Name: 非编码小RNA MicC有助于肠炎 沙门氏菌 外膜蛋白的毒力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 了解利用λ-Red介导的同源重组系统构建肠炎沙门氏菌micC基因缺失突变株的方法。该技术可高效失活染色体基因，为研究细菌基因功能及开发减毒疫苗候选株提供可靠工具。

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本研究由国家自然科学基金（编号：31972651 和 31101826）、江苏省高等教育科学基金（编号：14KJB230002）、兽医生物技术国家重点实验室（编号：SKLVBF201509）、扬州市自然科学基金（编号：YZ2014019）以及江苏省高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）提供资助。

所有实验均按照国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》的规定进行。扬州大学动物护理与使用委员会批准了所有涉及动物的实验及操作程序（SYXK2016-0020）。
1. 细菌菌株、质粒及培养条件
<ol>
	<li>使用表1中列出的细菌和质粒。</li>
	<li>在37 °C条件下，于LB液体培养基或LB琼脂平板中培养细菌，必要时加入50 µg/mL氨苄青霉素（Amp）。</li>
	<li>用于构建缺失突变株的含温度敏感型质粒的菌株需在30 °C条件下培养。</li>
</ol>
2. 克隆 micC 基因的 S. 肠炎沙门菌50336株
<ol>
	<li>根据 micC 基因在 S. Typhimurium 菌株 SL1344 中的上下游序列，设计引物 vmicC-F 和 vmicC-R，以 SE50336 基因组 DNA 为模板，通过 PCR 扩增包含 micC 基因的片段。</li>
	<li>将 5 µL 10x PCR 反应缓冲液、2 µL dNTP 混合物（2.5 mM）、各 1 µL 的 vmicC-F 和 vmicC-R 引物、5 µL 模板、1 µL Taq DNA 聚合酶以及 35 µL ddH2O 混合进行 PCR。</li>
	<li>采用以下 PCR 反应条件：94 ˚C 预变性 4 分钟；94 ˚C 变性 30 秒，53 ˚C 退火 1 分钟，72 ˚C 延伸 1 分钟，共 25 个循环；最后 72 ˚C 延伸 10 分钟。</li>
	<li>对 PCR 产物进行测序，获得 micC 基因序列。</li>
</ol>
3. 构建micC缺失突变株
注意： micC阴性突变体 沙门菌 肠炎沙门菌50336株是利用 &#955;-如前所述的Red介导的重组13,14所用引物序列见下表。 表 2.
<ol>
	<li>扩增含有氯霉素抗性盒同源片段的序列 micC 基因
	<ol>
		<li>设计引物 micC-F 和 micC-R，用于从质粒 pKD3 扩增氯霉素（Cm）抗性盒，其两端分别包含 5' 和 3' 端各 50 bp 的同源序列 micC 基因</li>
		<li>提取pKD3质粒作为PCR模板。</li>
		<li>混合5 &#181;10x PCR反应缓冲液L，2 &#181;dNTP混合物（2.5 mM）L，1 &#181;micC-F 和 micC-R 引物各 5 μL &#181;L 模板，1 &#181;Taq DNA聚合酶L和35 &#181;ddH₂O 的 L2O 作为 PCR 反应混合物一起混合</li>
		<li>使用以下PCR反应条件扩增Cm盒：94℃预变性 &#176;C，4 分钟；94 &#176;C，1 分钟，52 &#176;℃ 1分钟，72 &#176;C，1 分钟，10 个循环；94 &#176;℃ 1分钟，63 &#176;℃ 1分钟，72 &#176;C，1 分钟，共 25 个循环，然后在 72 ℃ 延伸 &#176;C，离心10分钟。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小。使用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收PCR产物，并通过分光光度计测定DNA浓度。 
		注意：PCR 必须进行两次。将第一次 PCR 产物按 1:200 的比例稀释后，用作第二次 PCR 的模板，以消除 pKD3 质粒对后续重组的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建1st 重组菌株 50336&#916;micC::cat
	<ol>
