Name: 通过聚合-去聚合周期，通过有限来源的受控后翻译修改和异种型对图布林进行净化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学习利用聚合-去聚合循环从有限来源纯化微管蛋白的方法，该方法可生成具有特定翻译后修饰的纯化微管蛋白，适用于体外重建实验研究微管动力学与相互作用。

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本工作由 ANR-10-IDEX-0001-02、LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 以及 Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 资助。CJ 得到居里研究所、法国国家科研署（ANR）项目 ANR-12-BSV2-0007 和 ANR-17-CE13-0021、法国国家癌症研究院（INCA）资助 2014-PL BIO-11-ICR-1 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 DEQ20170336756 的支持。MMM 得到战胜阿尔茨海默病基金会（Fondation Vaincre Alzheimer）资助 FR-16055p 以及法国阿尔茨海默病基金会（France Alzheimer）资助 AAP SM 2019 n°2023 的支持。JAS 得到欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No 675737 以及法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201904008210 的支持。SB 得到法国医学研究基金会（FRM）资助 FDT201805005465 的支持。
我们感谢 Janke 实验室的所有成员，特别是 J. Souphron，以及 G. Lakisic（Institut MICALIS，AgroParisTech）和 A. Gautreau（Ecole Polytechnique）在本实验方案建立过程中提供的帮助。我们还要感谢居里研究所动物实验中心在小鼠繁育与饲养方面给予的支持。
抗体12G10由J. Frankel和M. Nelson研制，购自美国国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助建立、由爱荷华大学维护的发育研究杂交瘤库。

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<li>Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+the+motility+of+isolated+intracellular+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes.</a> Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).</li>
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<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li>
<li>Minoura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression%2C+purification%2C+and+functional+analysis+of+recombinant+human+tubulin+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer.</a> FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).</li>
<li>Uchimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flipped+ion+pair+at+the+dynein-microtubule+interface+is+critical+for+dynein+motility+and+ATPase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).</li>
<li>Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structured+core+of+human+beta+tubulin+confers+isotype-specific+polymerization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties.</a> Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).</li>
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<li>Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-tubulin+isotypes+can+regulate+microtubule+protofilament+number+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability.</a> Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).</li>
<li>Souphron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+tubulin+with+controlled+post-translational+modifications+by+polymerization-depolymerization+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles.</a> Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).</li>
<li>Barisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+detyrosination+guides+chromosomes+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis.</a> Science. 348 (6236), 799-803 (2015).</li>
<li>Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tubulin+tyrosination+and+CLIP-170+phosphorylation+regulate+the+initiation+of+dynein-driven+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons.</a> Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).</li>
<li>Guedes-Dias, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+responds+to+local+microtubule+dynamics+to+target+synaptic+cargo+delivery+to+the+presynapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse.</a> Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).</li>
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<li>Even, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAT1-enriched+vesicles+promote+microtubule+acetylation+via+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport.</a> Science Advances. 5 (12), 2705(2019).</li>
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<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylase+enzymes+are+members+of+the+TTL+domain+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family.</a> Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).</li>
<li>Newton, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+slow+dynamic+instability+of+HeLa+cell+microtubules+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).</li>
<li>Belvindrah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+alpha-tubulin+Tuba1a+leads+to+straighter+microtubules+and+perturbs+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration.</a> Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).</li>
<li>Breuss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+murine+homologue+of+TUBB5+cause+microcephaly+by+perturbing+cell+cycle+progression+and+inducing+p53+associated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis.</a> Development. , (2016).</li>
<li>Latremoliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal-specific+TUBB3+is+not+required+for+normal+neuronal+function+but+is+essential+for+timely+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration.</a> Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).</li>
<li>Morley, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylated+tubulin+is+essential+for+touch+sensation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice.</a> Elife. 5, (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法提供了一个平台，可从细胞系和单个小鼠脑组织中快速制备中等到较大量、具有组装能力的高质量微管蛋白。该方法基于多年来在该领域广泛使用的牛脑微管蛋白纯化金标准方案16,17。该方法的一个显著优势是采用HeLa S3细胞的悬浮培养体系，一旦建立，可在较少人工操作的情况下获得大量细胞。这使得该方案在任何细胞生物学实验室中都相对容易实施；而其他微管蛋白纯化方法18,19,32,37则需要特定设备和技术专长，因此主要由具备较强蛋白质纯化背景的实验室使用。当从贴壁细胞系制备较少量微管蛋白时，可使用多种不同的细胞系。我们已成功从HeLa、U-2 OS和HEK-293细胞中纯化出微管蛋白。若需进行更大规模的纯化，可将收获的细胞或脑组织在裂解缓冲液中速冻，并于-80 °C保存，...

