Name: 使用基于多反应监测的人类脑组织蛋白质的多反应监测工作流程定量蛋白质组学工作流程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习使用多反应监测（MRM）技术对人类脑组织进行蛋白质定量分析的标准化工作流程。本方法涵盖从样本制备到数据分析的完整步骤，有助于提高临床蛋白质组学中生物标志物发现的准确性和可靠性。

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我们感谢MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），项目编号#34_IITB，对SS的资助，以及印度理工学院孟买分校MASSFIITB设施在生物技术部（BT/PR13114/INF/22/206/2015）支持下开展所有质谱相关实验的资助。
我们特别感谢 Rishabh Yadav 先生负责整个视频的制作与编辑，以及 Nishant Nerurkar 先生在音频编辑方面的工作。

本研究涉及人类参与者的脑组织样本，已通过TMH和IITB伦理审查委员会（IITB-IEC/2018/019）的审查和批准。参与者已提供知情并签署书面同意书，自愿参加本研究。
1&#160;从脑组织中提取蛋白质
<ol>
	<li>称取约 50 mg 脑组织，使用移液器加入 300 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。 
	注意：此步骤旨在去除组织表面的血液，必要时需重复操作。应尽可能去除组织中的血液，因其会干扰后续的蛋白质定量与处理。</li>
	<li>用 PBS 清洗后，在含有组织的离心管中加入 300 µL 裂解缓冲液（缓冲液 A）。缓冲液 A 包含 8 M 尿素、50 mM Tris（pH 8.0）、75 mM NaCl、1 mM MgCl2 以及蛋白酶抑制剂混合物（按制造商说明添加）。 
	注意：蛋白得率受多种因素影响，包括样本储存条件、起始材料量以及处理过程中的操作效率。当组织量少于 50 mg 时，应按比例减少缓冲液 A 的体积。</li>
	<li>将离心管置于冰浴中，使用探头式超声破碎仪裂解组织。超声参数设置如下：振幅 40%，工作 5 秒，间歇 5 秒，总时长 2 分 30 秒。</li>
	<li>继续使用珠磨均质器进行组织匀浆，以实现组织的完全裂解。 
	注意：此步骤应在中等速度下运行 90 秒，随后在冰上孵育 3–5 分钟。</li>
	<li>将管内液体在 4 °C 条件下以 6,000 × g 离心 15 分钟。将上清液转移至新离心管中并充分混匀。 
	&#8203;注意：将样品分装后于 -80°C 保存，以备后续使用。</li>
</ol>
2 蛋白质定量与质量检测
<ol>
	<li>使用已知浓度的 BSA 制备的标准曲线，在消化前对样品进行定量。 
	&#8203;注意：用于蛋白质定量的检测方法必须与制备蛋白裂解液时所用的缓冲液相容。通过 SDS-PAGE 凝胶电泳检测蛋白裂解液的质量。</li>
</ol>
3 蛋白质消化
<ol>
	<li>取50 µg蛋白质置于微量离心管中，加入三(2-羧乙基)膦（TCEP）使终浓度为20 mM，以还原蛋白质。于37 °C孵育1小时。</li>
	<li>孵育结束后，向管中加入碘乙酰胺（IAA），使其终浓度为40 mM，以烷基化还原后的蛋白质。避光孵育30分钟。 
	注意：IAA需在加入前新鲜配制。</li>
	<li>向含有还原和烷基化后蛋白质的管中加入缓冲液B，使管中尿素的终浓度低于1 M。 
	注意：缓冲液B由25 mM Tris（pH 8.0）和1 mM CaCl2组成，用于样品稀释。稀释后应确保管内溶液pH为8，以保证胰蛋白酶消化蛋白质的最佳效果。</li>
	<li>按酶与蛋白质质量比1:30加入胰蛋白酶，于37 °C持续振荡孵育过夜。</li>
	<li>消化完成后，使用真空浓缩仪浓缩消化产物。此步骤后，肽段可立即重悬并脱盐，或于-80 °C保存以备后续使用。</li>
</ol>
4 脱盐与肽段定量
注意：在将样品上样至&#160;LC-MS/MS 之前，必须进行脱盐或肽段纯化。样品中的盐分和其他污染物可能会堵塞色谱柱，并对仪器造成损害。该过程可使用市售的 C18 Stage-tip 或色谱柱完成。
<ol>
	<li>用 20 µL 含 0.1% 甲酸（FA）的 50% 乙腈（ACN）活化 Stage Tip。在 1,000 × g 条件下离心 1 分钟，弃去穿流液。 
	注意：此后的离心条件均与此处相同。</li>
	<li>加入 20 µL 含 0.1% FA 的 100% ACN，按步骤 4.1 的方法离心。 
	注意：活化步骤可重复数次。</li>
	<li>活化完成后，将 20 µL 重悬的肽样品通过 Stage Tip，并按步骤 4.1 的方法离心。 
	注意：此步骤中不要弃去穿流液。</li>
	<li>将穿流液重复通过 Stage Tip 至少 5 次，以确保肽与 Stage Tip 的结合达到最大量。</li>
	<li>用 20 µL 0.1% FA 洗涤 Stage Tip，并弃去穿流液。 
	注意：为获得更佳效果，此步骤应再重复两次。</li>
	<li>使用递增浓度的 ACN（分别为 40%、60% 和 80%）将结合的肽洗脱至新的微量离心管中。</li>
	<li>在真空浓缩仪中将肽干燥，并进行肽定量。</li>
	<li>将干燥的肽重悬于 0.1% FA 中，并采用 Scopes 方法5 进行定量。</li>