		<li>混合100 &#181;L 的 SE50336 感受态细胞中加入 5 &#181;pKD46 质粒均匀加入后，冰上孵育 30 分钟。将上述混合物在 42 ℃进行热激 &#176;C 下反应 90 秒，然后迅速转移至冰上孵育 2 分钟，以将 pKD46 质粒转化至 SE50336。通过在 30 °C 培养过夜筛选阳性菌落 &#176;C 在氨苄青霉素（Amp，50 &#181;g/mL）抗性平板。</li>
		<li>向 SE50336/pKD46 液体培养物中加入 30 mM L-阿拉伯糖，并在 30 °C 下诱导重组酶表达 &#176;37°C 摇菌培养 1 小时。然后制备感受态细胞。</li>
		<li>将100 ng纯化的PCR产物（步骤3.1）与40 &#181;将SE50336/pKD46感受态细胞加入电击杯（例如Bio-Rad）中。使用以下参数进行电击转化：电压1.8 kV，脉冲25 &#181;F 和抗性 200 &#937;.</li>
		<li>电转化后，将混合物转移至1 mL SOC培养基中，在150 rpm、30℃条件下振荡培养 &#176;C 下孵育 1 小时。然后将混合物涂布于含氯霉素（Cm，34 &#181;g/mL）抗性LB平板上，37℃培养 &#176;C过夜以筛选阳性菌落。</li>
		<li>培养上述阳性菌落于42 &#176;C孵育2小时。筛选对氨苄青霉素（Amp，50 &#181;微克/毫升）但对氯霉素（34 &#181;g/mL）于37℃ &#730;C过夜培养以获得第一个不含pKD46的重组菌株。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鉴定第一个重组菌株50336&#916;micC::目录::
	<ol>
		<li>提取50336&#916;micC以猫的基因组DNA作为PCR模板。PCR反应组分与步骤2.1相同。PCR反应条件与步骤2.1相同。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小，并对PCR产物进行测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建缺失突变株 50336ΔmicC&#916;micC
	<ol>
		<li>将100 ng质粒pCP20电转化至40 μL &#181;50336的L值&#916;micC::Cat 感受态细胞，电转参数为电压 1.8 kV，脉冲 25 &#181;F 和抗性 200 &#937;，分别在氨苄青霉素（Amp，50 &#181;微克/毫升）和氯霉素（34 &#181;g/mL）抗性平板，30℃培养 &#176;C.</li>
		<li>将上述阳性转化子转入无抗性的LB培养基中，于42℃过夜培养 &#176;C，然后在37℃的LB平板上分离单菌落 &#176;C. 选择对氨苄青霉素（Amp）和氯霉素（Cm）均敏感的菌落。该突变为 micC 缺失突变株SE50336&#916;micC.</li>
		<li>验证50336&#916;micC 通过PCR。
		<ol>
			<li>提取50336&#916;micC 以基因组DNA作为PCR模板。混合5 &#181;10x PCR反应缓冲液，2 μL &#181;dNTP混合物（2.5 mM）L，1 &#181;引物 vmicC-F 的 L 值，1 &#181;引物 vmicC-R 的 L 为 5 &#181;L 模板，1 &#181;Taq DNA聚合酶L和35 &#181;ddH₂O 的 L2O 一起进行 PCR。</li>
			<li>采用以下PCR反应条件：94℃预变性 &#176;C，持续4分钟；94 &#176;℃，30 秒，53 &#176;℃ 1分钟，72 &#730;C，1 分钟，共 25 个循环，72 ℃ 延伸 &#176;C，10 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 构建micC互补菌株
<ol>
	<li>设计带有 NheI 和 SalI 限制性酶切位点的引物 pBR-micC-F 和 pBR-micC-R。
	<ol>
		<li>使用 PCR 反应体系扩增包含侧翼序列的完整 micC 基因，反应体系包含 5 µL SE50336 基因组 DNA 作为模板，1 µL pBR-micC-F 和 1 µL pBR-micC-R 作为引物，5 µL 10x PCR 反应缓冲液，2 µL dNTP 混合液（2.5 mM），2 µL dNTP 混合液（2.5 mM）以及 35 µL ddH2O。</li>
