用于活细胞质膜分子扩散分析的斑点变异荧光相关光谱法

目前对质膜侧向组织结构的认识仍不完整。因此，有必要引入一些新的创新性技术，例如斑点变异荧光相关光谱法。该技术具有优异的时间和空间分辨率，是一种非常强大的分析方法。

此外，该方法具有非侵入性，能够在生理条件下研究细胞膜。每次实验前，打开所有虹膜光圈，并使用功率计在第一个光圈完全打开时测量激光功率。调节半波片以获得最大功率。

如果激光功率低于正常水平，使用光圈检查光路准直，并根据需要交替调整L1和M1。然后在实验记录本中记录功率值。为检查检测光路，将水、盖玻片以及一滴2纳摩尔的罗丹明6G溶液置于物镜上。

然后启动相关器软件并记录数据。自相关函数应显示较低的噪声水平、较小的滞留尺寸以及较高的每秒每分子计数率。为校准光斑尺寸，将一个标有编码的细胞培养盖玻片置于水浸物镜上，并在盖玻片上加入 200 µL 的 2 nM 罗丹明 6G 溶液。

将488纳米激光束功率调节至300微瓦，并在软件中选择svFCS照明检测显微镜端口。打开APD并逐渐打开虹彩光圈直至信号下降，以获得最小的废光尺寸；若需更大的废光尺寸，则关闭光圈。记录约10段20秒的自相关函数，以提高统计重复性，然后关闭APD。

在合适的数据分析程序中，检查并剔除因分子聚集体导致剧烈波动的测量数据，然后使用三维扩散模型拟合保留的平均自相关函数，从拟合参数中提取平均扩散时间，并将数据保存为 TXT 文件。进行 svFCS 分析时，将 488 纳米激光束功率调节至 2 到 4 微瓦之间，并在 37 摄氏度下使样品平衡 10 分钟。选择 svFCS 照明检测显微镜端口，并连接至 APD。

接下来，对选定的细胞进行 XY 扫描和 Z 扫描。选择细胞顶部的质膜，将共聚焦光斑定位在荧光强度最大的位置，然后开始数据采集。在相关软件中，记录一组 20 次、每次 5 秒的运行数据。

最后一次运行结束后，关闭APD，并按演示方法丢弃任何异常的运行数据。使用双组分二维扩散模型拟合平均自相关函数，并将拟合参数保存到先前保存的TXT文件中。当所有目标细胞均完成记录后，分析至少四种不同尺寸的废物颗粒，其尺寸范围在200至400纳米之间，以建立单一的扩散规律。

然后在 MATLAB 中，选择一个包含至少四个废物尺寸实验对应的所有 TXT 文件的文件夹，绘制扩散时间与废物尺寸平方的关系图。在此图中，可以观察到在 Cos7 细胞中表达的 Thy1-GFP 的扩散规律。该扩散规律在时间零点具有正值，表明 Thy1-GFP 被限制在细胞质膜的纳米结构域内。

在此分析中，经胆固醇氧化酶处理表达 Thy1-GFP 的细胞后，扩散定律在时间零点的值转变为 7.36 ± 1.34 毫秒，证实 Thy1-GFP 的受限特性依赖于胆固醇含量，并与脂筏纳米结构域相关。胆固醇氧化酶处理后，总胆固醇含量也出现了轻微但显著的下降。

由于该酶仅作用于质膜外小叶可及的胆固醇池，这些数据表明所观察到的胆固醇减少仅与质膜相关，并导致脂筏纳米结构域的不稳定。进行此操作时最重要的环节是svFCS系统的正确校准以及用于分析的细胞制备。svFCS是研究细胞膜结构的极佳工具。

然而，该技术也可用于分析细胞内分子的扩散。在生物医学领域，该技术可成功应用于确定潜在药物对活细胞（如癌细胞）的影响。