Name: NKG2D 利甘德表面检测的两种流细胞学方法，以区分干细胞与急性骨髓性白血病中的散装亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: 学习两种流式细胞术方法检测急性髓系白血病细胞表面的NKG2D配体，利用融合蛋白和抗体染色技术分离白血病干细胞与群体细胞，实现快速、高效的细胞表征与分析。

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本研究由瑞士国家科学基金会（179239）和苏黎世抗癌基金会资助，&#160;威尔海姆·桑德基金会（Wilhelm Sander Foundation）资助项目 CL（2019.042.1），诺华医学-生物学研究基金会（Novartis Foundation for medical-biological research）资助 C.L。此外，本项目还获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议 No. 765104 下的资助。我们感谢巴塞尔流式细胞术平台提供的支持。

患者样本的采集已获得巴塞尔大学医院和图宾根大学医院伦理审查委员会的批准。
1. NKG2D 融合蛋白的生物素标记
注意：此步骤使用生物素标记试剂盒（参见材料表）并按照制造商说明书进行操作。本方案的此步骤必须在染色前至少24小时完成。生物素化的NKG2D融合蛋白应保存在-20 °C。
<ol>
	<li>将生物素和NKG2D融合蛋白管在室温（RT）下解冻。 
	注意：如果细胞后续实验使用需要保持无菌（如注射到小鼠体内、集落形成单位实验等），则应在超净工作台内重组融合蛋白以避免污染。否则，所有步骤均可在实验台上进行。</li>
	<li>短暂离心50µg冻干的NKG2D融合蛋白。加入500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）溶解粉末，并使用P1000移液器充分混匀。</li>
	<li>取100 µL NKG2DL融合蛋白加入生物素管中，得到终浓度为100 µg/mL的储备液。</li>
	<li>使用P100移液器反复吹打，充分混匀溶液。</li>
	<li>将融合蛋白/生物素溶液在可控的室温条件下孵育24小时。此时融合蛋白已可使用。</li>
</ol>
2. 原代急性髓系白血病细胞的解冻
注意：每位患者约有 5,000,000 个冻存的白血病细胞，从液氮中取出后立即解冻并用于实验。白血病细胞的获取与冻存方法如前所述15。简言之，采集急性髓系白血病（AML）患者外周血样本，且原始细胞比例较高（单个核细胞中原始细胞比例&#62;90%），通过密度梯度离心法分离单个核细胞，随后在含 10% 二甲基亚砜（DMSO）的胎牛血清（FCS）中冻存。不同患者间细胞数量差异较大，取决于患者的白细胞浓度（范围：每毫升血液含 1,000,000 至 30,000,000 个白血病细胞）。
<ol>
	<li>使用水浴将含有10% FCS的RPMI培养基预热至37 °C。每管AML细胞（每管最多30,000,000个细胞，保存于1 mL FCS + 10% DMSO中），向一个15 mL离心管中加入10 mL预热的培养基。</li>
	<li>从液氮罐中取出含有原代AML细胞的冻存管，立即放入37 °C水浴中快速解冻。轻轻来回晃动冻存管，使管内物质逐渐融化，直至仅剩微小冰晶。</li>
	<li>立即将解冻后的细胞转移至含有预热培养基的离心管中，并用1 mL培养基冲洗冻存管内壁。</li>
	<li>以300 x g离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
	<li>用5 mL含有10% FCS的RPMI培养基重悬细胞，以300 x g离心10分钟。</li>
</ol>
3. 细胞计数
<ol>
	<li>用已知体积的含10% FCS的RPMI培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将少量细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中，用台盼蓝或任何其他可区分活细胞与死细胞的替代染料，按已知比例稀释。</li>
	<li>使用任意设备对细胞进行计数。</li>
	<li>以 300 × g 离心细胞 × g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。</li>
</ol>
4. 使用生物素标记的 NKG2D 融合蛋白对原代 AML 细胞进行染色
<ol>
	<li>通过向500 mL PBS中添加牛血清白蛋白（BSA）和乙二胺四乙酸（EDTA），使其终浓度分别为0.07 mM和2 mM，配制染色缓冲液。必要时调节pH至7.2–7.4。</li>
	<li>用染色缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞终浓度为 0.5 × 10⁷ 个细胞/毫升。7 细胞/毫升 
	注意：可选步骤，染色前可先用封闭剂（例如人 IgG（1&#181;g/ml），在室温下孵育30分钟，或使用FcR阻断剂。</li>
	<li>转移100 &#181;将100微升细胞悬液转移至细胞培养96孔圆底板中，以300 × g离心10分钟。 ×g 离心10分钟。弃去上清液，勿扰动沉淀。</li>
	<li>配制生物素标记的NKG2D融合蛋白预混液，使细胞重悬于终体积为50微升的溶液中 &#181;每孔1升，终浓度为10 &#181;微克/毫升 每孔</li>
	<li>使用100微升移液器加入在步骤4.4中配制的主混合液 &#181;L 移液管，用300微升多通道移液管重悬细胞沉淀 &#181;L型多通道移液器 
	注意：根据细胞数量按比例减少最终体积，以降低染色所需的融合蛋白用量。</li>
	<li>在室温下孵育细胞悬液25分钟，或在4℃下孵育50分钟 &#176;C.</li>
	<li>加入200微升洗涤缓冲液洗涤细胞 &#181;每孔300微升染色缓冲液 &#181;L 多通道移液器</li>
	<li>以300 × g离心该培养板 × g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。</li>
	<li>重复步骤 4.7 和 4.8。 
	注意：此处所述染色在细胞培养用96孔U型底板中进行，因此由于此类板孔体积容量较小，洗涤步骤需重复两次。染色也可在其他试管中进行，此时可使用较大体积，洗涤步骤仅需一次。</li>