</ol>
5 已确定靶标物的转换列表制备
注意：在多反应监测（MRM）实验中，一个“跃迁”（transition）指的是前体离子（Q1）到产物离子（Q3）质荷比（m/z）的对应关系。一个肽段可对应一个或多个跃迁，其Q1值相同，但Q3值不同。三重四极杆质谱仪需要肽段及其产物离子的跃迁信息才能进行检测。因此，在开始靶向实验之前，必须预先准备一份跃迁列表。该列表可通过在线数据库SRMAtlas6（https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions）&#160;或一款名为Skyline的开源软件7（https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view）来生成。
<ol>
	<li>从 UniProt（https://www.uniprot.org/）下载最新的人类蛋白质组 FASTA 文件，并通过将其导入 Skyline 创建背景蛋白质组文件。在肽段设置中，进入 背景蛋白质组 下拉菜单并点击“添加”，输入人类蛋白质组的 FASTA 序列文件。确保已选中该数据库，并在进入下一步之前将允许的漏切位点数设置为 0。</li>
	<li>现在，在 肽段设置 的 筛选 选项卡下，将可接受肽段的长度限定为 8 至 25 个氨基酸。</li>
	<li>在 过渡离子设置 的 筛选 选项卡中，将 前体离子电荷 设置为 2、3，将 碎片离子电荷 设置为 1，并将 碎片离子类型 设置为 y。用户可根据需要选择特定的产物离子。对于特殊离子，选择 脯氨酸 N 端，其余参数保持默认设置。 
	注意：肽段和过渡离子设置可根据具体实验进行调整。</li>
	<li>通过点击 编辑 并进入 插入 来添加目标肽段或蛋白质。若要插入蛋白质，请复制其登录号（accession ID）；若要插入特定肽段，请复制肽段序列。软件会将登录号映射到背景蛋白质组，并根据设定的肽段和过渡离子参数生成过渡离子列表。</li>
	<li>导出过渡离子列表。请确保在 仪器类型 下拉菜单中选择了正确的仪器。对于优化实验，可在 Skyline 中设置每个文件所需的过渡离子数量，将过渡离子列表拆分为较小的文件，以避免单次运行中仪器需检测过多过渡离子而超负荷。过渡离子数量需进一步优化以形成单一方法，相关内容将在后续的方法优化部分说明。</li>
</ol>
6 个液相色谱参数
<ol>
	<li>使用二元溶剂体系，其中水相溶剂含有 0.1% 甲酸（溶剂 A），有机相溶剂含有 80% 乙腈（溶剂 B）。</li>
	<li>将色谱柱温度设置为 45 °C。</li>
	<li>设置 10 分钟的液相色谱梯度，流速为 450 µL/min（如表 S1所示）。</li>
</ol>
7 个 MS 参数
注意：所述检测方法已针对 TSQ Altis 三重四极杆质谱仪进行开发和优化。
<ol>
	<li>依次优化运行参数，如 Q1 和 Q3 分辨率、驻留时间（dwell time）和循环时间（cycle time）。我们发现 Q1 和 Q3 的分辨率为 0.7 时效果最佳。循环时间或驻留时间可能需要根据监测肽段的跃迁数量和平均峰宽进行调整。</li>
	<li>使用 表 S2 和 表 S3 中的质谱参数。整个方法持续时间为 10 分钟。 
	&#8203;注意：在方法优化期间及之后的所有运行中，参数保持不变，除非另有说明。对于全新的实验，可能需要根据样品类型和样品处理步骤调整某些参数。</li>
</ol>
8 运行序列和仪器质控
<ol>
	<li>按1:1:1:1的比例配制水：甲醇：异丙醇：乙腈混合液。将此混合液用作空白样品。</li>
	<li>准备可用于持续监测仪器性能的任何标准样品的肽段。该样品将作为质控（QC）标准品。我们检测经优化的牛血清白蛋白（BSA）酶解肽段，其在多天内均能产生良好且稳定的响应信号（图2）。</li>
	<li>运行样品时，序列应以数个空白样品开始，随后依次运行质控标准品和临床样品。务必确保每两个连续样品之间插入一个空白样品。</li>
	<li>为便于比较，每次进样应确保各样品的量和体积相等。</li>
</ol>
9 方法优化
<ol>
	<li>使用 Skyline 分析从混合样本中获得的初步数据。寻找正确的色谱峰、跃迁离子对以及峰形和强度等参数，以选择最佳结果。将文件另存为一个新的 Skyline 项目。</li>
	<li>建议使用谱图库来查找最匹配的色谱峰，从而获得最优的跃迁离子对列表。谱图库是一组来自文献或实验室内部实验的 MS/MS 谱图数据。</li>
	<li>从新保存的 Skyline 项目中导出一份新的跃迁离子对列表，并使用该列表创建一个新的检测方法。利用新建立的方法采集数据，并重复使用 Skyline 对跃迁离子对进行优化。</li>
	<li>在通过 Skyline 数据分析确定最终的肽段和跃迁离子对列表后，通过尝试不同的循环时间和驻留时间组合，对方法进行精细调整。 
	&#8203;注意：使用同位素标记的合成肽段和索引保留时间（iRT）肽段可使方法优化更加简便8, 9。因此，建议使用这些肽段进行方法的精细调整。</li>
	<li>根据优化实验中获得的保留时间信息，建立一个具有明确定义采集窗口的最终定程序采集方法。</li>
	<li>制备各个受试个体的样本。将使用最终的定程序方法对这些样本进行数据采集。</li>
	<li>数据采集完成后，可通过将原始文件导入 Skyline 进行进一步的下游分析及组间比较。</li>
</ol>

