两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群
2021年2月21日
我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。
本方案展示了在急性髓系白血病（AML）细胞表面检测NKG2D配体（NKG2DLs）的两种不同方法。该技术提供了一种快速、操作简便的染色方法，可用于检测所有已知及可能未知的NKG2D配体。此方法能够将白血病干细胞从大量AML细胞中分离出来，从而为进一步表征这些细胞提供了可能。
首先将生物素和NKG2D融合蛋白管在室温下解冻。迅速离心NKG2D FC冻干粉，然后加入500微升PBS溶解冻干粉，并使用P-1000移液器充分混匀。取100微升NKG2DL融合蛋白加入生物素管中，使终浓度达到10微克/毫升，并用P-100移液器充分混匀溶液。
复苏急性髓系白血病（AML）细胞时，从液氮储存罐中取出含有原代AML细胞的冻存管，立即放入37摄氏度水浴中。轻轻前后晃动试管，使管内物质逐渐融化，直至仅剩微小冰晶。迅速将已融化的细胞转移至含有培养基的试管中，并用1毫升培养基冲洗冻存管。
将细胞在300 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用5毫升含10% FCS的RPMI培养基重悬细胞，并重复离心步骤。用染色缓冲液重悬细胞沉淀，调整最终浓度为每毫升0.5 × 10⁷个细胞。
然后将100微升细胞悬液转移至96孔U型底细胞培养板中，以300 × g离心10分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。配制生物素标记的NKG2D融合蛋白预混液，使细胞重悬于每孔终体积50微升的溶液中，NKG2D终浓度为每毫升10微克每孔。
加入制备好的主混合液，并用200微升移液器重悬细胞沉淀。按照文稿中所述孵育并离心反应板。使用链霉亲和素PE配制主混合液，使细胞最终重悬于50微升的体积中。
将预混液加入细胞中，并用300微升多通道移液器重悬细胞沉淀。离心微孔板并弃去上清液后，使用300微升多通道微量移液器将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液中，其中加入7-AAD。然后使用流式细胞仪分析细胞。
所分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性，但也存在阴性亚群，共包含四种不同细胞群。典型的设门策略首先根据细胞的FSC和SSC特征选择主要细胞群，双联体细胞和死亡细胞将在后续分析中被排除。
使用FMO对照调节设门，以确保正确鉴定阳性细胞。此处突出显示了CD34与NKG2DL阳性细胞的荧光强度。CD34阳性的急性髓系白血病（AML）细胞表现出较低的NKG2DL表面表达水平，表明NKG2DL的表达与干性缺失相关。
三个原代急性髓系白血病（AML）样本在融合蛋白染色中分别显示19.8%、49.8%和89.4%的阳性事件，而在混合抗NKG2DL抗体染色中则分别为20.4%、50.4%和90.6%。另一方面，单个配体染色显示阳性事件比例最高可达92%，具体百分比因配体不同而有所差异。在尝试该方法时，快速解冻原代AML细胞非常关键，因为这些细胞较为脆弱，在此步骤中容易死亡。
完成该实验方案后，可根据 NKG2DL 信号进行细胞分选，以进一步研究相关细胞群。
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概述
本方案介绍了两种不同的染色方法，用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中的NKG2D配体（NKG2DLs）。这些技术可实现白血病干细胞与大量AML细胞的分离，以便进一步表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 肿瘤学
背景
- NKG2D 配体在癌症的免疫识别中具有重要作用。
- 急性髓系白血病（AML）在细胞表征方面存在挑战。
- 现有方法可能无法有效区分白血病干细胞。
- 新的染色方案可增强检测能力。
研究目的
- 开发用于检测NKG2D配体的高效染色方案。
- 促进白血病干细胞与大量急性髓系白血病细胞的分离。
- 改进急性髓系白血病样本的表征。