	<li>使用链霉亲和素-PE（Streptavidin-PE）配制主混合液（见 表1 用于稀释），使细胞重悬于终体积为 50 微升的溶液中 &#181;L. 
	注意：根据您感兴趣的细胞类型添加相应的分选抗体，例如 CD33、CD34&#8230;急性髓系白血病（AML）的检测方法。</li>
	<li>使用100微升移液器加入在步骤4.10中配制的主混合液 &#181;L 移液管，并用 300 &#181;L型多通道移液器</li>
	<li>将细胞悬液在室温下孵育15分钟，或在4℃下孵育30分钟 &#176;避光。</li>
	<li>加入 200 微升洗涤缓冲液洗涤细胞 &#181;每孔加入300微升染色缓冲液 &#181;L型多通道移液器</li>
	<li>以300 × g离心该培养板 ×g 离心10分钟，弃上清液，勿扰动沉淀。</li>
	<li>重复步骤 4.13 和 4.14。</li>
	<li>配制含有7-AAD（7-氨基放线菌素D，1:1000）的染色缓冲液溶液，或使用其他可用于区分活细胞与死细胞的试剂。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液中 &#181;L 染色缓冲液 + 7-AAD（按步骤 4.16 配制），使用 300 &#181;L型多通道移液器</li>
	<li>使用流式细胞仪分析细胞。</li>
</ol>
5. 单一或混合的单一抗-NKG2DL 抗体染色
<ol>
	<li>使用与步骤 4.2 相同的细胞悬液。</li>
	<li>使用 300 µL 多通道移液器将 100 µL 细胞悬液转移至细胞培养 96 孔 U 型底板中，并在 300 x g 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>为每种一抗或混合抗体（稀释比例见 表 2）配制抗体主混合液，使细胞最终重悬于 50 µL 体积中。</li>
	<li>使用 100 µL 移液器加入步骤 5.3 中配制的主混合液，并用 300 µL 多通道移液器重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在室温下孵育 25 分钟。</li>
	<li>使用 300 µL 多通道移液器向每孔加入 200 µL 染色缓冲液，洗涤细胞。</li>
	<li>将细胞培养 96 孔 U 型底板在 300 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>重复步骤 5.6 和 5.7。</li>
	<li>通过加入二抗（稀释比例见 表 2）配制抗体主混合液，使每孔细胞最终重悬于 50 µL 体积中。</li>
	<li>使用 100 µL 移液器加入步骤 5.9 中配制的主混合液，并用 300 µL 多通道移液器重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在避光条件下于室温孵育 15 分钟，或于 4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用 300 µL 多通道移液器向每孔加入 200 µL 染色缓冲液进行洗涤。</li>
	<li>将细胞悬液在 300 x g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>重复步骤 5.12 和 5.13。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 200 µL 含有步骤 4.16 中配制的 7-AAD 的染色缓冲液中。</li>
	<li>按照步骤 6 所述，使用流式细胞仪分析细胞。</li>
</ol>
6. 数据采集
注意：务必每周对流式细胞仪进行质量控制，以确保激光器正常工作。对于本实验方案，每周使用相对荧光微球执行一次细胞仪追踪与校准（CTS）流程，以检测所有通道的激光性能。CTS 完成后，使用 8 峰微球记录 10,000 个事件作为内部对照。所有峰应在各自门控范围内位置一致，且彼此之间清晰分离。
<ol>
	<li>使用微珠或细胞创建补偿矩阵，以减去检测器之间的光谱重叠16。</li>
	<li>记录未染色细胞和单染微珠的10,000个事件。对于荧光减一（FMO）对照，记录50,000个事件；对于完全染色样本，记录最多100,000个事件。 
	注意：也可以在细胞上进行单染色样本操作。如果采用此方法，需确保细胞对目标标记物呈阳性信号。</li>
	<li>针对实验中使用的每种荧光染料，获取相应的单染细胞或微珠样本，以确定光谱重叠程度。使用流式细胞仪的补偿生成工具计算溢出值，并将补偿矩阵应用于所有检测样本。 
	注意：若使用微珠计算补偿，则不能使用二抗进行微珠补偿。根据补偿微珠的类型，二抗可能不适用于微珠补偿。</li>
	<li>对于融合蛋白的FMO对照和完全染色样本，首先根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）选择细胞。排除双联体后，根据7-AAD（PercP-Cy5.5）信号的阴性对细胞设门，以排除死细胞（见步骤5.15）。最终图显示活单细胞中CD34（Y轴）与NKG2DL（X轴）的表达情况。</li>
	<li>对于单个抗NKG2DL抗体，对样本采用相同策略，但需注意配体阳性信号位于Alexa Fluor 488通道，而非PE通道。</li>
	<li>根据FMO对照调整设门策略（见步骤6.4和6.5），参考表3中本实验应执行的适当FMO对照：在分析软件中，在阴性组分上绘制设门。在记录完全染色样本时，位于此前所设门上方的细胞即为该分析标记物的阳性细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了两种流式细胞术方法，可用于检测人原代急性髓系白血病（AML）细胞表面NKG2D配体（NKG2DL）的表达。我们证明，这两种检测方法均可与其他抗体染色（例如，检测CD34表达）联合使用。类似染色也可应用于其他原代细胞类型和细胞系。
我们最近发现，急性髓系白血病（AML）患者原始细胞表面缺乏NKG2D配体可富集白血病干细胞（LSC）14在急性髓系白血病（AML）中，NKG2DL阴性但非NKG2DL阳性的白血病亚群具有克隆形成能力 体内 白血病起始能力。未来的研究将揭示NKG2D配体表面表达的缺失是否也可作为富集其他癌症类型中干细胞的工具。
CD34 传统上被用于标记急性髓系白血病（AML）中的白血病干细胞（LSC），但 AML 是一种高度异质性的疾病，并非所有 AML 患者都表达 CD34（即 CD34 阴性 AML18）。我们先前已证明，缺乏 NKG2D 配体（NKG2DL）的表面表达可作为识别此类 CD3...

