Name: 点变异荧光相关光谱用于分析活细胞质膜上的分子扩散 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学习点变异荧光相关光谱技术，用于活细胞质膜分子扩散分析。该方法具有高时空分辨率且非侵入性，可研究胆固醇对膜脂筏稳定性的影响，适用于细胞生物学和神经科学研究。

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SB、SM 和 DM 得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）和艾克斯-马赛大学的机构资助，以及法国国家科研署项目基金（ANR-17-CE15-0032-01 和 ANR-18-CE15-0021-02）和法国“&#34;Investissement d'Avenir&#34;”计划（ANR-10-INBS-04 France-BioImaging，ANR-11-LABX-054 labex INFORM）的支持。KW 感谢 KNOW 计划中的跨学科环境博士研究项目“&#34;BioTechNan&#34;”。EB 感谢波兰国家科学中心（NCN）项目编号 2016/21/D/NZ1/00285 提供的经费支持，以及法国政府和法国驻波兰大使馆的资助。MŁ 感谢波兰发展部（CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19）和国家科研与开发中心（Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17）提供的经费支持。TT 感谢波兰国家科学中心（NCN）项目编号 2016/21/B/NZ3/00343 以及弗罗茨瓦夫生物技术中心（KNOW）提供的经费支持。

1. 定制svFCS装置组装的规格设置
注意：所提出的svFCS装置结构简单，便于以低成本实现便捷的安装、操作和维护，同时确保光子回收的高效性。更多细节请参见补充材料。
<ol>
	<li>实验房间与安全
	<ol>
		<li>将系统安装在温度稳定在约 21 °C.</li>
		<li>避免气流直接吹拂被动（或主动）光学平台，并遵守激光安全规范进行光路准直。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硬件与软件 
	注意： 补充材料 详细说明了图示中的安装步骤 图2.
	<ol>
		<li>使用LabVIEW编写主采集与控制软件，采用状态机和事件结构架构，其中多功能数据采集板驱动大部分控制器。 
		注意：相关器、激光器和功率计由各自的软件进行控制或监测。</li>
		<li>根据所使用的硬件调整硬件和软件的安装步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>光学装置 
	注意： 图3 展示了在后续部分中用于控制光学校准质量的光学平台模块。所有光学元件的规格均列于 材料表. 搭建该装置的步骤在文中已详细描述。 补充材料该系统包括一个连续波激光器、一台配备浸水物镜的电动倒置显微镜、一个与单光子计数模块耦合的雪崩光电二极管探测器，以及一个硬件相关器。特别设计了一个带有无振动加热器的显微镜培养室，用于在活细胞实验中精确控制温度。按照惯例，XY轴对应于光路的垂直平面，Z轴对应于光路方向。</li>
</ol>
2. 实验运行前每日检查点
<ol>
	<li>控制激发光路（图3，<img alt="静力平衡；ΣFx=0 图示；受力分析；教育用物理概念。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ03v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3"> &amp; <img alt="静力平衡图示，ΣFx=0，设备平衡，教育用物理关键词。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4">）。
	<ol>
		<li>打开所有虹彩光圈。</li>
		<li>使用功率计测量激光功率，同时保持第一个虹彩光圈完全打开。</li>
		<li>旋转半波片（HWP），找到最大功率位置。</li>
		<li>如果激光功率低于正常值，使用虹彩光圈检查光路准直，必要时交替调节L1和M1。</li>
		<li>在实验记录本中记录功率数值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>控制检测光路（图3，<img alt="静力平衡；ΣFx=0 图示；光束平衡；力矢量；结构分析。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 5"> &amp; <img alt="静力平衡图示；ΣFx=0，ΣFy=0；矢量分解；力平衡示意图。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 6">）。
	<ol>
		<li>在物镜上放置水、盖玻片以及一滴2 nM罗丹明6G（Rh6G）溶液。</li>
		<li>如果荧光信号（APD上的计数，通过LabVIEW软件记录）低于正常水平，重新配制Rh6G溶液，检查物镜上样品的位置和盖玻片编号，或清除可能存在的气泡。
		<ol>
			<li>如果荧光信号仍然偏低，将功率计放入光路中以阻断光束。</li>
			<li>关闭APD（下文中，APD指APD及其单光子计数模块）。</li>
			<li>移除样品。</li>
			<li>清洁物镜，并用反射靶替代。</li>
			<li>从光路中移除功率计，检查反射靶上的激光光斑。确保光斑居中，且后向反射光到达光路中的第一个虹彩光圈 <img alt="静力平衡图示，ΣFx=0，设备平衡，教育用物理关键词。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 4">（图3）。</li>
			<li>若未对准，使用M2调节光斑中心位置，或使用二向色镜调节后向反射光。</li>
			<li>若显微镜耦合正确，将物镜推回原位，加入一滴水、盖玻片以及浓度更高的Rh6G溶液（例如200 nM），并设置比常规测量更低的激光功率（几µW）。</li>
			<li>打开APD，交替调节APD和针孔的XYZ调节螺丝，同时监测强度信号（通过LabVIEW软件），以优化对准。</li>