微管在多种细胞过程中发挥着关键作用。它们赋予细胞形态，构建减数分裂和有丝分裂过程中用于染色体分离的纺锤体，并作为细胞内运输的轨道。为了执行这些多样的功能，微管会以不同的方式组织自身。该领域中一个引人关注的问题是：结构上和进化上保守的微管如何适应如此多样的组织形式和功能，其背后的分子机制是什么。一种可能的机制是微管的多样化，这一概念被称为“微管蛋白编码”1,2,3。微管蛋白编码包含两个主要组成部分：α-和β-微管蛋白基因产物（即微管蛋白异构体）在微管中的差异性整合，以及微管蛋白的翻译后修饰（PTMs）。
自20世纪70年代以来，体外重建实验结合不断发展的光学显微镜技术，为揭示微管的特性——如动态不稳定性4和踏车行为5，以及其他机制与功能6,7,8,9,10,11,12,13,14,15——铺平了道路。迄今为止，几乎所有的体外实验均基于通过反复的聚合与解聚循环从脑组织中纯化的微管蛋白16,17。尽管从脑组织中纯化具有可大量获取高质量微管蛋白（通常为克级产量）的优势，但其一个重要缺陷在于异质性：从脑组织纯化的微管蛋白是多种微管蛋白异构体的混合物，并富含多种微管蛋白翻译后修饰（PTMs）。这种异质性使得无法明确特定微管蛋白PTM或异构体在调控微管特性与功能中的具体作用。因此，制备具有可控微管蛋白PTMs且异构体组成均一的功能性组装微管蛋白，对于解析微管密码的分子机制至关重要。
最近，已开发出一种利用酵母Stu2p的微管结合TOG（肿瘤过表达基因）结构域通过亲和层析纯化微管蛋白的方法18。该方法将细胞或组织的粗裂解液通过一个固定有TOG结构域的层析柱，使微管蛋白与基质上的TOG结构域结合，从而能够分析给定样本（即使样本量非常小）中全部微管蛋白池。近年来，还报道了一种长期期待的重组微管蛋白纯化方法，该方法基于杆状病毒表达系统，利用含有α-和β-微管蛋白基因的双顺反子载体在昆虫细胞中表达19。然而，该方法操作繁琐且耗时较长，因此主要用于体外研究微管蛋白突变20以及微管蛋白异构体21,22,23的影响。
在本实验方案中，我们描述了一种基于成熟且广泛应用的聚合-去聚合方法的技术，用于从细胞系或小鼠脑组织中制备具有不同修饰水平的微管蛋白24。该方法通过在可溶形式（4 °C 下的微管蛋白二聚体）与聚合形式（在鸟苷-5'-三磷酸 [GTP] 存在下，30 °C 时形成的微管）之间循环微管蛋白来实现纯化。每种形式通过连续的离心步骤进行分离：在低温（4 °C）离心后，微管蛋白二聚体保留在上清中，而微管则在30 °C 离心后形成沉淀。此外，其中一个聚合步骤在高浓度哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)（PIPES）条件下进行，从而可去除与微管结合的蛋白，最终获得高纯度的微管蛋白。从悬浮或贴壁培养的 HeLa S3 细胞中纯化的微管蛋白几乎不含任何微管蛋白翻译后修饰（PTM），并已被用于近期的体外重建实验25,26,27,28。我们进一步优化了该方法，使其适用于从小鼠单个脑组织中纯化微管蛋白，可用于大量具有微管蛋白异构体及翻译后修饰改变的小鼠模型研究。
在本实验方案中，我们首先描述了源材料（细胞团或脑组织）的制备及其裂解过程（图1A），随后通过微管蛋白的聚合与去聚合的连续步骤来纯化微管蛋白（图1B）。我们进一步描述了评估纯度的过程（图2A，B）和数量（图3A，B纯化微管蛋白的产量。该方法可通过在微管蛋白纯化前于细胞中过表达特定修饰酶，从而制备富含选定翻译后修饰（PTM）的微管蛋白。图 4B）。或者，可在纯化过程中向微管蛋白中添加微管蛋白修饰酶。最后，我们还可从缺乏相应微管蛋白修饰酶的小鼠脑组织中纯化出缺少特定异构体或翻译后修饰的微管蛋白图4B)29.
本文所述方法具有两个主要优势：（i）可在相对较短的时间内生产出足够大量的微管蛋白；（ii）能够获得高质量且高纯度的微管蛋白，其微管蛋白异构体组成或翻译后修饰具有特异性。在本论文的配套视频中，我们重点展示了该实验流程中的一些关键步骤。