使用的方法
- 利用融合蛋白识别 NKG2D 配体。
- 应用多种抗 NKG2D 配体抗体。
- 解冻并重悬生物素和 NKG2D 融合蛋白。
- 混合溶液以达到染色所需的浓度。
主要结果
- 两种方案均可有效检测已知和未知的NKG2D配体。
- 可实现白血病干细胞与大量急性髓系白血病细胞的分离。
- 这些方法操作简便且快速。
- 能够更深入地表征急性髓系白血病细胞。
结论
- 新的染色方案可提高对 NKG2DLs 的检测能力。
- 这些方法有助于深入理解急性髓系白血病（AML）的生物学特性。
- 未来的研究可在此技术基础上进一步探索治疗策略。
常见问题
行业重要性概述
区分白血病干细胞与大量急性髓系白血病（AML）细胞群体仍是靶点验证和临床前模型开发中的关键挑战。分离具有干细胞特性的NKG2DL阴性亚群的能力，有助于降低治疗假设的机制性风险，并增强早期发现工作流程的预测可信度。该方法通过识别具有更高致瘤潜能的疾病相关体系，直接为项目筛选提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过基于NKG2DL表面表达分离白血病干细胞，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供一种快速、用户友好的方法，以区分具有干细胞特性的亚群与分化的急性髓系白血病（AML）细胞。
- 科学价值：通过对NKG2DL阴性组分中干细胞特性的功能验证，支持生物学风险降低。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的流式细胞术检测结果，用于比较不同配体特异性及广谱配体染色方法下NKG2D配体的表达水平。
- 操作价值：提供可重复、标准化的染色方案，适用于高通量筛选的样品制备。
- 科学价值：支持构建经过验证的生物体系，用于后续化合物筛选和靶点结合研究。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将NKG2DL抑制与LSCs中的免疫逃逸机制联系起来，促进转化生物标志物的对齐。
- 操作价值：通过实现对疾病起始细胞的分离，支持从发现到临床前验证的连续性。
- 科学价值：利用NKG2DL状态对具有不同肿瘤发生潜能的AML亚群进行分层，从而提高临床前模型的预测可信度。
流程与工作流整合
该方法通过实现机制明确的亚群分离，将靶点验证、先导化合物鉴定及临床前评价的发现过程整合为一体。
- 发现生物学：通过将NKG2DL阴性的白血病干细胞（LSCs）与NKG2DL阳性的大量急性髓系白血病（AML）细胞分离，支持假设验证和信号通路解析。
- 筛选：提供标准化、定量的表面检测方法，适用于基于流式细胞术的筛选平台，实现检测就绪。
- 分析：提供定量的因变量测量（阳性事件百分比、荧光强度），可用于比较不同染色方法及亚群频率。
- 转化研究：通过在疾病相关模型中分离LSCs以进行功能验证，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的干细胞富集能力，适用于多种AML样本，并可拓展至具有类似免疫逃逸机制的其他癌症类型。
运营与企业影响
- 科学价值：提高干细胞富集的预测可信度，降低白血病干细胞鉴定中的机制模糊性。
- 操作价值：在多个急性髓系白血病样本中实现NKG2D配体检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过早期去风险化改善靶点验证中的立项/终止决策，提升资本使用效率，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：基于白血病干细胞富集潜力和免疫逃逸表型，对靶点进行风险校正后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、细胞染色以及原代急性髓系白血病（AML）样本处理方面的专业知识。
- 依赖于流式细胞仪、离心设备以及生物素、NKG2D融合蛋白、链霉亲和素-PE和7-AAD等试剂的可及性。
- 为获得一致的结果，需要在不同团队之间对设门策略、荧光减一对照（FMO）和补偿设置进行标准化。
- 由于不同模型系统中NKG2D配体（NKG2DL）表达模式存在差异，应用该方法时需考虑适应性调整。
- 实际限制因素包括原代AML细胞在解冻过程中的脆弱性，需快速处理以维持细胞活性。