自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统的重要效应细胞，能够在无需预先抗原刺激的情况下识别并清除恶性细胞或处于应激状态的健康细胞（例如因病毒感染所致）1。该过程通过一系列复杂的活化受体——如自然细胞毒性受体（NCRs）、NKG2D和CD16——以及主要由杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）构成的抑制性受体进行严格调控2。KIRs与体细胞表面的人类白细胞抗原（HLA）I类分子结合，可实现自我识别并维持NK细胞的耐受性；相反，当自我识别缺失，且活化受体与其靶细胞配体的结合增强时，将触发细胞毒性颗粒的释放，从而介导NK细胞的细胞毒作用1。此外，NK细胞还可通过活化受体CD16与表达免疫球蛋白Fc段（FcR）的靶标结合，发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）2。除直接细胞毒性外，NK细胞还能通过释放细胞因子，连接先天免疫与适应性免疫系统3。
NKG2D 是一种主要的活化性受体，表达于自然杀伤细胞（NK）、NKT 细胞、γδ T 细胞以及初始型 CD8+ T 细胞4，使这些细胞毒性免疫细胞能够识别并裂解表达 NKG2D 配体（NKG2DL）的靶细胞。健康细胞通常不表达 NKG2DL，而恶性转化或病毒感染的细胞则会上调 NKG2DL 的表达，从而使其易于被免疫系统清除5。
人类NKG2D配体（NKG2DL）家族包含八种已知分子，其中包括两种主要组织相容性复合体I类链相关分子A和B（MICA和MICB6），以及巨细胞病毒UL16结合蛋白1–6（ULBP1-67）。NKG2DL的表达在转录、转录后以及翻译后水平均受到调控8。因此，尽管健康细胞表面通常无法检测到NKG2DL的表达，但在健康组织中已报道存在NKG2DL的mRNA9以及细胞内蛋白的表达。这种表达的功能意义及其表达模式差异背后的机制仍有待阐明10。
在癌细胞中，NKG2D配体（NKG2DL）表达的机制性调控是一个引人入胜的研究领域。已知参与细胞应激（例如热休克应激通路9）或DNA损伤相关通路（如共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM）和Rad3相关蛋白（ATR）通路11）的信号通路，以及病毒感染或细菌感染，均被直接证实与NKG2DL表达的诱导有关12。然而，即使NKG2DL的表面表达被有效诱导，其表达仍可能通过蛋白水解介导的脱落而再次丧失，这种机制与某些癌症中的免疫逃逸及不良临床预后相关13。
细胞表面NKG2D配体（NKG2DL）的缺失在急性髓系白血病（AML）患者中也可能发挥重要作用。在此类患者中，强化化疗通常可诱导缓解，但复发常源于白血病干细胞（LSC），这些细胞能够选择性地在化疗中存活并逃避免疫应答。正如我们近期研究所示，例如，LSC可通过抑制NKG2DL在细胞表面的表达，从而逃逸自然杀伤（NK）细胞的杀伤作用14。
相反，表面NKG2D配体（NKG2DL）表达的缺失可作为一种方法，用于鉴定并活体分离出白血病细胞群体中具有干细胞样特性的亚群。本文介绍了两种流式细胞术方法，可用于检测NKG2DL的表面表达，从而鉴定白血病中（可能也包括其他癌症中）NKG2DL阴性的干细胞：一种是针对所有配体的广谱性表面识别方法，另一种是使用针对已知单个NKG2DL蛋白的单一或混合抗体进行染色的方法。

