通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

该方法能够生成具有特定翻译后修饰、且组装能力均一的纯化微管蛋白，产量足以进行完整的体外实验。本方案基于微管蛋白聚合与去聚合循环，可在任何细胞生物学实验室中简便操作，仅需极少的动手操作时间即可获得较大量的微管蛋白。

为了从悬浮培养物中纯化微管蛋白，在微管蛋白制备前九天，复苏并扩增所需细胞类型，以获得六个汇合的15厘米培养皿。在微管蛋白制备前八天，在细胞培养柜中向每个培养皿对应的搅拌瓶中加入一升预热的培养基，并将搅拌瓶置于细胞培养孵育箱内的搅拌台上。将搅拌瓶的侧向瓶盖略微打开，使培养基与孵育箱内的气体环境达到平衡。

第二天，使用汇合培养皿中的细胞接种旋转瓶。将旋转瓶放回培养箱中培养一周，期间保持侧向阀门微开。收集细胞时，将培养物从旋转瓶转移至一升的离心管中，通过离心收集细胞。

将每个沉淀重悬于10毫升预冷的PBS中，并将重悬的细胞汇集至一个50毫升离心管中，在4摄氏度下离心。对于10毫升的细胞沉淀，向沉淀中加入10毫升裂解缓冲液，反复倒置离心管数次以重新悬浮细胞。为从贴壁细胞培养物中纯化微管蛋白，需复苏并扩增目标细胞类型，以便在微管蛋白制备当天获得10个汇合的15厘米培养皿。

为收获贴壁细胞，每次处理三皿，倾斜培养皿以去除培养基，同时由另一人用七毫升 PBS-EDTA 轻柔洗涤细胞。洗涤后，同一人应向每皿加入五毫升 PBS-EDTA 处理细胞，随后由第三人使用细胞刮棒将细胞轻柔地推至培养皿的一侧边缘。待细胞完全脱落时，将三皿中的细胞悬液汇集至一个预冷的 50 毫升离心管中，并用额外两毫升 PBS-EDTA 冲洗每块培养皿，以收集残留的细胞。

离心收集细胞后，弃去上清液以确定细胞沉淀的体积。加入裂解缓冲液，重悬细胞，并将其转移至14毫升圆底管中。超声处理细胞约45次脉冲。

对于小鼠脑组织裂解，向一只成年小鼠分离出的单个脑组织中加入500微升授权缓冲液，并使用组织匀浆器裂解组织。获得裂解液后，取其体积的1/100与等体积的2×Laemmli缓冲液混合，将溶液煮沸5分钟。在定量前于-20摄氏度保存。

在微管蛋白制备的每一步均以此方式收集样品。为澄清裂解液，将样品离心，并使用长针头小心地将澄清的上清液转移至新离心管中，注意避免接触上层漂浮物。裂解液澄清后，必须去除上清液中的漂浮物质，否则可能对微管蛋白纯化的效率产生不利影响。

为了从澄清的裂解液中聚合微管蛋白，将上清液一的全部体积与1/200体积的0.2摩尔GTP以及半体积的温热甘油在适当大小的试管中混合。轻轻吹打混匀，注意避免引入气泡。用封口膜密封试管，并置于30摄氏度水浴中孵育20分钟。

离心后，将上清液转移至新离心管中。为使沉淀中的微管解聚，将沉淀重悬于冰上预冷的BRB 80缓冲液中，冰上孵育5分钟。在冰上孵育的20分钟内，每隔5分钟先用P1000移液器吹打样品，再用P200移液器吹打一次。

待样品均一后，离心并转移上清液至新离心管中。为去除微管相关蛋白，将上清液全部与等体积预热的1摩尔Pipe缓冲液、等体积预热的甘油以及1/100体积的0.2摩尔GTP混合。30摄氏度孵育20分钟，随后进行离心。

将含有微管相关蛋白的上清液转移至新离心管中，沉淀物含有聚合的微管。经过第三次聚合与去聚合操作后，可通过SDS-PAGE分析定量所收获的微管蛋白量。纯化过程是否成功可通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE结果进行确认。

纯化微管蛋白的得率低于预期可能是由于微管蛋白聚合效率低下所致，这可通过第二次、第四次和第六次沉淀组分中微管蛋白含量较低，而第二次、第四次和第六次上清组分中含量较高来证实。为定量纯化的微管蛋白，可将样品与已知量的牛血清白蛋白并列电泳。随后通过蛋白质条带的定量密度测定，即可计算出纯化微管蛋白的量。

可以通过对样品进行免疫印迹分析来确认微管蛋白的修饰状态。我们的方案能够分离出具有可控翻译后修饰的微管蛋白。利用这种微管蛋白，我们可以建立体外重建实验，以确定微管蛋白修饰对微管特性及其与微管相关蛋白相互作用的影响。