		<li>采用以下 PCR 反应条件：94 °C 预变性 4 分钟；94 °C 变性 30 秒，52 °C 退火 50 秒，72 °C 延伸 1 分钟，共 25 个循环；最后 72 °C 延伸 10 分钟。纯化并回收 PCR 产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别用限制性内切酶 NheI 和 SalI 对 PCR 产物和质粒 pBR322 进行酶切，然后在 16 °C 下用 T4 DNA 连接酶过夜连接，获得重组质粒 pBR322-micC。</li>
	<li>将 pBR322-micC 转化至 SE50336ΔmicC 感受态细胞中，筛选阳性转化子以获得互补菌株 SE50336ΔmicC/pmicC。从互补菌株中提取质粒 pBR322-micC，并通过限制性酶切和测序验证其正确性。</li>
</ol>
5. RNA 提取与定量实时 PCR
<ol>
	<li>将SE50336、50336ΔmicC和50336ΔmicC/pmicC菌株在LB培养基中于24 °C、180 rpm振荡培养过夜，至OD600达到2.0。以13000 rpm离心2分钟收集菌体。</li>
	<li>使用TRIzol试剂提取总RNA。取50 µL提取的RNA，加入2 µL DNaseI和6 µL 10x缓冲液，于37 °C孵育30分钟以去除DNA。取1 µL RNA样品用微量分光光度计测定RNA浓度。</li>
	<li>cDNA合成
	<ol>
		<li>在20 µL逆转录反应体系中，使用1 µg总RNA进行cDNA合成（含4 µL 5x缓冲液、1 µL RT酶混合物、1 µL RT引物混合物、10 µL总RNA和4 µL ddH2O）。将上述反应体系于37 °C孵育15分钟，随后在85 °C孵育5秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据目标基因ompA、ompC和ompD的序列设计引物，使用逆转录PCR试剂盒进行逆转录PCR。PCR反应体系包含2.5 µL 10x PCR反应缓冲液、1 µL dNTP混合物（2.5 mM）、1 µL目标基因（ompA、ompC或ompD）引物、2.5 µL模板、0.5 µL Taq DNA聚合酶和17.5 µL ddH2O。
	<ol>
		<li>采用以下PCR反应条件：94 °C预变性4分钟；94 °C 30秒、60 °C 1分钟、72 °C 1分钟，共25个循环；最后72 °C延伸10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用SYBR Green RT-PCR试剂盒，在实时荧光定量PCR仪中进行三复孔实时PCR检测。
	<ol>
		<li>PCR反应体系如下：10 µL 2x SYBR缓冲液、0.4 µL正向引物和0.4 µL反向引物、0.4 µL RoxDye II、2 µL cDNA以及6.8 µL无RNase的H2O。</li>
		<li>PCR反应条件如下：95 °C预变性1分钟，1个循环；随后95 °C 5秒、60 °C 34秒，共40个循环。</li>
		<li>所有数据均以内参基因gyrA进行标准化，并采用2-ΔΔCT法进行定量分析15。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 毒力测定
<ol>
	<li>培养 SE50336、50336&#916;micC 和 50336&#916;micC/pmicC 在LB培养基中培养至对数生长后期（OD600 24小时时的2-3倍 &#730;C，离心收集菌体，并稀释至适当的CFU/mL-1 在无菌 PBS 中</li>
	<li>对于小鼠感染实验，将培养的菌株稀释至每200 μL含10 CFU &#181;L，102 CFU/200 &#181;L 和 103 CFU/200 &#181;L梯度重悬。每组使用五只6-8周龄Balb/c小鼠，按菌株通过皮下注射进行感染。对照组注射200 &#181;生理盐水 L</li>
	<li>对于鸡的感染实验，将上述三种菌株稀释至107 CFU/200 &#181;L, 108 CFU/200 &#181;L 和 109 CFU/200 &#181;L梯度重悬。每组菌株通过皮下注射感染二十只1日龄鸡。</li>
	<li>每日监测实验动物的发病症状和死亡情况。计算LD50 （半数致死量）感染后14天，方法如前所述16使用数据分析软件处理数据。</li>
	<li>在感染组中，采集 freshly dead 雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。分别称取上述组织各 0.5 g，在无菌条件下研磨。将研磨后的样品进行梯度稀释，涂布于 LB 平板，37 ℃ 培养 8–10 h。 &#730;C. 记录数量 沙门菌 菌株在雏鸡组织中的定植情况。</li>
</ol>