<table><tbody><tr><td>7-氨基放线菌素D（7-AAD）</td><td>Invitrogen</td><td>A1310</td><td>活率染料</td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>Sarstedt</td><td>833925500</td><td>用于流式细胞仪的96孔板</td></tr><tr><td>APC小鼠抗人CD34</td><td>BD</td><td>555824</td><td>检测CD34的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_398614</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1391,0050</td><td>染色缓冲液组分</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Roth</td><td>8043.1</td><td>染色缓冲液组分</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>BioConcept</td><td>2-01F10-I</td><td>补充RPMI培养基的组分</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>BD</td><td>/</td><td>用于流式细胞术实验数据分析的软件</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21222</td><td>检测MICA和MICB一抗的二抗&lt;br/&gt; RRID: AB_1037853</td></tr><tr><td>人NKG2D Fc嵌合蛋白，CF</td><td>R&amp;D</td><td>1299-NK-050</td><td>可检测所有NKG2DL的融合蛋白&lt;br/&gt; RRID:</td></tr><tr><td>人ULBP-1抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF1380</td><td>检测ULBP1的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_354765</td></tr><tr><td>人ULBP-2/5/6抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF1298</td><td>检测ULBP2/5/6的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_354725</td></tr><tr><td>人ULBP-3抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF1517</td><td>检测ULBP3的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_354835</td></tr><tr><td>MICA多克隆抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-35346</td><td>检测MICA的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_2552656</td></tr><tr><td>MICB多克隆抗体</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-66698</td><td>检测MICB的抗体&lt;br/&gt; RRID: AB_2663413</td></tr><tr><td>一步式抗体生物素化试剂盒（1条，用于8次反应）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-385</td><td>用于NKG2DL融合蛋白的生物素化试剂盒</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>染色缓冲液组分</td></tr><tr><td>兔抗山羊IgG（H+L）Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11034</td><td>检测ULBP一抗的二抗&lt;br/&gt; RRID: AB_2576217</td></tr><tr><td>彩虹校准微粒（8峰），3.0 μm</td><td>Spherotech Inc.</td><td>RCP-30-20A</td><td>用于流式细胞仪维护的微珠</td></tr><tr><td>RPMI培养基</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>RayBright通用补偿微珠</td><td>Raybiotech</td><td>137-00013-100</td><td>用于建立补偿矩阵的微珠</td></tr><tr><td>链霉亲和素-R-藻红蛋白偶联物（SAPE）- 1 mg/mL</td><td>Invitrogen</td><td>S866</td><td>检测生物素化NKG2DL融合蛋白的第二步试剂</td></tr></tbody></table>