<table><tbody><tr><td>1&amp;nbsp;M MgCl₂&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L 细胞培养容器</td><td>Techne F7610&amp;nbsp;</td><td></td><td>用于悬浮培养。切勿搅拌空的悬浮瓶。当悬浮瓶置于细胞培养孵箱中时，应始终保持悬浮瓶的侧向阀门略微打开，以促进培养基与孵箱环境的气体平衡。&amp;rsquo;s 大气环境。使用后应立即用自来水注满旋转瓶，以防止残留细胞在瓶壁上干燥。用去离子水清洗瓶子，加入约 200 ml 去离子水后进行高压灭菌。在无菌细胞培养罩内去除水分，并在罩内静置数小时，使瓶子完全干燥。切勿使用洗涤剂清洗旋转瓶，因为任何残留的微量洗涤剂都可能对细胞产生有害影响。</td></tr><tr><td>1.5 ml 和 2 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 毫升圆底管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>直径15厘米的无菌培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 螺口管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-巯基乙醇具有毒性，应在通风橱中使用。</td></tr><tr><td>4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A8456</td><td></td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>5、10、20 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml、10 ml、25 ml 无菌移液管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 螺口管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗α-微管蛋白抗体，12G10&amp;nbsp;</td><td>由 J. Frankel 和 M. Nelson 开发，源自美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）支持建立的发育研究杂交瘤库，并由爱荷华大学维护</td><td></td><td>稀释比例：1/500</td></tr><tr><td>抗谷氨酸化微管蛋白抗体，GT335&amp;nbsp;</td><td>AdipoGen&amp;nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td><td>稀释比例：1/20,000</td></tr><tr><td>抑肽酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A1153</td><td></td></tr><tr><td>天平（0.1 &amp;ndash; 10 g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 1 L 聚丙烯瓶&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于收集悬浮培养物</td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-26 XP 离心机</td><td></td><td></td><td>用于收集悬浮培养物</td></tr><tr><td>生物搅拌器&amp;nbsp;</td><td>Techne MCS-104L&amp;nbsp;</td><td></td><td>安装于细胞培养孵育箱中（用于悬浮培养），Hela S3 和 HEK 293 细胞转速为 25 rpm</td></tr><tr><td>双N，N&amp;rsquo;-甲叉双丙烯酰胺&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）&amp;nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>IKA Ultra-Turrax 匀浆器&amp;reg;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>使用5-mm探头（仪器功率设为6或7）在冰上匀浆脑组织，每次15秒，重复2-3次。</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#1.08122</td><td></td></tr><tr><td>羧肽酶A（CPA）</td><td>Sigma</td><td>#C9268</td><td>浓度：1.7&amp;nbsp;U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>细胞培养罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37℃细胞培养箱&amp;deg;C，5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>&amp;nbsp;Sigma&amp;nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSO 可增强其他化合物的细胞和皮肤通透性。避免接触，并使用皮肤和眼部防护装备。</td></tr><tr><td>DMEM 培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>DTT，DL-二硫苏糖醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#D9779</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td><td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，绝对&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical&amp;nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#F7524</td><td></td></tr><tr><td>法国压力细胞压碎机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>&amp;nbsp;#FA-078A</td><td>使用#FA-032细胞破碎仪处理大量细胞。设定为中等比例，表压为1,000 psi（相当于破碎室内部压力3,000 psi）。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>&amp;nbsp;VWR Chemicals&amp;nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#G8877</td><td></td></tr><tr><td>加热块&amp;nbsp;</td><td>Stuart&amp;nbsp;</td><td>#SBH130D</td><td></td></tr><tr><td>Hela细胞&amp;nbsp;</td><td></td><td>ATCC&amp;reg; CCL-2&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Hela S3 细胞&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; CCL-2.2&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>VWR</td><td>#20252.290</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>通过荧光检测以验证细胞转染是否成功</td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>Polyplus&amp;nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 转子&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于收集悬浮培养物</td></tr><tr><td>KOH&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOH 具有腐蚀性，可引起灼伤；使用时需佩戴眼部和皮肤防护装备。</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>用于50 ml离心管的实验室离心机</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>液氮&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 p2.5、p10、p20、p100、p200 和 p1000 及相应的吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型研磨棒</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>小鼠脑组织&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>本研究的动物饲养与使用均遵循欧洲共同体（2010/63/UE）的建议。实验程序已由居里研究所伦理委员会 CEEA-IC #118（国家主管部门授予编号 04395.03 的许可）特别批准，符合国际指导原则。</td></tr><tr><td>18G X 1 针头 &amp;frac12;&amp;rdquo; (1.2 × 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>20G X 1 针头 &amp;frac12;&amp;rdquo; (0.9 × 38 mm</td><td>Terumo</td><td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>21G × 4 针头 &amp;frac34;&amp;rdquo; (0.8 × 120 mm</td><td>B.Braun</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P7626</td><td>PMSF 粉末具有危险性。配制 PMSF 溶液时应使用皮肤和眼睛防护装备。</td></tr><tr><td>PIPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#P6757</td><td></td></tr><tr><td>移液器助吸器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转子</td><td>Beckman 70.1 Ti；TLA-100.3；和 TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE电泳设备&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）&amp;nbsp;</td><td>#1658001FC</td><td></td></tr><tr><td>SDS，十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>#442444H</td><td>用于制备Laemmli缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS，十二烷基硫酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#L5750</td><td>用于制备“TUB”SDS-PAGE凝胶</td></tr><tr><td>超声波破碎仪&amp;nbsp;</td><td>布拉森</td><td>#101-148-070</td><td>用于裂解贴壁培养的细胞。使用直径为6.5 mm的探头，将超声波破碎仪设定为 &amp;ldquo;输出控制&amp;rdquo; 1, &amp;ldquo;占空比&amp;rdquo; 10% 及时间取决于所使用的细胞类型。</td></tr><tr><td>用于1.5 ml离心管的台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEMED，N，N，N&amp;prime;，N&amp;prime;四甲基乙二胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#9281</td><td></td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A (TSA)</td><td>Sigma</td><td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trizma碱（Tris）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#T1503</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机转子&amp;nbsp;</td><td></td><td>TLA-55、TLA-100.3 和 70.1 Ti 转子</td><td>设为4&amp;deg;C 或 30&amp;deg;根据实验需求&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>贝克曼</td><td>#357448&amp;nbsp;</td><td>用于与 TLA-55 转子配合使用</td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>贝克曼</td><td>#349622</td><td>用于与 TLA-100.3 转子配合使用</td></tr><tr><td>超速离心管&amp;nbsp;</td><td>贝克曼</td><td>#355631&amp;nbsp;</td><td>用于 70.1 Ti 转子</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼</td><td>Optima L80-XP（或同等型号）和 Optima MAX-XP（或同等型号）</td><td>设为4&amp;deg;C 或 30&amp;deg;根据实验需求而定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备浮架或试管架的水浴锅</td><td></td><td></td><td>设定为30&amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