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<li>Papenfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SigmaE-dependent+small+RNAs+of+Salmonella+respond+to+membrane+stress+by+accelerating+global+omp+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay.</a> Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).</li>
<li>Udekwu, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq-dependent+regulation+of+OmpA+synthesis+is+mediated+by+an+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA.</a> Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+target+regulation+by+small+noncoding+RNAs+rewires+gene+expression+at+the+post-transcriptional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level.</a> Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).</li>
<li>Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboregulation+in+Escherichia+coli%3A+DsrA+RNA+acts+by+RNA%3ARNA+interactions+at+multiple+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).</li>
<li>Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+regulates+multiple+ABC+transporter+mRNAs+by+targeting+C%2FA-rich+elements+inside+and+upstream+of+ribosome-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites.</a> Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).</li>
<li>Boisset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+RNAIII+coordinately+represses+the+synthesis+of+virulence+factors+and+the+transcription+regulator+Rot+by+an+antisense+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism.</a> Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).</li>
<li>Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+RyhB+small+RNA+on+global+iron+use+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).</li>
<li>Papenfort, K., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+RNA+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Regulatory RNA in bacterial pathogens.</a> Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

S. 肠炎沙门菌是一种重要的兼性胞内病原体，可感染雏鸡，引起从肠炎到全身性感染乃至死亡的症状17,18此外， S. 鼠伤寒沙门菌在成年鸡中引起潜伏性感染，慢性带菌者会污染禽类产品，导致人类食源性感染19致病机制 S. Enteritidis 仍需进一步研究。迄今为止，已发现一些小RNA（sRNA），如 IsrJ、SroA 和 IsrM，能够影响 沙门氏菌 毒力20,21,22,23非编码小RNA micC 基因在多种肠杆菌中被鉴定出，例如 大肠杆菌, 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌， 沙门氏菌</...

非编码小RNA（sRNA）长度为40-400个核苷酸，通常不编码蛋白质，但可在细菌染色体上独立转录1,2,3。大多数sRNA编码位于基因编码区之间的基因间区（IGRs），通过碱基配对作用与靶标mRNA相互作用，从而在转录后水平调控靶基因的表达4,5。它们在物质代谢、外膜蛋白合成、群体感应以及毒力基因表达等过程中发挥重要的调控作用5。
MicC是一种含有109个核苷酸的小RNA转录本，存在于 大肠杆菌 和 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门菌，可调控多种外膜蛋白的表达，如OmpC、OmpD、OmpN、Omp35和Omp366,7,8,9MicC 通过抑制核糖体与 ompC 的结合来调控 OmpC 的表达 ompC mRNA 5'非翻译区的体外功能及其对Hfq RNA伴侣蛋白的功能依赖性 大肠杆菌6。在 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌中，MicC沉默 ompD 通过编码序列内（密码子23-26）长度不超过12个碱基对的RNA双链结构介导mRNA，并随后促使内切核酸酶依赖性的mRNA去稳定化7这一调控过程由分子伴侣蛋白 Hfq 协助完成10OmpC 是一种丰富的外膜蛋白，被认为在营养物质和毒素浓度较高的环境中具有重要作用&#160;高，例如在肠道中6OmpD孔蛋白是存在于外膜中含量最丰富的蛋白质 沙门氏菌 伤寒沙门氏菌，约占细胞总蛋白的1%11OmpD 参与对人巨噬细胞和肠上皮细胞的黏附12MicC 还可抑制 OmpC 和 OmpD 两种孔蛋白的表达。目前认为 MicC 可能参与调控细菌毒力。为探索 MicC 调控的新靶基因并研究其在毒力调控中的功能， micC，我们克隆了 micC 基因在 沙门氏菌 肠炎沙门菌（SE）菌株50336，并构建了突变株50336ΔmicC及其互补突变株50336ΔmicC/pmicC通过qRT-PCR筛选新的靶基因。通过小鼠和鸡的感染实验检测50336ΔmicC的毒力。