<ol><li>Picotti, P., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring-based+proteomics%3A+Workflows%2C+potential%2C+pitfalls+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring-based proteomics: Workflows, potential, pitfalls and future directions.</a> Nature Methods. , (2012).</li>
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<li>Mermelekas, G., Vlahou, A., Zoidakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRM%2FMRM+targeted+proteomics+as+a+tool+for+biomarker+validation+and+absolute+quantification+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">SRM/MRM targeted proteomics as a tool for biomarker validation and absolute quantification in human urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (11), 1441-1454 (2015).</li>
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<li>Jiang, S. X., Slinn, J., Aylsworth, A., Hou, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+participates+in+microglia+activation+and+neurotoxicity+in+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Vimentin participates in microglia activation and neurotoxicity in cerebral ischemia.</a> Journal of Neurochemistry. , (2012).</li>
<li>Liu, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+Phosphoribosyltransferase+May+Be+Involved+in+Age-Related+Brain+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide Phosphoribosyltransferase May Be Involved in Age-Related Brain Diseases.</a> PLoS ONE. , (2012).</li>
<li>Abbatiello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+guidelines+for+publication+of+manuscripts+describing+development+and+application+of+targeted+mass+spectrometry+measurements+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">New guidelines for publication of manuscripts describing development and application of targeted mass spectrometry measurements of peptides and proteins.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 16 (3), 327-328 (2017).</li>
</ol>

作者们获得了Thermofisher对出版费用的资助。

多年来，免疫组织化学和蛋白质印迹等技术一直被视为验证蛋白质靶标的金标准。&#160;尽管这些方法至今仍在使用，但其实验流程仅经过细微修改，且对技术依赖性较低，导致操作极为繁琐和耗时。此外，这些方法还需使用价格昂贵的抗体，而这些抗体在不同批次之间并不总能保持相同的特异性，且实验过程需要大量的专业技术经验。另外，利用质谱等高通量技术鉴定出的蛋白质中，仅有很小一部分有可用的匹配抗体，这进一步加剧了整个验证过程的复杂性。因此，靶向蛋白质组学检测正逐渐被采纳为验证靶标的新策略10。随着大多数靶标发现工作在高通量组学平台上进行，一组经过验证的靶标也正被考虑用于临床筛查应用11,12,13。
本文的代表性结果验证了载脂蛋白A-I（Apolipoprotein A-I, APOA-I）、波形蛋白（Vimentin, VIM）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinam...