微管细胞骨架研究的一个重要方面是在体外重建实验中探究微管的行为。这类实验可用于分析微管的内在特性（如动态行为）及其与微管相关蛋白（MAPs）的相互作用。“微管蛋白密码”是一个新兴概念，强调不同的微管蛋白异构体以及多种翻译后修饰（PTMs）对微管特性和功能的调控作用。为了深入探究微管蛋白密码的分子机制，关键在于利用具有特定异构体和翻译后修饰的纯化微管蛋白进行体外重建实验。
迄今为止，这一目标在技术上具有挑战性，因为体外实验中广泛使用的脑源性微管蛋白含有多种翻译后修饰，并具有特定的亚型组成。因此，我们开发了本实验方案，采用经典的聚合与解聚循环方法，从不同来源纯化具有不同亚型组成和可控翻译后修饰的微管蛋白。与基于亲和纯化的现有方法相比，该方法可获得高纯度且具备聚合能力的微管蛋白，因为在连续的纯化步骤中，无法正常聚合或解聚的微管蛋白会被去除。
我们描述了从悬浮培养或贴壁培养的细胞系以及单个小鼠脑组织中纯化微管蛋白的方法。该方法首先介绍了在悬浮和贴壁条件下细胞量的制备，随后进行细胞裂解，再通过聚合-去聚合循环的连续步骤实现微管蛋白的纯化。本方法获得的微管蛋白可用于研究微管蛋白编码对微管内在特性及其与相关蛋白相互作用影响的实验。

