研究乳腺癌及正常细胞中TGF-β信号通路与TGF-β诱导的上皮-间质转化

TGF-β 是上皮-间质转化（简称 EMT）的主要驱动因子，这种转化可在正常细胞和癌细胞中发生。本方案中描述的方法可使研究人员检测调控因子对 TGF-β SMAD 信号通路以及 TGF-β 诱导的 EMT 的影响。来源于小鼠乳腺的非转化 NMuMG 细胞是研究 TGF-β 诱导 EMT 的常用模型系统。

TGF-β 在这些细胞（即 NMuMG 细胞）中引发强烈的上皮-间质转化（EMT）反应。在乳腺癌细胞中也可观察到类似的反应，该反应会促进癌症进展。通过联合染色上皮标志物 E-钙黏蛋白（E-cadherin）以及丝状肌动蛋白（filamentous-actin）的排列结构，有助于验证并更清晰地显示上皮-间质转化过程中发生的形态学变化。

癌细胞获得间充质表型与其迁移、侵袭和转移能力增强以及对化疗产生耐药性密切相关。该方法不仅可能为癌症进展提供重要见解，也可能有助于理解其他过程，如组织纤维化。在实施本方案时，需注意严格控制细胞密度。

细胞密度过高会阻碍上皮-间质转化过程。通过本视觉演示，研究人员将能够充分掌握TGF-β信号通路及TGF-β诱导的EMT实验操作方法。进行E-cadherin的间接免疫荧光染色时，首先将无菌的18毫米方形玻璃盖玻片置于六孔板中，每孔放置一片盖玻片。

将100,000个NMuMG细胞接种到每个孔中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基，过夜培养使细胞贴壁。未转化的NMuMG细胞常被用作研究TGF-β诱导的上皮-间质转化（EMT）的模型系统。次日，轻柔地将带有贴壁细胞的盖玻片转移至新的6孔板中，并向各孔加入2 mL培养基。

以配体缓冲液作为对照，或加入每毫升5纳克的TGF-β处理细胞两天。所加入的配体缓冲液体积应与加入的TGF-β体积相同。处理结束后，移除培养基，并用一毫升预热的PBS轻柔洗涤细胞两次。

加入一毫升 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 30 分钟，然后用一毫升 PBS 轻柔洗涤细胞两次。用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 在室温下对固定后的细胞进行透化处理，持续 10 分钟，随后再用 PBS 洗涤细胞两次。用含 5% BSA 的 PBS 在室温下封闭细胞非特异性蛋白结合位点，持续一小时，然后再次用 PBS 重复洗涤。

将抗E-cadherin的一抗加至每个盖玻片表面，室温孵育1小时。移除一抗，用PBS洗涤每个盖玻片3次。将Alexa Fluor 555二抗和Alexa Fluor 488鬼笔环肽加至每个盖玻片表面。

然后用铝箔覆盖，在室温下孵育一小时。去除二抗，用 PBS 洗涤盖玻片三次。使用含 DAPI 的封片剂将细胞面朝下的盖玻片封固在载玻片上，并将封好的载玻片置于 4°C 避光保存于盒子中。

使用SP8共聚焦显微镜观察染色结果。在MCF10A-Ras细胞系中，TGF-β刺激显著增加了SMAD2的磷酸化水平，而总SMAD2和SMAD3的表达未受影响。与未处理细胞相比，TGF-β还显著诱导了MCF10A-Ras细胞系中荧光素酶报告基因的表达。

在经 TGF-β 处理的 MCF10A-Ras 乳腺细胞中，TGF-β 明确的直接转录靶基因（包括 SMAD7 和 SERPINE1）均呈现高表达。经 TGF-β 处理的 NMuMG 上皮细胞由典型的上皮形态转变为纺锤形的类似间充质形态。与形态学变化一致，TGF-β 处理导致间充质标志物蛋白表达水平升高。

相比之下，上皮标志物 E-cadherin 在经 TGF-beta 处理两天后表达下调。采用定量实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测 TGF-beta 刺激后 EMT 标志物的基因表达水平。结果显示，CDH1 显著降低，而间充质标志物则升高。

经 TGF-β 刺激后，NMuMG 细胞表达的 E-钙黏蛋白少于对照组细胞。此外，在 TGF-β 存在下，细胞形成了更多的肌动蛋白应力纤维。使用 GW788388 处理以剂量依赖性方式抑制了 TGF-β 诱导的 SMAD2 磷酸化。

此外，SB-431542 处理阻断了 TGF-β 介导的 SMAD2 磷酸化。SB-431542 和 GW788388 均显著抑制了 TGF-β 诱导的 NMuMG 细胞中 SMAD2 和 SMAD3 的核转位与核内累积。按照此方案，通过更换特异性的一抗和二抗，可对其他上皮-间质转化相关大分子蛋白进行免疫荧光染色，以研究这些蛋白在细胞内的表达水平及其定位情况。