<table><tbody><tr><td>葡萄糖</td><td>桑根生物技术</td><td>A610219</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>DNA纯化试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP214</td><td>用于DNA纯化</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR01A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10017608</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>20032116</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610071</td><td>&amp;lambda;- 红色重组</td></tr><tr><td>小型质粒提取试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP106</td><td>质粒提取</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10019308</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>国药集团化学试剂</td><td>10002917</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>PrimeScript&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt;含gDNA Eraser的RT试剂盒&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR047</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR&lt;sup&gt;R&lt;/sup&gt; Premix Ex Taq II</td><td>TaKaRa</td><td>RR820</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>连接反应</td></tr><tr><td>TRIzol&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>用于肉汤制备</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>离心</td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>164-5050</td><td>电泳</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;电穿孔系统</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>用于细菌转化</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>BioTek</td><td>时期</td><td>吸光度检测</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统</td><td>应用生物系统公司</td><td>7500 系统</td><td>qRT-PCR</td></tr></tbody></table>

一种非编码小rna micc在膜外蛋白的毒力中发挥作用 沙门氏菌 enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

一种非编码小RNA（sRNA）是调控基因表达在转录后水平的新因子。其中一种已知的sRNA为MicC， 大肠杆菌 和 沙门氏菌 鼠伤寒沙门氏菌能够抑制外膜蛋白的表达。为进一步研究其调控功能 micC 在 沙门氏菌 肠炎沙门氏菌，我们克隆了 micC 基因在 沙门氏菌 肠炎沙门氏菌50336株，随后构建了突变株50336ΔmicC 由基于λ Red的重组系统及互补突变体50336ΔmicC/pmicC 携带表达重组质粒 pBR322 的 micCqRT-PCR结果表明，转录水平 ompD in 50336ΔmicC 比野生型菌株高出1.3倍，而转录水平 ompA 和 ompC in 50336ΔmicC 分别是野生型菌株的2.2倍和3倍。这些结果表明 micC 抑制表达 ompA 和 ompC在随后的研究中，通过感染6周龄Balb/c小鼠和1日龄鸡来检测50336ΔmicC的致病性。结果显示，其LD50 野生型菌株50336及其突变株50336ΔmicC 和 50336ΔmicC/pmicC 6周龄Balb/c小鼠的LD50分别为12.59 CFU、5.01 CFU和19.95 CFU。50 1日龄雏鸡菌株的剂量为1.13 × 109 CFU，1.55 × 108 CFU，以及 2.54 x 108 CFU，分别。这表明缺失 micC 毒力增强的 S. 通过调控外膜蛋白的表达来抑制小鼠和鸡体内的肠炎沙门氏菌。

突变株50336的构建&#916;micC 和互补菌株 50336&#916;micC /pmicC 
的 micC 基因克隆结果表明，该基因由109 bp组成，与其序列同源性为100% S. 鼠伤寒沙门氏菌。根据序列数据，缺失突变体50336&#916;micC 和互补突变株 50336&#916;micC/pmicC 成功构建。具体而言，测序结果表明，一个1.1 kb的Cm抗性盒被扩增并用于构建1st 重组。第1st 重组 50336&#916;micC::猫 通过使用引物 vmicC-F 和 vmicC-R 进行 PCR 验证，预期在含有 Cm 插入的菌株中产生约 1200 bp 的 PC...

