非编码小RNA MicC有助于肠炎 沙门氏菌 外膜蛋白的毒力
2021年1月27日
使用λ-Red介导的重组系统创建小的非编码RNA micC的缺失突变体。
该协议可用于灭活染色体基因以分离突变体以进行基因功能研究和细菌。它使同源重组过程简单、快速和高效。使用该技术，可以删除病原体的毒力相关基因以获得减毒突变体，该突变体可用作减毒疫苗的候选者。
首先扩增含有micC基因血学片段的氯霉素盒。设计正向和反向引物以扩增来自质粒PKD3的氯霉素盒，包括来自micC基因的五个素数和三个素数末端的50个碱基对同源性延伸。按照文本手稿中的说明进行PCR，使用PKD3质粒作为模板扩增氯霉素盒。
用琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。然后用DNA凝胶回收试剂盒纯化产物，并通过分光光度法测定DNA的浓度。进行第二次PCR反应以消除PKD3质粒进一步重组的干扰。
以1比200的比例稀释第一个PCR产物，并将其用作二级PCR的模板。为了构建第一个重组菌株50336 delta micC点猫，将100微升SE 50336感受态细胞与5微升PKD 46质粒混合，并在冰上孵育30分钟。在42摄氏度下对混合物进行热冲击90秒，然后将其迅速转移回冰上两分钟，将质粒转化为细胞。
通过在氨苄西林耐药平板上以30摄氏度培养细胞过夜来筛选阳性菌落。第二天，向SE 50336 PKD 46液体培养物中再加入30毫利尔阿拉伯糖，并在振荡的同时在30摄氏度下孵育一小时诱导重组酶表达。在电击杯中混合 100 纳克纯化的 PCR 产物和 40 微升 SE 50336 PKD 46 感受态细胞。
然后进行电击改造。电转化后，将混合物转移到一毫升SOC培养基和150RPM和30摄氏度的振荡培养箱中一小时。将混合物铺在耐氯霉素的LB平板上，并在37摄氏度下培养过夜以筛查阳性菌落。
在42摄氏度下培养阳性菌落两个小时。然后在 37 摄氏度下筛选菌落对氨苄西林的敏感性和对氯霉素的耐药性过夜，以获得第一个不含 PKD 46 的重组菌株。使用PCR和凝胶电泳提取50336 Delta micC点猫基因组DNA后，将100纳克质粒PCP 20电镀成40微升50336 Delta micC点猫感受态细胞。
在 30 摄氏度的氨苄西林和氯霉素耐药平板上筛查阳性转化体。将正转化体转移到非抗性LB液体培养基中，并在42摄氏度下培养过夜。然后在 37 摄氏度的 LB 平板上分离单个菌落。
选择对氨苄西林和氯霉素敏感的菌落。这个突变体是micC缺失突变体SE 50336 Delta micC。按照文本手稿中的说明执行 PCR 验证 50336 Delta micC。
该协议用于在补充突变体50336 Delta micC，pmicC中构建缺失突变体50336 Delta micC。通过PCR验证了第一个重组50336 Delta micC点猫，插入氯霉素的预期条带大小约为1200个碱基对PCR产物，而野生型菌株的预期条带大小为279个碱基对。在第二次重组中，氯霉素盒被PCP 20消除。
PCR结果结合测序证实，同基因micC突变体构建成功。采用实时定量PCR分析了菌株50336、50336 delta micC和50336 delta micC pmicC中ompA、ompC和ompD基因的表达。与野生型菌株相比，ompA和ompC以及50336 delta micC的转录增加了约2.2倍和3倍。
而ompD的转录仅略有增加。LD 50测定显示，在用三种菌株中的每一种感染6至8周龄的BALB / c小鼠后，大多数感染50336 Delta micC的小鼠在感染后48小时表现出倦怠，食欲不振或腹泻，并在96小时后死亡。野生型菌株和50336 delta micC pmicC感染的小鼠在感染后72小时表现出相同的症状，并在120小时后死亡。
3株菌株的LD 50表明，突变体50336 Delta micC的毒力比野生型提高了2.5倍。该技术有助于研究人员研究细菌基因的功能，并通过删除靶基因获得所需的工程菌株。
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概览
本文介绍了一种利用位-Red介导的重组系统来创建小型非编码RNA micC的缺失突变体的协议。这种方法简化了细菌研究中突变体分离的基因失活过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 遗传学
- 病原体研究
背景
- 同源重组是基因功能研究的关键技术。
- 染色体基因的失活有助于分离突变体。
- 衰减的突变体可以作为疫苗候选者。
- 氯霉素盒子常用于基因缺失。
研究目的
- 展示一种创建缺失突变体的方法。
- 促进细菌基因功能的研究。
- 通过基因失活探索潜在的疫苗候选者。
所用方法
- 扩增含有同源片段的氯霉素盒子。
- 设计PCR的正向和反向引物。
- 使用质粒PKD3作为扩增模板。
- 进行PCR以生成氯霉素盒子。
主要结果
- 成功创建了micC的缺失突变体。
- 展示了位-Red介导的重组系统的效率。
- 提供了一种可靠的基因失活方法。
- 突出了开发衰减疫苗候选者的潜力。
结论
- 位-Red介导的系统对基因缺失有效。
- 这种方法可以增强病原体基因功能研究。
- 未来的应用可能包括疫苗开发。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding virulence mechanisms in bacterial pathogens like Salmonella Enteritidis supports target validation in antimicrobial development. The study demonstrates how non-coding RNA regulation of outer membrane proteins influences pathogenicity, offering mechanistic insights for de-risking anti-infective strategies. This work highlights the value of genetic dissection in identifying virulence factors for preclinical target prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Reveals post-transcriptional regulation of outer membrane proteins as a virulence determinant in Salmonella Enteritidis.