			<li>更换盖玻片，并使用较低浓度的Rh6G（2 nM）。沿Z轴移动针孔，找到分子亮度比增加且束腰最小的位置。</li>
			<li>逐渐关闭虹彩光圈，直至信号下降：此时激光光束尺寸已达到物镜后孔径尺寸（即最小束腰尺寸，参见补充材料）。</li>
			<li>启动相关器软件并开始记录数据（数据记录详见第7节）。</li>
			<li>检查自相关函数（ACF），其应显示较低噪声、较小的束腰尺寸以及较高的每分子每秒计数率（数据分析与束腰尺寸评估详见第7节）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. svFCS 数据采集与分析的一般注意事项
<ol>
	<li>按照以下通用方案记录和分析荧光数据（详见第7、8和第9节）：（1）荧光信号记录与自相关函数（ACF）生成（使用相关器软件），（2）剔除异常数据，对保留的数据进行平均，并使用适当模型进行拟合（使用自主开发的Igor Pro软件），（3）扩散定律作图（使用自主开发的MATLAB软件1），以及（4）可选的扩散定律比较（使用自主开发的MATLAB软件2）。上述不同软件程序可根据要求提供。 
	注意：硬件相关器的最小采样时间为12.5 ns（即采样频率为80 MHz）。其提供的时间分辨率至少比溶液中自由扩散小分子的典型停留时间低1,000倍，比膜蛋白在共聚焦观测体积内的扩散时间低106倍。</li>
</ol>
4. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>使用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），以每孔10,000个细胞的密度将Cos7细胞接种于底部为#1.0硼硅酸盐玻璃的8孔腔室盖玻片中，培养基中添加5%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 U/mL）和L-谷氨酰胺（1 mM）。</li>
	<li>将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润气氛中培养24小时。</li>
	<li>移除培养基，每孔加入300 µL新鲜完全培养基，并在37 °C下预孵育细胞30分钟。</li>
	<li>将编码与eGFP25融合的Thy-1蛋白的0.5 µg质粒DNA溶于50 µL无血清DMEM中，短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将1.5 µL DNA转染试剂溶于50 µL无血清DMEM中，并充分混匀。</li>
	<li>将稀释后的转染试剂直接加入已准备好的DNA溶液中，并立即混合各组分。</li>
	<li>将配制好的混合物在室温下孵育10至15分钟。</li>
	<li>将10 µL DNA/转染试剂复合物逐滴加入每孔培养基中，并通过轻轻摇动培养板使其均匀分布。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。</li>
	<li>孵育结束后，将含有DNA/转染试剂复合物的培养基更换为400 µL新鲜完全DMEM，并在进行svFCS实验前继续培养16小时。</li>
</ol>
5. 用于 svFCS 测量的细胞准备
<ol>
	<li>移除培养基。</li>
	<li>用不含血清、含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）缓冲液轻轻洗涤细胞两到三次，该缓冲液需添加 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH 值为 7.4（HBSS/HEPES）。</li>
	<li>在所有 svFCS 采集过程中，始终将细胞维持在 HBSS/HEPES 缓冲液中。</li>
</ol>
6. 药理学治疗
<ol>
	<li>移除培养基，用添加了10 mM HEPES（pH 7.4）的无血清HBSS溶液洗涤细胞两到三次（HBSS/HEPES）。</li>
	<li>在37 °C条件下，用含1 U/mL胆固醇氧化酶（COase）的HBSS/HEPES缓冲液孵育细胞1小时。</li>
	<li>移除溶液后，在进行svFCS测量时，维持细胞处于含0.1 U/mL COase的HBSS/HEPES缓冲液中。</li>
</ol>
7. 光斑尺寸校准
<ol>
	<li>将显微镜腔室预热至 37 °C。</li>
	<li>通过连续稀释制备 2 nM 的 Rh6G 标准溶液。</li>
	<li>在置于水浸物镜上的玻璃盖玻片上滴加 200 µL 的 2 nM Rh6G 溶液。</li>
	<li>启动所有硬件和软件。</li>
	<li>将 488 nm 激光束功率测量并调节至 300 µW。根据所用荧光探针的亮度和光稳定性，依据以下条件调整该功率：(1) LabVIEW 软件上的荧光强度应保持稳定；(2) 相关器软件上的 ACF 形状应随时间保持恒定；(3) 拟合参数应给出较小的束腰尺寸和较高的每分子计数率（每秒每分子光子数，通常为每秒每分子数十至数百个光子）。 
	注意：ACF 的幅度（称为 G(0)）与分子数量（即荧光探针浓度）成反比。对于束腰尺寸校准，这是一个良好的质量控制候选参数。因此，G(0) 在相同浓度下应逐日保持一致，因为它关联了束腰尺寸与浓度。对于细胞测量，由于 FCS 在低浓度下更准确，因此 G(0) 应较高，以利于正确提取拟合参数。</li>
	<li>使用 LabVIEW 软件设置 svFCS 的照明/检测显微镜端口。</li>
	<li>打开 APD。</li>
	<li>关闭虹彩光阑直至信号下降，以获得最小束腰尺寸；或为获得更大的束腰尺寸而适当关闭光阑。</li>
	<li>使用相关器软件记录多个选定持续时间的 ACF（即一次运行），以提高统计重复性，通常进行 10 次运行，每次持续 20 秒。</li>
	<li>关闭 APD。</li>
	<li>使用 Igor Pro 软件检查并剔除因分子聚集体引起强烈波动的运行数据。此步骤需手动执行——在用户经过培训后，结果应与操作者无关。</li>
	<li>使用三维扩散模型对保留的 ACF 的平均值进行拟合。</li>
