Name: 肠道维利表皮的器官3D培养进行分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 了解肠道绒毛上皮细胞去分化形成类器官的方法，使用小鼠模型通过刮取法保留间充质以支持类器官起始。该技术有助于研究肠道再生与干细胞生物学。

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本出版物获得了美国国立卫生研究院（NIH）国家癌症研究所资助编号 K22 CA218462-03 的支持。表达 R-Spondin1 的 HEK293-T 细胞系由 Michael P. Verzi 博士慷慨惠赠。

所有小鼠实验，包括他莫昔芬的使用和通过颈椎脱位实施安乐死，均已获得斯蒂文斯理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 小鼠
注意：已有关于生成 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+; Villin-CreERT2 小鼠的先前描述3。实验使用八至十二周龄的成年雌性小鼠。
<ol>
	<li>诱导 Smad4敲除β-catenin功能获得性（GOF） 基因突变在 Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+；Villin-CreERT2 连续四天通过玉米油腹腔注射他莫昔芬。</li>
	<li>在首次注射他莫昔芬后十天，通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒腹部，以防止小鼠毛发进入腹腔。</li>
	<li>用解剖剪打开腹腔以暴露肠道。借助解剖剪和镊子分离肠道。 
	&#8203;注意：Smad4 的缺失与 β-catenin 的功能获得性突变同时发生 (Smad4敲除β-catenin功能获得（GOF）) 在肠上皮中通过注射实现Smad4f/f; Catnblox(ex3)/+；Villin-CreERT2 每天连续四天，以每公斤体重0.05克他莫昔芬溶于玉米油中对小鼠进行处理。首次注射他莫昔芬后十天处死小鼠，以确保去分化绒毛中存在表达干细胞相关标志物的细胞。</li>
</ol>
2. 十二指肠的分离与制备
<ol>
	<li>分离出十二指肠的近端一半。</li>
	<li>用10 mL注射器吸取5 mL冰冻PBS冲洗十二指肠，以清除管腔内容物。</li>
	<li>用斜角剪刀纵向剪开十二指肠，并将其平铺在冰上的15 cm培养皿中，使十二指肠管腔面向操作者。</li>
</ol>
3. 通过刮取法分离绒毛
<ol>
	<li>开始刮取前，将一个70 µm的滤网放入6孔细胞培养板的一个孔中。在所有孔中加入4 mL的1×PBS，并将6孔细胞培养板置于冰上（图1）。</li>
	<li>使用两片显微镜玻片按以下方式刮取绒毛：一片用于固定十二指肠，另一片用于刮取（图1B1）。
	<ol>
		<li>在十二指肠腔面轻轻来回刮取两次，以去除黏液。施加适当压力，使此步骤仅去除黏液层而不损伤绒毛。</li>
		<li>再次以与步骤3.1相同的压力来回刮取十二指肠两次，此时可见绒毛在玻片上聚集（图1B2）。此为最佳压力（需由操作者通过经验确定），可使绒毛脱离而无隐窝附着。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用含有PBS的1 mL移液器，将步骤3.2.2中玻片上收集的绒毛转移至置于6孔板中的70 µm滤网中。每次刮取后均以此方式收集绒毛（图1B2）。</li>
	<li>通过将装有绒毛的70 µm滤网依次转移至含有冷PBS（约4 mL/孔）的6孔板各孔中，清洗滤网上收集的绒毛（来自步骤3.3），以去除可能存在的游离隐窝。</li>
	<li>使用P1000移液器，将70 µm滤网中PBS中的绒毛悬液（约3 mL）转移至冰上预冷的新15 mL离心管中。</li>
	<li>使用经0.1% BSA包被的钝头P200移液器吸头吸取50 µL绒毛悬液至玻片上。在4倍物镜下计数50 µL液滴中的绒毛数量，以确定PBS悬液中绒毛的浓度。例如，若在50 µL悬液中观察到10根绒毛，则绒毛浓度为0.2 根/µL。此时也应确认无附着隐窝存在。</li>
	<li>计算所需绒毛悬液体积，以达到在BME-R1基质中接种浓度为0.5 根/µL。额外增加100 µL体积，以补偿移液误差以及用于显微镜检查以确保绒毛纯度所需的样品量。 
	&#8203;注意：在首次观察到绒毛释放后，后续刮取应采用前两次刮取所用的压力（即去除黏液但不损伤绒毛的压力），并将来回刮取次数限制为两次。此措施可避免绒毛与隐窝共同脱落。必须通过显微镜评估绒毛，以确保无附着隐窝存在。</li>
</ol>
4. 在BME-R1基质上接种绒毛
<ol>