本方法的主要目标是制备高质量、具备组装能力的微管蛋白，其产量足以使用纯化组分进行多次体外实验。由该微管蛋白组装形成的微管可用于基于全内反射荧光（TIRF）显微镜技术的重建实验，适用于动态或稳定的微管；也可用于研究微管动力学、微管相关蛋白（MAPs）或分子马达的相互作用以及马达产生的力学作用25。此外，还可用于微管-MAP共沉淀实验和固态核磁共振波谱分析28。
在整个纯化过程中，可通过考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶监测微管蛋白的富集程度与纯度，建议使用“TUB” SDS-PAGE凝胶，该凝胶可将α-和β-微管蛋白分离，而这两者在传统凝胶中会共迁移为单一蛋白条带32。在不同纯化步骤（除最后一步去聚合外，见实验方案）收集的裂解液应以相近的量上样，以评估微管蛋白纯化的成效（图2A）24。最终获得的微管蛋白样品极为珍...

本方案描述了利用聚合和去聚合循环从小规模或中等规模来源（如培养细胞或单个小鼠脑组织）中纯化微管蛋白的方法。所获得的纯化微管蛋白在特定异构体或特定翻译后修饰方面得到富集，可用于体外重建实验，以研究微管动力学及其相互作用。

微管细胞骨架研究的一个重要方面是在体外重建实验中对微管行为的探究。它们……

该方法能够生成具有特定翻译后修饰、且组装能力均一的纯化微管蛋白，产量足以进行完整的体外实验。本方案基于微管蛋白聚合与去聚合循环，可在任何细胞生物学实验室中简便操作，仅需极少的动手操作时间即可获得较大量的微管蛋白。为了从悬浮培养物中纯化微管蛋白，在微管蛋白制备前九天，复苏并扩增所需细胞类型，以获得六个汇合的15厘米培养皿。在微管蛋白制备前八天，在细胞培养柜中向每个培养皿对应的搅拌瓶中加入一升预热的培养基，并将搅拌瓶置于细胞培养孵育箱内的搅拌台上。将搅拌瓶的侧向瓶盖略微打开，使培养基与孵育箱内的气体环境达到平衡。第二天，使用汇合培养皿中的细胞接种旋转瓶。将旋转瓶放回培养箱中培养一周，期间保持侧向阀门微开。收集细胞时，将培养物从旋转瓶转移至一升的离心管中，通过离心收集细胞。将每个沉淀重悬于10毫升预冷的PBS中，并将重悬的细胞汇集至一个50毫升离心管中，在4摄氏度下离心。对于10毫升的细胞沉淀，向沉淀中加入10毫升裂解缓冲液，反复倒置离心管数次以重新悬浮细胞。为从贴壁细胞培养物中纯化微管蛋白，需复苏并扩增目标细胞类型，以便在微管蛋白制备当天获得10个汇合的15厘米培养皿。为收获贴壁细胞，每次处理三皿，倾斜培养皿以去除培养基，同时由另一人用七毫升 PBS-EDTA 轻柔洗涤细胞。洗涤后，同一人应向每皿加入五毫升 PBS-EDTA 处理细胞，随后由第三人使用细胞刮棒将细胞轻柔地推至培养皿的一侧边缘。待细胞完全脱落时，将三皿中的细胞悬液汇集至一个预冷的 50 毫升离心管中，并用额外两毫升 PBS-EDTA 冲洗每块培养皿，以收集残留的细胞。离心收集细胞后，弃去上清液以确定细胞沉淀的体积。加入裂解缓冲液，重悬细胞，并将其转移至14毫升圆底管中。超声处理细胞约45次脉冲。对于小鼠脑组织裂解，向一只成年小鼠分离出的单个脑组织中加入500微升授权缓冲液，并使用组织匀浆器裂解组织。获得裂解液后，取其体积的1/100与等体积的2×Laemmli缓冲液混合，将溶液煮沸5分钟。在定量前于-20摄氏度保存。在微管蛋白制备的每一步均以此方式收集样品。为澄清裂解液，将样品离心，并使用长针头小心地将澄清的上清液转移至新离心管中，注意避免接触上层漂浮物。裂解液澄清后，必须去除上清液中的漂浮物质，否则可能对微管蛋白纯化的效率产生不利影响。为了从澄清的裂解液中聚合微管蛋白，将上清液一的全部体积与1/200体积的0.2摩尔GTP以及半体积的温热甘油在适当大小的试管中混合。轻轻吹打混匀，注意避免引入气泡。用封口膜密封试管，并置于30摄氏度水浴中孵育20分钟。离心后，将上清液转移至新离心管中。为使沉淀中的微管解聚，将沉淀重悬于冰上预冷的BRB 80缓冲液中，冰上孵育5分钟。在冰上孵育的20分钟内，每隔5分钟先用P1000移液器吹打样品，再用P200移液器吹打一次。待样品均一后，离心并转移上清液至新离心管中。为去除微管相关蛋白，将上清液全部与等体积预热的1摩尔Pipe缓冲液、等体积预热的甘油以及1/100体积的0.2摩尔GTP混合。30摄氏度孵育20分钟，随后进行离心。将含有微管相关蛋白的上清液转移至新离心管中，沉淀物含有聚合的微管。经过第三次聚合与去聚合操作后，可通过SDS-PAGE分析定量所收获的微管蛋白量。纯化过程是否成功可通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE结果进行确认。纯化微管蛋白的得率低于预期可能是由于微管蛋白聚合效率低下所致，这可通过第二次、第四次和第六次沉淀组分中微管蛋白含量较低，而第二次、第四次和第六次上清组分中含量较高来证实。为定量纯化的微管蛋白，可将样品与已知量的牛血清白蛋白并列电泳。随后通过蛋白质条带的定量密度测定，即可计算出纯化微管蛋白的量。可以通过对样品进行免疫印迹分析来确认微管蛋白的修饰状态。我们的方案能够分离出具有可控翻译后修饰的微管蛋白。利用这种微管蛋白，我们可以建立体外重建实验，以确定微管蛋白修饰对微管特性及其与微管相关蛋白相互作用的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