	<li>从拟合参数中提取平均扩散时间 <img alt="荧光相关光谱图，用于扩散分析的 τ_D 测量" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">，并将其保存为“.txt”文件（文件格式由 Igor Pro 软件决定）。</li>
	<li>通过将平均荧光强度（从荧光轨迹中提取）除以分子数（从 ACF 中提取），计算每秒每分子的计数率（一个良好的性能指标）。 
	注意：确保在相同采集参数下，该值逐日保持较高且稳定。</li>
	<li>已知 Rh6G 在 37 °C 水溶液中的扩散系数 (D) 和 <img alt="荧光相关光谱图，用于扩散分析的 τ_D 测量" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 2">（见 7.13），根据公式 <img alt="静态平衡，ω=√(4×τD×D) 方程，用于科学分析的公式。" src="/files/ftp_upload/61823/61823equ01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1"> 计算实验束腰尺寸 ω。</li>
	<li>在绘制 FCS 扩散定律曲线所需的每次束腰尺寸调整后，以及在每次新的 svFCS 数据采集系列开始前，均应执行该流程。</li>
</ol>
8. 细胞上的svFCS数据采集
<ol>
	<li>测量并调节488 nm激光束功率至2至4 µW之间。根据所用荧光探针的亮度和光稳定性，调整该功率以实现每个分子较高的计数率（通常为每秒数千个光子），同时保持较低的光漂白（即LabVIEW软件中强度轨迹稳定）。</li>
	<li>在开始测量前，将样品在37 °C下平衡10分钟。</li>
	<li>使用LabVIEW软件设置落射荧光照明显微镜。</li>
	<li>选择一个荧光探针定位合适且荧光信号强度（较低）适中的细胞。 
	注意：荧光信号越低，FCS测量效果越好（见步骤8.1）。</li>
	<li>使用LabVIEW软件设置svFCS照明/检测显微镜端口。</li>
	<li>打开APD（雪崩光电二极管）。</li>
	<li>使用LabVIEW软件对选定细胞进行xy扫描。</li>
	<li>进行z轴扫描，并通过选择顶部的质膜将共聚焦光斑定位在荧光强度最大处，然后开始数据采集。为最大化两个膜之间的分离度，建议在细胞核区域进行扫描。</li>
	<li>使用相关器软件记录一组20次运行，每次持续5秒。 
	注意：确保每次运行的持续时间足够长，以获得噪声较低的自相关函数（ACF）。长时间采集易受光漂白或意外显著变化（如聚集）的影响。应根据样品调整运行次数、每次持续时间和组数，但为保证可重复性，同一批实验中这些参数必须保持一致。</li>
	<li>关闭APD。</li>
	<li>使用Igor Pro软件剔除异常的运行数据。</li>
	<li>使用双组分二维扩散模型拟合平均ACF。根据目标分子的扩散行为类型调整该模型。</li>
	<li>将拟合参数保存至前一个文件中（见步骤7.13）。</li>
	<li>在至少10个不同细胞上进行10至15组记录，并重复步骤8.3至8.13。检查所得单个文件是否包含腰斑尺寸信息及10–15次记录的拟合参数。</li>
	<li>为建立单一扩散定律，需分析至少四种腰斑尺寸，范围在200至400 nm之间。该范围由光学衍射极限决定，但依赖于物镜（数值孔径）和激光（波长）。 
	注意：由于腰斑尺寸校准并非绝对，存在一定不确定性，因此专门开发了一套MATLAB软件28，可考虑x和y方向的误差（即ω2和td），用于拟合扩散定律。</li>
	<li>启动MATLAB软件1，并选择一个包含至少四个腰斑尺寸实验对应的所有“.txt”文件的文件夹。</li>
	<li>绘制&lt;td&gt; 对 &lt;ω2&gt; 的关系图，即扩散定律。可从中提取两个主要参数：y轴截距（t0）和有效扩散系数（Deff，与斜率成反比）。</li>
</ol>
9. 不同实验条件下扩散规律的比较
注意：如有必要，针对不同的实验条件重复第 7 和第 8 部分。已开发专用软件（MATLAB 软件 2）用于根据 t0 和 Deff 值判断这些扩散规律是否相似28。该软件检验两个假设：两个值不同，或两个值在设定的误报概率（PFA）阈值以上无显著差异。将 5%（T = 3.8）的任意 PFA 值视为两个参数（t0 或 Deff）之间显著性差异的上限，表明这两个值完全相同的概率仅有 5%。
<ol>
	<li>创建一个“.xls”文件，其中包含待比较各条件的特征性扩散定律参数值（即，以表格形式包含未处理（NT）和经处理（COase）条件下的t0、t0 误差、Deff 及 Deff 误差）。
	<ol>
		<li>启动 MATLAB 软件 2。</li>
		<li>选择该“.xls”文件。</li>
		<li>分析生成的颜色编码二维图，其中t0 和 Deff 的统计检验结果分别绘制在 x 轴和 y 轴上（图 4）。T 值越高，表示被比较的数值之间差异越大。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 胆固醇浓度测定
<ol>
	<li>细胞处理与裂解
	<ol>
		<li>将Cos7细胞以每孔4 × 105个细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养，使细胞贴壁。</li>
		<li>移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3次。</li>
		<li>加入1 mL含有（对照组不加）1 U/mL Coase的HBSS/HEPES缓冲液，在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
		<li>更换为1 mL含有0.1 U/mL Coase的HBSS/HEPES缓冲液，在37 °C、5% CO2条件下继续孵育1小时。</li>
		<li>移除溶液，收集细胞。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞3次，在室温下以400 × g离心5分钟。</li>