两种用于检测急性髓系白血病中nkg2d配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

Two Flow Cytometric Approaches of NKG2D Ligand Surface Detection to Distinguish Stem Cells from Bulk Subpopulations in Acute Myeloid Leukemia

在同一患者体内，NKG2D配体（NKG2DL）表面表达的缺失可用来区分具有干细胞特性的白血病亚群（即所谓的白血病干细胞，LSCs）与分化程度较高的白血病细胞亚群；后者虽携带相似的白血病特异性基因突变，但缺乏引发疾病的能力。NKG2DL是一类生物化学上高度多样化的MHC I类分子样自身分子。在稳态条件下，健康细胞通常不在细胞表面表达NKG2DL。相反，当细胞受到应激刺激（如癌基因转化或感染性刺激）时，会诱导这些配体的表达，从而通过表达NKG2D受体的免疫细胞（如自然杀伤细胞，NK细胞）介导的裂解作用，清除受损细胞。有趣的是，在LSC亚群中，NKG2DL的表面表达被选择性抑制，使这些细胞能够逃避免疫系统通过NKG2D途径的监视。本文展示了两种不同流式细胞术方法的并列分析，可用于检测肿瘤细胞表面NKG2DL的表达情况：一种是基于广谱配体识别的方法，另一种是使用多种针对单一配体的抗体进行染色的方法。这些方法可用于从NKG2DL阳性的非LSC群体中分离出存活的、NKG2DL阴性且可能具有癌症干细胞特性的细胞亚群。