	<li>使用经0.1% BSA包被的p200平头吸头，将步骤3.6中获得的足量绒毛转移至微量离心管中，用12.5 µL BME-R1基质胶重悬，以实现每孔约6个绒毛的接种密度。在此步骤中使用BSA包被的平头吸头可确保较大体积的绒毛被顺利吸取，避免因尖头吸头过窄而导致堵塞，或因粘附在吸头壁上造成样本损失。</li>
	<li>在4 °C条件下，以200 × g离心2分钟，使绒毛沉淀，随后弃去上清液。</li>
	<li>重复步骤4.2以去除任何残留的PBS，并在层流罩内进行下一步操作。</li>
	<li>用冰上融化的适量预冷BME-R1基质胶轻柔重悬绒毛沉淀。</li>
	<li>使用p20移液器，将含绒毛的BME-R1基质胶以12.5 µL/孔的体积接种至预热的96孔U型底板中，形成三维培养体系。</li>
	<li>将培养板置于37 °C组织培养孵箱中孵育15分钟，使BME-R1基质胶充分凝固。</li>
	<li>每孔加入125 µL预热的ENR（表皮生长因子/诺金/N-磺酸素1）培养基：即在高级DMEM F-12培养基中添加1×青霉素-链霉素、10 mM HEPES、Glutamax、50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、5%由表达R-Spondin1的HEK293-T细胞产生的条件培养基、1× N2、1× B27、1 mM N-乙酰半胱氨酸和0.05 mg/mL Primocin。</li>
	<li>将接种后的绒毛置于37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育，并每隔一天更换一次培养基。</li>
	<li>若在接种后两天内出现类器官，则应弃去该孔，因为绒毛来源的类器官最早预期出现时间应在接种后两天以上。 
	注意：任何长度达到或超过完整绒毛一半的绒毛均计为一个绒毛。与隐窝来源的类器官不同，绒毛来源的类器官不会在接种后24小时内形成。具有类器官形成潜能的绒毛在类器官形成前会呈现变暗和收缩的形态。因此，若在接种后一天内即出现类器官的孔，应予以弃去，以避免可能由隐窝污染所导致的假阳性结果。条件培养基的制备方法可根据要求提供。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
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<li>Stzepourginski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+mesenchymal+cells+are+a+major+component+of+the+intestinal+stem+cells+niche+at+homeostasis+and+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).</li>
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<li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li>
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<li>Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+and+redundant+functions+of+caudal+family+proteins+in+activating+adult+intestinal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes.</a> Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).</li>
<li>Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+master+transcription+factor+CDX2+controls+chromatin+access+for+partner+transcription+factor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).</li>
<li>Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1+and+Cdx2+exhibit+transcriptional+specificity+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine.</a> PLoS One. 8 (1), 54757(2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