		<li>在冰上用放射免疫沉淀分析缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP40，10 mM MgCl2，1 mM乙二胺四乙酸，2%甘油，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）裂解细胞，孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C下以10000 × g离心裂解液10分钟，收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据制造商说明，使用工作液通过改良的Bradford蛋白测定法测定各样品的总蛋白浓度。</li>
	<li>胆固醇浓度测定
	<ol>
		<li>为通过酶法测定细胞总胆固醇水平，请按照制造商说明使用相应的试剂盒（例如Amplex Red胆固醇测定试剂盒）。</li>
		<li>在每个反应体系中，将含5 µg蛋白的样品与Amplex Red试剂/辣根过氧化物酶/胆固醇氧化酶/胆固醇酯酶工作液混合，在37 °C避光孵育30分钟。</li>
		<li>使用酶标仪在激发波长520 nm下检测荧光，发射波长检测范围为560–590 nm。</li>
		<li>从最终读数中扣除背景值，并利用标准曲线确定胆固醇浓度。</li>
		<li>计算每微克蛋白所含胆固醇的纳克数（ng胆固醇/µg蛋白）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+are+more+mosaic+than+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membranes are more mosaic than fluid.</a> Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了在标准荧光显微镜上实现svFCS模块的方法，这是一种强大的实验手段，通过FCS扩散定律分析，解析活细胞质膜组织的动态特性。从概念上讲，svFCS基于一个简单原理：在时间域内进行荧光相关性测量，同时改变照明区域的大小23。该策略在从显微测量中提取纳米级信息方面发挥了关键作用，有助于阐明在稳态25以及生理过程30,31,32,33中影响质膜组织的主要物理化学因素。综合来看，这些svFCS分析明确证实了在多种细胞类型中存在脂质依赖性的纳米结构域，并揭示了其在调控不同信号事件中的直接作用。
在此框架下，构建扫描可变激发体积荧光相关光谱（svFCS）装置时，需考虑若干光学因素，以优化光子预算并最小化光学像差。因此，我们建议使用一种可在进行 svFCS 测量时移除管镜的显微镜。此外，单个光阑在 svFCS 装置中起着关键作用：它可改变物镜后孔径处的光束尺寸，从而直接调节有效束腰尺寸（即有效激发体积）。为获得最小的束腰尺寸，光束直径应与物镜的后瞳相匹配34。该选项有助于调节束腰尺寸，能够优化光子预算，且易于实现。最后，光路中应尽量减少光学元件的数量；系统越简单，光子损失越少。上述各项措施均能显著提升 svFCS 实验的稳健性。
关于实验方案本身，有几个关键步骤需要考虑。最重要的是光学路径的适当对准，这对于成功的svFCS测量至关重要（方案，第2节）。可通过分析2 nM Rh6G溶液在300 µW激光照射下的荧光信号来轻松验证，其信号应约为200 kHz。所有光圈应完全打开，且自相关函数（ACF）应具有显著的幅度（通常G0~1.5–2.0）。另一个关键点涉及细胞及其为svFCS分析所做的准备（方案，第4–8节）。细胞密度需调整至合适水平，以确保有可供分析的孤立细胞。非贴壁细胞需使用聚-L-赖氨酸溶液将其固定在带腔盖玻片上。细胞标记产生的荧光信号不宜过强，否则会导致ACF曲线过于平坦而难以拟合，且拟合参数将带有较大误差。此外，细胞中标记不均匀或出现荧光聚集物会使svFCS测量结果极难解释。最后，胆固醇氧化酶处理会影响细胞活力，因此svFCS分析应在处理后一小时内完成。此外，最好记录来自上部质膜的荧光涨落信号，因为该区域未与支撑面接触，可避免分子因与支撑面发生物理相互作用而导致扩散受阻。
由于存在多种调节检测体积的模式，svFCS 技术已取得足够进展，可应用于不同的研究方法，从而能够在活细胞中研究多种生物过程。除调节激发体积大小外，另一种方法是使用可变光束扩束器35。也可以通过记录沿 z 方向细胞质膜截面处的荧光信号，简单地调节照明区域的大小36。该方法可在标准共聚焦显微镜上实现，且已有理论框架用于推导扩散规律37,38。
尽管svFCS方法提供了表征细胞质膜中分子非均相侧向分布所必需的空间-时间分辨率，但不同的几何限制模式并非相互排斥。某一方向上t0值的偏离仅能揭示占主导地位的限制模式25。此外，当前svFCS方法的另一个重要局限源于经典的光学衍射极限（约200 nm），该尺度无疑大于细胞质膜内分子所处的微区尺度。因此，对限制行为的分析需依据从扩散定律外推得到的t0值进行推断。
这一缺陷已通过采用替代方法得到克服。最初，利用带有纳米孔的金属薄膜实现了对极小膜区域的照明（即，低于单个纳米级孔径的光学衍射极限，其半径范围在75至250 nm之间）39。因此，人们报道了由孤立结构域组织的理论扩散定律所预测的过渡区域，并得以更精确地确定纳米级膜异质结构的特征尺寸，以及对脂质依赖性纳米结构域所占表面积进行定量估算39。此外，纳米级照明还通过近场扫描光学显微镜40或平面光学纳米天线技术得以实现41。最近，将受激发射损耗（STED）与荧光相关光谱（FCS）相结合，提供了一种强大且灵敏的工具，可用于以极高空间分辨率记录扩散规律。该STED-FCS技术能够获取在极短时间内发生的纳米尺度分子扩散特性，从而实现对质膜上脂质探针动态组织的研究42,43。然而，STED过程中荧光抑制不完全的问题，给FCS中自相关曲线的分析带来了挑战。
一种新的拟合模型已被开发出来，以克服这一困难，从而提高扩散时间及平均分子数测量的准确性44。最后，对于细胞膜上较慢的分子扩散，可将svFCS原理应用于通过成像相关光谱技术记录的数据45。最近的研究表明，将原子力显微镜（AFM）与成像全内反射荧光相关光谱（ITIR-FCS）相结合，有助于进一步阐明阻碍细胞膜分子扩散的机制本质，尤其是在纳米结构域密度较高、接近渗流阈值膜构型的情况下46。
总之，通过慢速荧光相关光谱（svFCS）建立扩散定律，为推断由动态集体脂质和膜蛋白相互作用所形成的局部异质性提供了实验证据。正如Wohland及其同事46所述：“FCS扩散定律分析仍然是利用动态信息推断超出分辨率极限的结构与组织特征的有力工具”。然而，我们仍需发展新的模型以优化对扩散定律的解释，从而更深入地理解细胞质膜上分子事件的动力学过程。