本文介绍的两种方案均允许通过流式细胞术分析，利用已知的LSC标志物CD34，对急性髓系白血病干细胞（AML LSC）进行富集。17，结合使用泛配体识别法或采用针对各个配体的混合抗体进行染色，以检测NKG2DL的表面表达。在 图1我们结果显示，所分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性，但也存在阴性亚群，总共显示出四种不同的细胞群体。我们的数据展示了此类染色的典型设门策略，首先根据细胞的FSC和SSC特征选主要细胞群体。在后续分析中排除双联体和死细胞（图1A)。使用FMO对照调节门控，以确保正确鉴定阳性细胞（图1B).
在图1C中，我们展示了CD34阳性（APC，纵轴）与NKG2DL阳性（PE，横轴）细胞的荧光强度。CD34阳性的急性髓系白血病（AML）细胞表现出较低的NKG2DL表面表达水平（...

我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。

两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

在同一患者体内，NKG2D 配体（NKG2DL）表面表达的缺失可区分具有干细胞特性的白血病亚群……

本方案展示了在急性髓系白血病（AML）细胞表面检测NKG2D配体（NKG2DLs）的两种不同方法。该技术提供了一种快速、操作简便的染色方法，可用于检测所有已知及可能未知的NKG2D配体。此方法能够将白血病干细胞从大量AML细胞中分离出来，从而为进一步表征这些细胞提供了可能。首先将生物素和NKG2D融合蛋白管在室温下解冻。迅速离心NKG2D FC冻干粉，然后加入500微升PBS溶解冻干粉，并使用P-1000移液器充分混匀。取100微升NKG2DL融合蛋白加入生物素管中，使终浓度达到10微克/毫升，并用P-100移液器充分混匀溶液。复苏急性髓系白血病（AML）细胞时，从液氮储存罐中取出含有原代AML细胞的冻存管，立即放入37摄氏度水浴中。轻轻前后晃动试管，使管内物质逐渐融化，直至仅剩微小冰晶。迅速将已融化的细胞转移至含有培养基的试管中，并用1毫升培养基冲洗冻存管。将细胞在300 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用5毫升含10% FCS的RPMI培养基重悬细胞，并重复离心步骤。用染色缓冲液重悬细胞沉淀，调整最终浓度为每毫升0.5 × 10⁷个细胞。然后将100微升细胞悬液转移至96孔U型底细胞培养板中，以300 × g离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。配制生物素标记的NKG2D融合蛋白预混液，使细胞重悬于每孔终体积50微升的溶液中，NKG2D终浓度为每毫升10微克每孔。加入制备好的主混合液，并用200微升移液器重悬细胞沉淀。按照文稿中所述孵育并离心反应板。使用链霉亲和素PE配制主混合液，使细胞最终重悬于50微升的体积中。将预混液加入细胞中，并用300微升多通道移液器重悬细胞沉淀。离心微孔板并弃去上清液后，使用300微升多通道微量移液器将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液中，其中加入7-AAD。然后使用流式细胞仪分析细胞。所分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性，但也存在阴性亚群，共包含四种不同细胞群。典型的设门策略首先根据细胞的FSC和SSC特征选择主要细胞群，双联体细胞和死亡细胞将在后续分析中被排除。使用FMO对照调节设门，以确保正确鉴定阳性细胞。此处突出显示了CD34与NKG2DL阳性细胞的荧光强度。CD34阳性的急性髓系白血病（AML）细胞表现出较低的NKG2DL表面表达水平，表明NKG2DL的表达与干性缺失相关。三个原代急性髓系白血病（AML）样本在融合蛋白染色中分别显示19.8%、49.8%和89.4%的阳性事件，而在混合抗NKG2DL抗体染色中则分别为20.4%、50.4%和90.6%。另一方面，单个配体染色显示阳性事件比例最高可达92%，具体百分比因配体不同而有所差异。在尝试该方法时，快速解冻原代AML细胞非常关键，因为这些细胞较为脆弱，在此步骤中容易死亡。完成该实验方案后，可根据 NKG2DL 信号进行细胞分选，以进一步研究相关细胞群。

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癌症研究

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