该方法可验证去分化绒毛上皮获得干细胞标志物后所具备的自我更新能力 在体内 正常的肠上皮在三维培养条件下能够由隐窝区形成类器官，但不能由绒毛区形成类器官，这是由于干细胞存在于隐窝中1因此，从去分化的绒毛上皮形成类器官&#160;在三维培养中培养可证实细胞命运逆转导致干细胞的形成。关于肠道上皮中因突变和/或损伤引发细胞命运逆转的报道日益增多2, 3, 9, 10, 11, 12因此，该方法适用于绒毛上皮去分化并表达干细胞标志物的类似情况 体内.
我们通过时间过程观察到类器官从&#160;Smad4KO<...

肠隐窝而非绒毛在Matrigel或BME-R1基质中培养时可形成类器官。这些类器官是自组织结构，常被称为 &#34;类肠道器官&#34; 由于肠道上皮中存在多种分化谱系、前体细胞和干细胞 体内类器官的形成潜力归因于隐窝中存在干细胞1另一方面，肠绒毛仅由已分化的细胞组成，因此无法形成类器官。然而，突变2 或可允许绒毛上皮去分化的条件可能会导致绒毛中出现干细胞2,3将去分化的绒毛上皮接种于三维基质中，通过检测其类器官形成能力作为干细胞特性的指标，可证实绒毛上皮中因命运改变而产生的干性特征 从头合成 绒毛上皮中的干性。因此，该操作的关键在于确保无隐窝污染。
Smad4KO:β-cateninGOF 条件性突变可导致肠上皮去分化，其特征是在绒毛中表达增殖和干细胞标志物，并最终在绒毛中形成类似隐窝的结构，称为异位隐窝。这些去分化的绒毛中是否存在干细胞，是通过检测异位隐窝中干细胞标志物的表达（体内）以及突变绒毛在Matrigel3中培养时形成类器官的能力来确定的。以下所述步骤详细说明了用于验证Smad4KO:β-cateninGOF突变小鼠肠上皮去分化过程中干细胞特性的方法。该方法在分离绒毛时的一个关键特征是采用刮取肠腔的方式，而非EDTA螯合方法4。与EDTA螯合法不同，通过刮取法分离绒毛能够保留大部分下方的间充质组织，并可通过调节刮取压力获得不带附着隐窝的绒毛。刮取压力依赖于操作者的主观判断，因此，需由操作者通过实验经验确定最佳压力，以获得无隐窝附着的绒毛。该操作的关键环节在于，在将绒毛接种于BME-R1基质前后，均需通过显微镜检查确保绒毛样本中无隐窝污染。
使用玻璃载片刮取肠腔内的肠绒毛，并将其置于70 µm滤膜上，用PBS洗涤以去除松散的细胞或隐窝（如有），然后在BME-R1基质中进行接种。该方法强调以下几点以避免隐窝污染：a）仅从十二指肠近端一半区域采集绒毛，该区域绒毛最长；b）尽量减少获得绒毛的刮取次数；c）将含有绒毛的滤膜在六孔板中用一系列PBS进行洗涤；d）在接种于BME-R1基质前后，均通过显微镜检查确认无隐窝污染。通过刮取法而非EDTA螯合法分离绒毛，可防止底层间充质的完全丢失，若需要从绒毛上皮启动类器官形成，该间充质可能提供必要的微环境信号5, 6, 7, 8。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM F-12培养基</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-二氨基联苯胺</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>96孔U型底板</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABC试剂盒</td><td>Vector Labs</td><td>&amp;nbsp;PK4001</td><td></td></tr><tr><td>斜头剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>无动物源性重组人EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）无蛋白酶粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>CD44抗体</td><td>BioLegend</td><td>1030001</td><td></td></tr><tr><td>Cdx2抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70微米细胞筛</td><td>Life Sciences</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex低生长因子基底膜提取物，R1型</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax（100倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>表达RSPO-1的HEK 293-T细胞</td><td>由Michael Verzi博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>网状滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2添加剂（100倍浓度）</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200平头吸头</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primocin（50 mg/mL）</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS（10倍浓度）</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>信号稀释液</td><td>Cell Signaling</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6孔组织培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