质膜结构的复杂性 
目前对细胞膜结构的理解需要考虑多个方面1。首先，复杂的脂质组成不仅在不同细胞类型之间存在差异，即使在同一细胞内（如膜性细胞器与质膜之间）也各不相同。此外，膜相关或内在膜蛋白通常以动态的多聚体复合物形式存在，其大分子结构域延伸至膜外，所占面积显著大于仅由跨膜结构域所占据的区域。同时，膜相关蛋白表现出特异性的脂质结合或脂质相互作用能力，在调控蛋白质功能中发挥重要作用。这些作用直接依赖于局部脂质的组成及其可及性2。
最后，由于膜蛋白的内在不对称结构以及脂质的分布，细胞膜的两个脂双层之间表现出显著的不对称性。事实上，脂质合成与水解之间的代谢平衡，加上脂质在两个单层之间的翻转运动，导致了这种不对称分布。由于极性头部基团穿过膜的疏水内部需要克服较高的自由能障碍，任何跨双分子层的运输通常都需要特异性转运蛋白的协助。对于每种细胞类型而言，这种不对称性往往被严格维持。总体而言，这些因素共同导致了质膜的侧向不均一性或区室化3,4。
通过考虑双分子层内部及跨双分子层的固有分子扩散，我们进一步丰富了质膜的这一表征。这种扩散导致了尺度在数十至数百纳米、时间在微秒至秒范围内的动态侧向异质性。例如，依赖脂质的膜纳米结构域——即所谓的脂筏，被定义为富含胆固醇和鞘脂类的信号平台——有助于质膜的空间区室化5,6。然而，当前对膜结构的认识并不仅限于脂筏。膜纳米结构域在组成、来源和功能上更为复杂且具有异质性。尽管如此，这些结构域在质膜上的存在必须受到严密调控，而蛋白质与脂质之间的动态相互作用似乎在膜纳米结构域的空间分布和化学修饰过程中起着重要作用1,3,7,8。
svFCS 原理及其在研究质膜组织结构中的应用 
尽管在膜结构域分析方面已取得显著进展，主要得益于生物物理技术的发展，但对决定质膜局部组织特性的因素仍需在适当的空间和时间分辨率下进一步明确。基于单分子追踪的方法可提供优异的空间精度，并能表征多种运动模式9,10,11,12，但在传统低相机帧率下时间分辨率有限，且需要更多的实验投入以获取足够数量的轨迹数据。另一种方法是通过光漂白后荧光恢复（FRAP）13 或荧光相关光谱（FCS）14 来评估膜组分的扩散系数。其中，FCS 受到更多关注，主要因其具有高灵敏度和选择性、显微检测体积小、侵扰性低以及宽广的动态范围15。
荧光相关光谱（FCS）的概念基础由Magde及其同事约50年前提出16,17。该技术基于以高时间分辨率（从µs到s）记录荧光发射的波动18。在其现代版本中，通过将一个小的共聚焦激发体积（约0.3飞升）定位在感兴趣区域（例如质膜处）来进行活细胞内的测量；扩散中的荧光分子进出观测体积时产生的荧光信号以极高的时间分辨率被采集（即记录每个光子到达探测器的时间）。随后，对信号进行计算以生成自相关函数（ACF），从中可提取出分子在焦体积内停留的平均时间td（扩散时间），以及观测体积内存在的平均粒子数（N），后者与ACF的振幅成反比。最后一个参数可能提供有关观测体积内分子浓度的重要信息。
此后，得益于生物光子学领域仪器的快速发展，越来越多的FCS技术被实现，使得能够描述生命系统中发生的动态现象。然而，分子种类的扩散系数值分布往往更加重叠，通常表现为反常扩散特征，即分子的扩散与时间呈非线性关系19，并且难以阐明这种反常亚扩散的生物学意义。过去，这一难题通过在不同大小的区域而非单一区域进行FRAP分子扩散记录而得到一定程度的解决，从而提供了额外的空间信息。例如，这使得膜微区的概念得以建立20,21,22。
将该策略应用于FCS测量（即所谓的焦点尺寸可变荧光相关光谱法，svFCS），通过改变观测焦点体积的大小，可在不同空间尺度上记录荧光强度的波动23。因此，svFCS方法可提供间接的空间信息，用于识别和确定被研究分子的扩散模式以及膜区室化类型（孤立区室与连续区室24）。通过绘制扩散时间td随由束腰（ω）值定义的不同空间尺度的变化关系，其中束腰值在此情况下对应检测光束的半径大小23,25，即可表征特定分子在特定生理条件下的扩散规律。因此，svFCS在时间域中是单粒子追踪技术的理想对应方法26。在布朗扩散约束下，扩散时间td与束腰ω之间应呈现严格的线性关系（图1）23,25。偏离该线性关系的扩散规律可能源于多种非排他性因素，例如细胞骨架网格结构、分子拥挤效应、在纳米区室中的动态分区，或这些因素与其他效应的组合（图1），这些均需通过实验加以验证25。
本文提供了从零开始自行搭建的定制化小体积荧光相关光谱（svFCS）光学系统在日常使用中所需的所有必要控制检查点，以补充我们此前关于该实验方法的协议综述27,28。此外，作为概念验证，我们给出了该系统校准、细胞制备、数据采集与分析的操作指南，用于建立Thy1-GFP（一种定位于脂筏纳米结构域的质膜糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白）的svFCS扩散定律（DL）29。最后，我们展示了通过胆固醇氧化酶处理部分破坏脂筏纳米结构域后，Thy1-GFP扩散特性所发生的变化。另外，从零开始构建svFCS系统的详细说明见于补充材料中。