通过聚合-去聚合周期，通过有限来源的受控后翻译修改和异种型对图布林进行净化

微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。...

制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

本实验方案的目标是利用温度来控制三维活性流体的流动速度。该方法的优势不仅在于能够原位调节流动速度，还可实现动态控制，例如周期性地调高和调低流动速度。...

利用温度控制基于微管的三维活性流体的流动速度

微管是由微管蛋白聚合而成的结构，在真核细胞中作为细胞骨架的重要组分发挥关键作用，并以其动态不稳定性而著称。本研究建立了一种微管分级分离方法，可将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白，以评估微管在多种小鼠组织中的稳定性。...

定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

本文介绍了一种通过简单且创新的二次谐波产生显微成像方法，在微管蛋白病模型中检测微管负载的少突胶质细胞的实验方案。...

无标记非线性光学技术用于研究中枢髓鞘中微管蛋白依赖性缺陷

本研究详细描述了利用Sf9-杆状病毒表达系统纯化驱动蛋白-3家族成员KIF1A(1-393LZ)的方法。体外对这些纯化的马达蛋白进行单分子及多马达滑动分析，结果显示其运动特性...

单分子分析Sf9纯化的超进程性驱动蛋白-3家族马达

本文介绍了一种使用植物微管交联蛋白MAP65和聚乙二醇（PEG）作为拥挤剂，形成类 tactoid...

微管束状聚集体的自组装

本文介绍了由微管和驱动蛋白马达制备活性向列相的方法，包括蛋白质的制备与构建，以及利用微井实现活性向列相的限制。...

形成、限制与观察基于微管的活性向列相

本方案描述了一种适用于小型仪器设备的猪脑微管蛋白高产率分离技术。该分离流程辅以微管蛋白聚合活性的测定方法。 体外...

优化从猪脑组织中提取微管蛋白的产量

本文介绍了一种从哺乳动物细胞中提取内源性微管蛋白的实验方案，这些细胞可缺乏或含有特定的微管修饰酶，从而获得富含特定修饰的微管。随后，我们描述了如何将提取的微管与纯化的微管结合蛋白进行孵育，以制备用于冷冻电子显微镜观察的载网样品。...

从哺乳动物细胞中提取修饰微管以通过冷冻电镜研究微管-蛋白质复合物

学习利用聚合-去聚合循环从有限来源纯化微管蛋白的方法，该方法可生成具有特定翻译后修饰的纯化微管蛋白，适用于体外重建实验研究微管动力学与相互作用。

通过聚合-去聚合循环从有限来源纯化具有可控翻译后修饰和亚型的微管蛋白

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