从小肠绒毛上皮去分化过程中类器官的三维培养

关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

类器官的克隆形成能力源于肠道上皮中存在的干细胞。小鼠小肠上皮分为隐窝和绒毛：干细胞和增殖细胞局限于隐窝，而绒毛上皮仅含有已分化细胞。因此，正常的肠隐窝可在三维培养中形成类器官，而绒毛则不能。此处描述的方法仅适用于经历去分化并获得干性的绒毛上皮。该方法使用Smad4功能缺失：β-catenin功能获得（Smad4KO:β-cateninGOF）条件性突变小鼠。该突变导致肠道绒毛发生去分化，并在绒毛中生成干细胞。发生去分化的肠绒毛通过玻璃片从肠组织上刮取，置于70 µm细胞筛中，并多次洗涤以去除任何松散的细胞或隐窝，然后接种于BME-R1基质中，以评估其形成类器官的潜能。为确保所形成的类器官来源于去分化的绒毛区室而非隐窝，采用了两个主要标准：1）在接种于三维基质前后，通过显微镜评估&#160;分离的绒毛，确保不存在任何附着的隐窝；2）监测绒毛来源类器官发育的时间进程。绒毛来源的类器官仅在接种后两至五天才开始形成，且形态不规则；而同一肠上皮来源的隐窝类器官在接种后16小时内即可明显观察到，且呈球形。然而，该方法的局限性在于，所形成的类器官数量以及绒毛来源类器官启动所需时间，取决于去分化的程度。因此，根据引起去分化的突变特异性或损伤类型，必须通过实验经验确定收获绒毛以检测其类器官形成潜能的最佳阶段。

决定该实验成功的关键因素是防止隐窝污染。通过确认以下四个主要标准，可确保类器官来源于绒毛（而非任何污染的隐窝）：1）在将绒毛接种至BME-R1前及接种后，通过显微镜检查确认所收获绒毛的纯度；2）每孔接种少量绒毛，以便能够单独观察每一个接种的绒毛；3）每日监测类器官的发育情况；时间序列图像显示了类器官从绒毛发育的过程（图3）；4）监测从绒毛起始的类器官的生长动力学及其形态特征；源自绒毛的类器官最初呈不规则形状，需两至五天后才可在4×放大下观察到，而通过EDTA/PBS螯合方法分离隐窝所培养的隐窝来源类器官则在过夜后即形成具有清晰边界的球形结构（1,4）（图2）。
为检测绒毛类器官形成潜能而处死小鼠的最佳时间点，是在去分化后的绒毛上皮表达干细胞标志物并开始在体内（in vivo）形成异位隐窝之后（约在给予Smad4f...