<table><tbody><tr><td>校准工具</td><td>SM1螺纹卡环用拨片扳手</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>雪崩光电二极管与单光子计数模块（SPCM）</td><td>单光子计数模块，雪崩光电二极管</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &amp;Omega; 插头转 50 &amp;Omega; 插头连接线，2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>同轴电缆 415 Cinch 连接器，RG-316，50 &amp;Omega;，带连接器，1.22 m，RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>T型 50&amp;Omega; RF适配器，BNC插头转BNC插座，0 &amp;rarr; 1GHz</td><td>RS Components</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 m，8插口，E型 &amp;ndash; 法式延长电源线，230 V</td><td>RS Components</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot，6W 插入式电源适配器，5V 直流，1.2A，单路输出开关电源，C型</td><td>RS Components</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 参考振荡器电源线 RF适配器</td><td>RS Components</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>荧光滤光</td><td>535/70 ET带通滤光片，AOI 0&amp;deg;，Chroma，直径25 mm</td><td>AHF filter</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>激光分束器 zt488 RDC，AOI 45&amp;deg;，Chroma，25.5 x 36 x 1 mm</td><td>AHF filter</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC长波通滤光片，AOI 0&amp;deg;，Chroma，直径25 mm</td><td>AHF filter</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>硬件相关器</td><td>80 MHz 数字相关器</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>激光器</td><td>LASOS LDM-XT 光纤耦合激光器，488 nm，65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>激光安全</td><td>高性能黑色遮蔽胶带，1&quot; x 180英尺（25 mm x 55 m）卷</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>镜头纸，每本25张，共5本</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>激光防护眼镜，浅橙色镜片，可见光透过率48%</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>蔡司Axiovert 200M 电动倒置荧光显微镜&lt;br/&gt; 具备精细与粗调焦、反射镜转盘旋转、物镜转盘旋转、相机端口切换及内置光源快门功能</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1.2 W Korr.，用于FCS&lt;br/&gt;（D=0.14–0.19 mm）（D=0.17 mm时工作距离WD=0.28 mm），适用于紫外-可见-红外波段</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>适配器 W0.8 / M27x0.75 H &quot;5&quot;</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>中环 W0.8 - W0.8 H &quot;5&quot;</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>光路组件</td><td>直径25.4 mm，保护银膜反射镜</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>直径25.4 mm，焦距60.0 mm，可见光消色差透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>直径25.4 mm，焦距35.0 mm，可见光消色差透镜</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &amp;micro;m 安装式针孔</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4 mm 安装式零级半波片，488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20 mm 偏振分束立方体，420–680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>旋转台，内螺纹直径56 mm x 26 mm</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm 运动学平台支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>可调棱镜夹具</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>光束挡板，有效区域19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>虹膜光阑，孔径1 mm 至 25 mm</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>左手运动学柱面透镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>1&quot; 光学元件安装座，M4螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1&quot; 可堆叠透镜管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>可堆叠透镜支架，适用于1&quot;光学元件，可用深度&amp;frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>可堆叠透镜支架，适用于1&quot;光学元件，可用深度2&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>小型光学导轨，600 mm，公制</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>小型光学导轨，75 mm，公制</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>小型光学导轨，150 mm，公制</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>导轨载具，沉头孔1&quot; x 1&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>导轨载具，垂直燕尾槽</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>高精度1英寸平移透镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&amp;frac12; &quot;（12 mm）燕尾平移台</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>导轨夹具</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>公制XYZ平移台（含PT102）</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>黑色橡胶化织物</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>球头螺丝工具套件，共6件</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>带外螺纹M6 x 1.0和外螺纹M4 x 0.7的适配器</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>安装底座，25 mm x 58 mm x 10 mm，5件装</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>25.4 mm 光学元件透镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC 适配器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>1英寸光学元件运动学反射镜支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>硅光电探头，400–1100 nm，50 mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm 支杆固定座，带弹簧加载六角锁紧旋钮，&lt;br/&gt; 长度50 mm，5件装</td><td>Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>带弹簧加载六角锁紧旋钮的支杆固定座，长度20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 50 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱，&lt;br/&gt; M6螺纹孔，5件装</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 75 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱，&lt;br/&gt; M6螺纹孔，5件装</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>USB功率与能量计接口</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 30 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱，&lt;br/&gt; M6螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 20 mm 不锈钢光学支杆，M4螺柱，&lt;br/&gt; M6螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 mm 长结构导轨（检测箱）</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>350 mm 长结构导轨（检测箱）</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>25 mm 导轨用快速直角棱镜</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>25 mm 导轨用直角支架</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>黑色卡纸，20&quot; x 30&quot;（508 mm x 762 mm），1/16&quot;（1.6 mm）厚，5张</td><td>Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>25 mm 导轨外壳用铰链</td><td>Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>25 mm 导轨外壳用盖板限位器</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 内六角螺钉套件</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 内六角螺钉套件及五金套件</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>桌夹，L型，5件装</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1环控虹膜光阑（&amp;Oslash;0.8 - &amp;Oslash;12 mm）</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&amp;Oslash;1&quot; SM1安装式磨砂玻璃校准盘，带&amp;Oslash;1 mm 孔</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>蜂窝结构光学平台台面，Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>光学平台支撑架，Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>样品纳米定位</td><td>高精度XYZ纳米定位系统</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>数字多通道压电控制器，3通道，-30 至 130 V&lt;br/&gt; 带Sub-D连接器，电容传感器</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>温控腔室</td><td>蔡司200M倒置显微镜培养系统 MATT BLK</td><td>Digital Pixel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>双通道微处理器温度控制器</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>两个无振动加热模块</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 温度传感器</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;生物试剂与材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养与转染</td><td>Cos7细胞</td><td>ATCC&amp;reg;</td><td>CRL-1651&amp;trade;</td></tr><tr><td></td><td>8孔Lab-Tek培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>PBS缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>青霉素-链霉素溶液（PenStrep）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet转染试剂</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>胆固醇含量测定</td><td>Amplex Red 胆固醇检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>磷酸酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant 工作液</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover 微孔板读板仪</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS测量</td><td>HBSS缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>HEPES缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>胆固醇氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>罗丹明6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

