一种多信号生物反应器，用于在流动和拉伸条件下评估生物材料的炎症反应与再生能力

迄今为止，确定血流动力学与血管组织再生之间的因果关系一直非常困难，其原因在于难以独立控制各种机械负荷。该生物反应器使我们能够从机制上深入研究剪切应力和周期性拉伸对多种组织工程血管移植物再生潜力的单独及联合作用。

本实验操作将由本课题组的博士研究生 Suzanne Koch 和本实验室的博士后研究员 Dr. Tamar Wissing 演示。将静电纺丝支架固定到硅胶管上时，需将一根 4-0 Prolene 缝合线从一段硅胶管的一端穿入，从另一端穿出。

在管子两侧各打一个小结，每个结保留约10厘米的线头，然后在两个结上方再打第三个结。移除缝合针后，将硅胶管的边缘修剪成三角形，并在两根10厘米长的线头末端打一个最终结。将静电纺丝支架浸入30%乙醇中，然后将其放置在游离缝合线一端的上方。

接下来，由第二位研究人员使用内尖端光滑的镊子，轻轻将静电纺丝支架滑过导管，同时小心拉伸硅胶管的两端以及10厘米长的缝合结。在缓慢释放硅胶管的拉伸张力的同时，用镊子将静电纺丝支架抚平。随后将支架和硅胶管浸入超纯水中两次。

组装底部腔室，并确保O形圈正确安装。将一个适配衬套放入底部腔室的上部，然后将带孔的加压导管穿过底部腔室。将硅胶O形圈缠绕在加压导管的下端，以防止泄漏。

将底部隔室的下部拧紧到底部隔室的上部，以固定压力导管。确保压力导管的下部刻痕凹槽位于底部隔室适配器套管边缘上方约三至五毫米处。将带有电纺支架的硅胶管拉过压力导管，并在电纺支架的下端、压力导管刻痕凹槽位置处打结并固定缝合金属丝。

在对侧再次打结，以将硅胶管与电纺移植物紧密固定。将带有刻度的剪刀夹置于硅胶管的上端，以稳定的方式向上拉动剪刀夹，同时轻轻牵拉电纺支架，以去除任何皱褶。使用缝合丝线在压力导管上端的刻痕凹槽处，于支架两端各打两个结。

打好两个结后，松开剪刀夹，并使用刀片切除多余的硅胶管。将鼻锥拧到需要进行动态加载的样品的压力导管螺纹上。将压力导管、管路和支架在30%乙醇中浸润一次，再在超纯水中浸润两次，以预湿装置。

将玻璃管套在压力导管上，并轻轻按压底部腔室，以固定玻璃管。然后将流动整直器、硅胶O形圈和接头衬套放入顶部腔室，并将该腔室固定在玻璃管的开口端。

在无菌层流柜中操作，从流出端取下雄性引诱剂塞，打开白色引诱剂帽，并在流出端前方放置一块经乙醇浸泡的擦拭纸。通过取下顶部腔室的玻璃管，拆卸流式培养室。

将真空移液管置于电纺支架上，尽可能吸除培养基。然后按1:1的比例加入含凝血酶的细胞悬液和纤维蛋白原溶液。轻轻吹打混合液一次，并立即沿支架全长滴加该溶液。

当所有细胞接种完成后，缓慢地左右、上下移动支架，以实现细胞的均匀分布。当支架两侧均完成接种后，小心地将玻璃管和上部腔室重新安装，复原灌注培养室。然后将灌注培养室放入培养箱中，使纤维固化。

将流动培养室放置在生物反应器底座的八个螺纹之一上，以将生物反应器与泵系统连接。将接头夹安装在培养基管路上。取下覆盖流动培养室上部隔室流体入口的白色螺口帽，并取下培养基管路的雌性螺口接头。

将中段管路的一端连接到上部隔室的流体入口，另一端连接到下部隔室的流体出口。将完整的装置从超净工作台转移至培养箱中。

将流体单元和生物反应器底座连接至气压管路和电源线。启动软件并初始化泵。依次为各个样品启动培养基流动。

然后将应变泵参数调整至所需设置，并开始施加应变。每隔一天监测一次支架所受的拉伸程度。长期培养期间对拉伸和壁面剪切应力的监测表明，这些数值可在长达20天的时间内维持在相对恒定的水平。

经过三天的血流动力学负荷后，免疫荧光染色显示单核细胞来源的巨噬细胞和肌成纤维细胞在支架内呈均匀分布。经过20天的共培养，周期性拉伸导致Ⅰ型胶原纤维的数量增多且更粗。而在联合血流动力学负荷组中，周期性拉伸的作用被剪切应力所掩盖，导致Ⅰ型胶原沉积不明显。

经过八天的巨噬细胞单培养后，在所有血流动力学负荷条件下均观察到纤维侵蚀和纤维断裂现象，其中静态组的吸收最为显著，而剪切应力组的吸收最不明显。循环拉伸和剪切应力均会影响共培养体系中细胞因子的分泌谱。有趣的是，两种负荷的联合作用表现出其中一种负荷占主导，或两种负荷产生协同效应。

共培养实验还表明，机械环境及由此产生的负荷依赖性炎症环境可调节肌成纤维细胞的表型。此外，收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白的基因表达模式与蛋白质合成相关。执行本方案时最重要的是施加拉伸力，此时必须确保装置系统无泄漏。