该实验方案描述了从小鼠肠道上皮中分离正在进行去分化的绒毛，以确定其形成类器官的潜能。

类器官的克隆形成能力归因于其中存在的干细胞。小鼠小肠上皮组织是……

该方法可用于验证去分化绒毛上皮在体内获得干细胞标志物后形成类器官的能力。绒毛的收集通过刮取法进行，而非EDTA螯合方法，从而避免了底层间充质的完全丢失，若类器官启动需要间充质提供微环境信号，则此操作尤为重要。该方法适用于增殖区与分化区在结构上明确分隔、且去分化细胞在体内表达干细胞标志物的上皮组织。本方案中的某些因素需要通过实验经验来确定，包括绒毛采集的最佳时期以及刮取绒毛的最佳压力，这些都需要一定的时间和实践来优化。通过连续四天腹腔注射他莫昔芬和玉米油，在突变小鼠中诱导 Smad4 基因敲除和 β-catenin 功能获得性突变。安乐死后，用70%乙醇喷洒小鼠腹部，以防止鼠毛进入腹腔。使用解剖剪切开腹腔以暴露肠道，并用剪刀和镊子分离肠道。分离出十二指肠的近端一半，然后用装有5毫升冰冻PBS的10毫升注射器冲洗十二指肠，以清除管腔内容物。用斜角剪刀纵向切开十二指肠，并将十二指肠平铺于一个置于冰上的15厘米培养皿中，使十二指肠管腔面朝向操作者。开始刮取前，将一个70微米的滤网置于六孔细胞培养板的一个孔中。用4毫升1×PBS填充所有孔，并将培养板置于冰上。使用两张显微镜玻片刮取绒毛，其中一张用于固定十二指肠，另一张用于刮取。用刮刀轻轻刮取十二指肠腔面两次，去除黏液但保留绒毛；再刮取十二指肠两次，将绒毛收集到载玻片上，避免带入隐窝组织。使用含有 PBS 的 1 毫升移液管，将绒毛转移至六孔板中的 70 微米细胞筛中。每次刮取后均需收集绒毛。为了去除松散的隐窝，将使用70微米滤网收集的绒毛通过含有四毫升冰上预冷PBS的六孔板中的各孔依次进行洗涤。使用P1000移液器，将滤网中约三毫升PBS中的绒毛悬液转移至冰上预冷的新15毫升离心管中。使用经0.1% BSA包被的钝头P200移液器吸头，取50微升绒毛悬液转移至载玻片上。在4倍放大倍数下，对50微升液滴中的绒毛进行计数，以确定PBS悬浮液中绒毛的浓度，并确认无隐窝残留。接种绒毛时，使用经0.1% BSA包被的P200平头枪头，将绒毛转移至微量离心管中，按每孔6个绒毛的密度接种至12.5微升BME-R1基质中。在4°C条件下，以200 × g离心2分钟，使绒毛沉淀。吸除上清液，并重复离心以去除残留的PBS。在超净工作台中，用预冷的、冰上融化的适量BME-R1培养基轻柔重悬绒毛沉淀。使用P20移液器，将每孔12.5 µL的绒毛BME-R1基质悬液接种至已预热至37°C的96孔U型底培养板中。将培养板置于37摄氏度的组织培养箱中孵育15分钟，以使BME-R1基质凝固。向每孔中加入125微升预热的ENR培养基，培养基的添加成分详见文本稿件中的描述。将接种有绒毛的培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的组织培养箱中孵育，并每隔一天更换一次培养基。弃去任何在两天内出现类器官的孔。来自同一小鼠肠道的隐窝与去分化的绒毛上皮所产生的类器官在形态上存在差异。隐窝来源的类器官在过夜后即出现，呈具有清晰边界的球形结构。对从绒毛启动的类器官的动力学及其形态学特征进行了观察，这些类器官最初呈不规则形状，需经过两至五天后才能在显微镜下观察到。图中展示了两个不同绒毛启动类器官形成的过程。具有类器官形成潜能的绒毛结构较为致密，可能是由于保留了下方的间充质组织所致。从某个绒毛中可见，类器官在第2天即开始形成。而在其他绒毛中，类器官则在第4天出现。在收获绒毛及培养所得类器官时，采取适当步骤避免隐窝污染至关重要。在采用该方法后，观察到同一突变体来源的隐窝和绒毛类器官之间存在表型差异，因此可进一步开展实验以探究两者之间的分子差异。本方案可用于研究源自内源性隐窝的类器官与通过去分化形成的异位隐窝来源类器官之间的差异，从而探讨去分化的潜在影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肠道维利表皮的器官3D培养进行分化

我们介绍了一种从手术组织和活检样本中获取的小肠隐窝和结肠隐窝建立人类肠类器官和结肠类器官的方法。在这篇方法学文章中，我们介绍了成功培养和维持人类肠类器官与结肠类器官所必需的培养模式。...

从完整组织和活检样本建立人上皮类肠体和类结肠体

本文介绍一种培养具有完整屏障功能的人类肠类器官或结肠类器官单层细胞的实验方案，用于在细胞和生化水平上研究宿主上皮细胞与微生物群之间的相互作用。...

用于研究病原体、共生菌与宿主肠上皮相互作用的人类结肠类器官单层培养模型

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

本文介绍了两种可用于模拟肠道顶膜特异性相互作用的实验方案。类器官来源的肠道单层细胞培养和气液界面（ALI）培养可形成高度分化的上皮层，且可同时从管腔侧和基底侧进行操作；而极性翻转的肠道类器官则将其顶膜暴露在外，适用于高通量检测。...

利用肠道类器官模型研究顶端特异性相互作用的培养方法

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。...

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

该方案结合了人类肠道类器官技术与单细胞转录组学分析，为此前尚未深入探索的肠道生物学提供了重要见解。...

利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻（TEER）值的升高，表明上皮完整性良好。此外，在Ussing室实验中，施加佛司可林后，这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。...

二维猪肠道类器官反映原生肠道的生理特性

了解肠道绒毛上皮细胞去分化形成类器官的方法，使用小鼠模型通过刮取法保留间充质以支持类器官起始。该技术有助于研究肠道再生与干细胞生物学。

从小肠绒毛上皮去分化过程中类器官的三维培养关键词：类器官，小肠绒毛上皮，去分化，三维培养

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