用于活细胞质膜分子扩散分析的斑点变异荧光相关光谱法

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

活细胞中的动态生物学过程，包括与质膜结构相关的各种过程，发生在不同的空间和时间尺度上，分别从纳米到微米、微秒到分钟不等。如此广泛的生物学过程对传统的显微镜技术提出了挑战。本文详细描述了如何在一台经过定制的经典荧光显微镜上实施斑点变异荧光相关光谱（svFCS）测量的操作步骤。该方案包括svFCS系统特定的性能检测，以及在生理条件下利用svFCS对活细胞质膜上分子扩散进行测量的操作指南。此外，我们还提供了一种通过胆固醇氧化酶处理破坏质膜筏状纳米结构域的方法，并展示了svFCS分析如何揭示质膜侧向结构的这些变化。总之，这种基于荧光的方法能够以适当的空间和时间分辨率，前所未有地揭示质膜侧向组织的精细细节。

我们在表达 Thy1-GFP 的 Cos-7 细胞中生成了扩散定律（图4，黑色方块）。该扩散定律具有正的 t0 值（19.47 ms ± 2 ms），表明 Thy1-GFP 被限制在细胞质膜的纳米结构域中。对表达 Thy1-GFP 的细胞进行胆固醇氧化酶处理后，扩散定律的 t0 值移至 7.36 ± 1.34 ms（图4，灰色方块）。该结果证实 Thy1-GFP 的限制特性依赖于胆固醇含量，并与脂筏纳米结构域相关。根据上述统计检验方法（见步骤 9.1.3），这两种扩散定律在 t0 和 Deff 值上均表现出显著差异。此外，我们检测了未经处理的 Cos-7 细胞与经 COase 处理细胞中总细胞胆固醇的浓度。COase 处理后，总胆固醇含量出现轻微但显著的下降（图5）。由于该酶仅作用于质膜外小叶可接触的胆固醇池，我们推断所观察到的胆固醇减少仅与质膜相关，并导致脂筏纳米结构域的不稳定。
<img alt="扩散分析示意图；方程与图形显示停留时间与光斑面积的关系；显微镜方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：通过光斑尺寸变化荧光相关光谱法（spot-variation FCS）模拟建立的不同膜组织形式下的荧光相关光谱（FCS）扩散定律。（上图）膜组织的示意图——（A）自由扩散，（B）网格状屏障，以及（C）陷阱/结构域限制——其中绘制了一条单个分子的运动轨迹（红色）。蓝色圆圈表示膜与腰径为 ω 的激光束的交界面。（下图）FCS扩散定律通过将扩散时间 td 对光斑半径的平方 ω2 作图表示。扩散定律的投影（绿色虚线）在时间轴上的截距分别为：（A）原点处（t0 = 0），对应自由扩散情况；（B）负半轴（t0 &lt; 0），对应存在网格状屏障的情况；或（C）正半轴（t0 &gt; 0），对应存在陷阱或结构域（脂筏）的情况。D 为布朗运动的侧向扩散系数；Deff 为有效扩散系数；Dmicro 为网格陷阱内部的微观扩散系数；Din 为结构域内部的扩散系数；Dout 为结构域外部的扩散系数；L 为方形结构域边长；rD 为圆形结构域的半径。本图改编自 He 和 Marguet6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜装置示意图，包含计算机、DAQ系统、APD/SPCM、相关器；用于荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：svFCS硬件控制的示意图。 计算机通过不同的通信协议控制所有设备：串行接口（显微镜、外部快门）、USB（XYZ压电平台、相关器）和PCI（采集板）。DAQ：数据采集板，APD：雪崩光电二极管，SPCM：单光子计数模块，DO：数字输出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="488nm 激光器、光路、相关器、APD 探测器、成像系统的光路示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：svFCS 装置的激发与发射光路示意图。 svFCS 装置包含四个模块：（1）光纤输出的 488 nm 激光经准直处理；（2）通过半波片与偏振分束器组合调节光功率；（3）激光束经由无管镜的电动显微镜聚焦至样品；（4）荧光信号通过类似共聚焦的检测光路，由雪崩光电二极管（APD）探测，该探测器连接单光子计数模块，并将信号传输至硬件相关器。该系统的简洁性使其具备高灵敏度、高稳定性和操作便捷性（详见补充材料中的广泛讨论）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="扩散过程图，方程：T 对 D_eff，比较 NT 和 COase 扩散时间的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：由表达 Thy1-GFP 的 Cos-7 细胞扩散分析生成的 svFCS 扩散定律。未经处理的 Cos-7 细胞（NT，黑色方块）和经胆固醇氧化酶处理后的 Cos-7 细胞（COase，灰色圆圈）的 svFCS 扩散定律。图中插图表示对所展示的两条 svFCS 扩散定律之间是否存在显著差异进行的统计检验（依据 Mailfert 等人28）。当两条扩散定律不同时，检验值（T）应高于设定为 3.8 的阈值；该值越高，表明两条扩散定律之间的差异越大。T 值以颜色编码显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胆固醇降低柱状图；NT与COase处理对比；统计学显著性；生物化学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：Cos-7细胞中总胆固醇含量的比较。Cos-7细胞未经处理（NT）或经1 U/mL胆固醇氧化酶（COase）处理1小时。数据代表一次实验的三复孔示例。采用双尾非配对t检验评估统计学差异（α=0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
材料列表： svFCS 实验装置所需的光学元件清单。
补充材料：本文档介绍了从零开始搭建svFCS装置的过程。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文旨在介绍一种构建点变异荧光相关光谱（svFCS）显微镜的实验方案，用于测量活细胞质膜上分子的扩散行为。