采用λ-Red介导的重组系统构建了一个小非编码RNA micC的缺失突变体。

一种非编码小RNA MicC在膜外蛋白的毒力中发挥作用 沙门氏菌 Enteritidis

一种非编码小RNA（sRNA）是调控基因表达在转录后水平的新因子。一种名为MicC的sRNA，已在大肠杆菌（Escherichia ...

该方案可用于失活染色体基因，以分离突变体用于基因功能及细菌研究。该方法使同源重组过程变得简单、快速且高效。利用此技术，可删除病原菌中与毒力相关的基因，获得减毒突变体，作为减毒疫苗的候选株。首先扩增含有 micC 基因血源性片段的氯霉素抗性盒。设计上下游引物，以质粒 PKD3 为模板扩增氯霉素抗性盒，引物应包含 micC 基因 5' 端和 3' 端各 50 个碱基的同源延伸序列。按照文本稿件中所述方法进行 PCR，以 PKD3 质粒为模板扩增氯霉素抗性盒。通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。然后使用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物，并通过分光光度法测定DNA的浓度。进行第二次PCR反应，以消除PKD3质粒进一步重组可能带来的干扰。将第一轮PCR产物按1比200的比例稀释，并用作第二轮PCR的模板。为构建第一个重组菌株50336 delta micC dot cat，将100 µL SE 50336感受态细胞与5 µL PKD 46质粒混合，在冰上孵育30分钟。在42 °C下热激90秒，然后迅速转移回冰上冷却2分钟，以将质粒转化入细胞中。在含有氨苄青霉素的平板上将细胞于30摄氏度培养过夜，筛选呈阳性的菌落。次日，在SE 50336 PKD 46液体培养物中加入30毫升L-阿拉伯糖，并在30摄氏度下振荡孵育1小时，以诱导重组酶的表达。将100纳克纯化的PCR产物与40微升SE 50336 PKD 46感受态细胞混合于电击杯中。然后进行电击转化。电转化后，将混合物转移至1 mL SOC培养基中，在30°C、150 rpm条件下于摇床培养箱中培养1小时。将混合物涂布于含氯霉素的LB平板上，37°C过夜培养，以筛选阳性菌落。将阳性菌落在 42 摄氏度下培养两小时。然后在 37 摄氏度下过夜筛选菌落对氨苄青霉素的敏感性及对氯霉素的抗性，以获得首个不含 PKD46 的重组菌株。使用 PCR 和琼脂糖凝胶电泳提取 50336 ΔmicC·cat 基因组 DNA 后，将 100 纳克质粒 PCP20 电转化至 40 微升 50336 ΔmicC·cat 感受态细胞中。在30摄氏度下，于含有氨苄青霉素和氯霉素的抗性平板上筛选阳性转化子。将阳性转化子转移至无抗性的LB液体培养基中，于42摄氏度过夜培养。随后在37摄氏度的LB平板上分离单菌落。选择对氨苄青霉素和氯霉素均敏感的菌落。该突变体为 micC 缺失突变体 SE 50336 ΔmicC。按照文稿中所述方法进行 PCR 验证 50336 ΔmicC。本实验方案用于在互补突变株 50336 Delta micC, pmicC 中构建缺失突变株 50336 Delta micC。通过 PCR 验证第一个重组子 50336 Delta micC dot cat，预期扩增产物条带大小约为 1200 个碱基对（含氯霉素插入片段），而野生型菌株的扩增产物为 279 个碱基对。在第二次重组过程中，利用 PCP 20 消除了氯霉素抗性盒。PCR 结果结合测序分析证实，已成功构建同基因型的 micC 突变株。通过实时定量 PCR 分析了菌株 50336、50336 ΔmicC 和 50336 ΔmicC pmicC 中 ompA、ompC 和 ompD 基因的表达水平。与野生型菌株相比，50336 ΔmicC 中 ompA 和 ompC 的转录水平分别增加了约 2.2 倍和 3 倍。尽管ompD的转录水平仅略有增加。LD50实验显示，在用三种菌株分别感染6至8周龄的BALB/c小鼠后，大多数感染50336 ΔmicC菌株的小鼠在感染后48小时出现精神萎靡、食欲减退或腹泻等症状，并在96小时后死亡。而感染野生型菌株和50336 ΔmicC pmicC菌株的小鼠则在感染后72小时出现相同症状，并在120小时后死亡。三种菌株的LD50结果表明，与野生型相比，突变株50336 Delta micC的毒力增强了2.5倍。该技术有助于研究人员研究细菌基因的功能，并通过删除目标基因获得所需的工程菌株。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

