片介质，再用盖玻片封片。

在透射照明下，第7至第8阶段呈现均匀的暗色，这是因为上皮顶端表面排列着大量完全凝缩的伸长型精子细胞。在精子释放期，当成熟精子被释放到管腔中后，由于上皮内缺乏凝缩的伸长型精子细胞，生精小管在第9至第10阶段显得非常浅淡。该浅染区域之后是弱染区，其斑点状外观源于具有凝缩染色质的伸长型精子细胞成束排列的结构特征。

这些细胞簇在随后的强亮点区域变得非常明显。精子细胞簇向位于基膜附近的塞尔托利细胞核迁移，这在透射光照下表现为第2至第5阶段小管的条纹状外观。细胞簇最终在第6阶段分散，正在浓缩并伸长的精子细胞移向管腔，并在第8阶段从上皮释放。

通过压片制备物的相差显微镜观察，可以准确验证小管节段的具体阶段。对已确定阶段的压片进行免疫染色，可用于研究目的蛋白在生精上皮中的表达与定位。生精小管整体染色通常用于研究位于生精上皮基底膜接触的细胞类型，这些细胞可位于小管侧或间质侧。

该方法还可用于研究位于上皮组织更深层的细胞或结构，例如血睾屏障或减数分裂后的生殖细胞。除了免疫染色外，我们还可将按周期分段的输精管组织用于多种下游分析，包括生化RNA和蛋白质检测、流式细胞术以及输精管的离体培养。由于该方法能够对精子发生过程进行极为详细的分析，因此为研究精子生成及雄性生育力所需的所有重要过程提供了一种有效的工具。