- Operational Value: Provides a genetic model to interrogate sRNA-mediated pathways in host-pathogen interactions.
- Predictive Value: Supports assessment of micC as a potential target for attenuating virulence in vaccine or therapeutic development.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes qRT-PCR and LD50 assays as quantitative readouts for sRNA function and virulence modulation.
- Operational Value: Enables standardized comparison of mutant, wild-type, and complemented strains in infection models.
- Assay Readiness: Demonstrates reproducible measurement of ompA, ompC, and ompD expression linked to phenotypic outcomes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Shows that micC deletion enhances virulence in both murine and avian models, indicating broad relevance across hosts.
- Operational Value: Validates the use of allelic exchange via λ-Red recombination for constructing isogenic mutants in Salmonella.
- Translational Continuity: Connects molecular mechanism (sRNA-OMP regulation) to in vivo pathogenicity, supporting mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The λ-Red-mediated recombination system enables efficient gene deletion, supporting early-stage target validation and mutant library generation in antimicrobial discovery.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by linking sRNA expression to OMP regulation and virulence phenotypes.
- Screening: Generates defined mutants for phenotypic screening of virulence-associated genes in Salmonella.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression and survival data to correlate molecular changes with pathogenic potential.
- Translational Research: Supports preclinical evaluation of virulence factors through isogenic strain comparison in relevant infection models.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for gene inactivation applicable to other pathogens and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Identifies micC as a regulator of virulence through OMP repression, reducing mechanistic ambiguity in pathogenicity studies.
- Operational Value: Offers a rapid, efficient method for chromosomal gene deletion using λ-Red recombination and selectable markers.
- Strategic Value: Enables rational selection of virulence targets for antimicrobial or vaccine development based on genetic evidence.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets by validating their contribution to pathogenicity in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, PCR, and bacterial transformation techniques.
- Dependent on access to electroporation equipment and antibiotic selection markers (chloramphenicol, ampicillin).
- Necessitates biosafety level 2 facilities for handling Salmonella strains and conducting animal infection studies.
- Requires optimization of homology arm length and induction conditions for efficient recombination across different genetic backgrounds.
- Limited by the need for sequential selection and counter-selection steps to isolate marker-free mutants.