非编码小RNA MicC有助于肠炎 沙门氏菌 外膜蛋白的毒力

用于裂谷热病毒 MP-12 疫苗株的反向遗传学系统是构建具有增强减毒性和免疫原性的新型 MP-12 突变株的有效工具。本文描述了生成和鉴定 NSs...

利用反向遗传学改造裂谷热病毒MP-12株的NSs基因以提高疫苗的安全性和有效性

C. elegans 已成为研究宿主-病原体相互作用的一种新型遗传学模型。本文介绍了一种利用Salmonella typhimurium感染C.

一种感染方案 秀丽隐杆线虫 与 鼠伤寒沙门氏菌

高通量检测方法以 体外 表型 沙门氏菌 或高通量检测细菌在吞噬细胞中的定植、侵袭及复制能力的方法已被建立。该方法已被用于评估 沙门氏菌...

高通量表型分析实验 肠炎沙门氏菌 鼠伤寒沙门菌与巨噬细胞的黏附、侵袭及复制

本文介绍了一种构建感染性细菌人工染色体的实验方案，该染色体包含日本脑炎病毒正链基因组RNA的全长cDNA。该方案可用于构建其他正链RNA病毒的功能性cDNA，因此是研究病毒生物学的有力基因组学工具。...

细菌人工染色体：正链RNA病毒功能基因组学研究的工具

研究细菌病原体与其宿主之间的相互作用是生物学研究的重要领域。本文介绍了利用BlaM底物在siRNA基因沉默过程中检测贝氏柯克斯体（Coxiella...

应用荧光共振能量转移（FRET）技术检测siRNA沉默期间Coxiella burnetii效应蛋白转位效率

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌群体在感染过程中响应组织环境而产生的表型多样性提供了资源。...

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MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA...

MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。...

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

HIV嗜性可根据病毒包膜的V3区推断。使用巢式RT-PCR对V3区进行三重PCR扩增，随后进行测序，并利用生物信息学软件进行分析。若样本中存在一个或多个序列的g2P评分较低，则被归类为非R5病毒。...

基于V3区群体测序进行HIV-1嗜性基因型推断

我们描述了一种多重PCR方法，用于快速检测肠道沙门菌（Salmonella...

一种用于鉴定的等位基因分型PCR 鼠伤寒沙门氏菌 血清型肠炎沙门菌、哈达尔沙门菌、海德堡沙门菌和鼠伤寒沙门菌

了解利用λ-Red介导的同源重组系统构建肠炎沙门氏菌micC基因缺失突变株的方法。该技术可高效失活染色体基因，为研究细菌基因功能及开发减毒疫苗候选株提供可靠工具。

一种非编码小RNA MicC在膜外蛋白的毒力中发挥作用沙门氏菌 Enteritidis

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