活细胞中包括质膜组织在内的动态生物过程，在不同的空间和时间尺度上发生，……

目前对质膜侧向组织结构的认识仍不完整。因此，有必要引入一些新的创新性技术，例如斑点变异荧光相关光谱法。该技术具有优异的时间和空间分辨率，是一种非常强大的分析方法。此外，该方法具有非侵入性，能够在生理条件下研究细胞膜。每次实验前，打开所有虹膜光圈，并使用功率计在第一个光圈完全打开时测量激光功率。调节半波片以获得最大功率。如果激光功率低于正常水平，使用光圈检查光路准直，并根据需要交替调整L1和M1。然后在实验记录本中记录功率值。为检查检测光路，将水、盖玻片以及一滴2纳摩尔的罗丹明6G溶液置于物镜上。然后启动相关器软件并记录数据。自相关函数应显示较低的噪声水平、较小的滞留尺寸以及较高的每秒每分子计数率。为校准光斑尺寸，将一个标有编码的细胞培养盖玻片置于水浸物镜上，并在盖玻片上加入 200 µL 的 2 nM 罗丹明 6G 溶液。将488纳米激光束功率调节至300微瓦，并在软件中选择svFCS照明检测显微镜端口。打开APD并逐渐打开虹彩光圈直至信号下降，以获得最小的废光尺寸；若需更大的废光尺寸，则关闭光圈。记录约10段20秒的自相关函数，以提高统计重复性，然后关闭APD。在合适的数据分析程序中，检查并剔除因分子聚集体导致剧烈波动的测量数据，然后使用三维扩散模型拟合保留的平均自相关函数，从拟合参数中提取平均扩散时间，并将数据保存为 TXT 文件。进行 svFCS 分析时，将 488 纳米激光束功率调节至 2 到 4 微瓦之间，并在 37 摄氏度下使样品平衡 10 分钟。选择 svFCS 照明检测显微镜端口，并连接至 APD。接下来，对选定的细胞进行 XY 扫描和 Z 扫描。选择细胞顶部的质膜，将共聚焦光斑定位在荧光强度最大的位置，然后开始数据采集。在相关软件中，记录一组 20 次、每次 5 秒的运行数据。最后一次运行结束后，关闭APD，并按演示方法丢弃任何异常的运行数据。使用双组分二维扩散模型拟合平均自相关函数，并将拟合参数保存到先前保存的TXT文件中。当所有目标细胞均完成记录后，分析至少四种不同尺寸的废物颗粒，其尺寸范围在200至400纳米之间，以建立单一的扩散规律。然后在 MATLAB 中，选择一个包含至少四个废物尺寸实验对应的所有 TXT 文件的文件夹，绘制扩散时间与废物尺寸平方的关系图。在此图中，可以观察到在 Cos7 细胞中表达的 Thy1-GFP 的扩散规律。该扩散规律在时间零点具有正值，表明 Thy1-GFP 被限制在细胞质膜的纳米结构域内。在此分析中，经胆固醇氧化酶处理表达 Thy1-GFP 的细胞后，扩散定律在时间零点的值转变为 7.36 ± 1.34 毫秒，证实 Thy1-GFP 的受限特性依赖于胆固醇含量，并与脂筏纳米结构域相关。胆固醇氧化酶处理后，总胆固醇含量也出现了轻微但显著的下降。由于该酶仅作用于质膜外小叶可及的胆固醇池，这些数据表明所观察到的胆固醇减少仅与质膜相关，并导致脂筏纳米结构域的不稳定。进行此操作时最重要的环节是svFCS系统的正确校准以及用于分析的细胞制备。svFCS是研究细胞膜结构的极佳工具。然而，该技术也可用于分析细胞内分子的扩散。在生物医学领域，该技术可成功应用于确定潜在药物对活细胞（如癌细胞）的影响。

spot-variation-fluorescence-correlation-spectroscopy-for-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

点变异荧光相关光谱用于分析活细胞质膜上的分子扩散

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利用荧光相关光谱法（FCS）测定活细胞中荧光标记探针在脂筏中的分布

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利用荧光涨落光谱研究细胞接触处的蛋白质相互作用

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利用k空间图像相关光谱法简便测量EGFP标记的质膜蛋白扩散系数

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利用荧光相关光谱法测定原代淋巴细胞质膜中的分子扩散

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利用石英振荡器通过耗散型微重力测定法研究磷脂结合蛋白Annexin A2与固相支撑脂双层的结合动力学

学习点变异荧光相关光谱技术，用于活细胞质膜分子扩散分析。该方法具有高时空分辨率且非侵入性，可研究胆固醇对膜脂筏稳定性的影响，适用于细胞生物学和神经科学研究。

用于活细胞质膜分子扩散分析的斑点变异荧光相关光谱法

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