在过去十年中，质谱技术（MS）的快速发展，结合对色谱技术理解的不断深入，极大地推动了基于质谱的蛋白质组学的进步。基于分子生物学的技术，如蛋白质印迹（western blotting）和免疫组织化学，长期以来存在可重复性差、周转时间长、观察者间变异大以及无法准确量化蛋白质等诸多问题。在此背景下，高通量蛋白质组学方法所具备的更高灵敏度，持续为分子生物学家提供了更可靠、更有效的替代工具，助力他们更深入地理解蛋白质在细胞中的功能。然而，鸟枪法蛋白质组学方法（数据依赖性采集，DDA）在检测复杂组织中低丰度蛋白质方面常常存在局限，且高度依赖仪器的灵敏度和分辨率。近年来，全球各地的实验室正在开发诸如数据非依赖性采集（DIA）等新技术，这些技术需要更强的计算能力和能够处理高度复杂数据集的可靠软件支持。然而，这些技术仍处于发展完善阶段，且使用不够便捷。基于质谱的靶向蛋白质组学方法则在质谱技术的高通量特性与ELISA等分子生物学方法的高灵敏度之间实现了理想平衡。靶向质谱蛋白质组学实验聚焦于检测来自发现型鸟枪法蛋白质组学实验或现有文献中提出的假说驱动型蛋白质或肽段1，2。多反应监测（MRM）即为一种此类靶向质谱方法，其利用串联四极杆质谱仪，从复杂样品中实现对蛋白质/肽段的精确定性和定量。尽管该方法使用的是低分辨率仪器，但仍能提供更高的灵敏度和特异性。
四极杆由4根平行的杆组成，每根杆与对角线方向上的另一根杆相连。通过在四极杆上施加交变的射频（RF）和直流（DC）电压，在杆间形成一个交变电场。由于相对的两根杆上存在相同的电压，四极杆内部离子的运动轨迹会受到该电场的影响。通过调节射频与直流电压的比值，可使特定离子的轨迹趋于稳定。正是四极杆的这一特性使其可作为质量过滤器，选择性地允许特定离子通过。根据实际需要，四极杆可工作于静态模式或扫描模式。静态模式仅允许特定质荷比（m/z）的离子通过，因此对该目标离子具有高度选择性和特异性；而扫描模式则允许整个m/z范围内的离子依次通过。因此，串联四极杆质谱仪可有四种工作方式：i）第一级四极杆工作于静态模式，第二级工作于扫描模式；ii）第一级四极杆工作于扫描模式，第二级工作于静态模式；iii）两级四极杆均工作于扫描模式；iv）两级四极杆均工作于静态模式3。在典型的多反应监测（MRM）实验中，两个四极杆均工作于静态模式，从而可选择性地监测特定的前体离子及其碎裂后产生的子离子。这使得该技术具有极高的灵敏度和选择性，能够实现准确定量。
对于分子生物学家而言，人脑组织及其细胞是宝贵的资源。这个引人入胜的人体器官中的基本单位，能够为揭示其功能提供分子和细胞层面的深刻见解。对脑组织进行蛋白质组学研究，不仅有助于我们理解健康大脑的系统性功能，还能揭示在疾病影响下发生失调的细胞通路4。然而，由于脑组织具有高度异质性，是一种极为复杂的器官，对其进行分析需要采用协同策略，才能更深入地理解分子水平上的变化。以下研究描述了从脑组织中提取蛋白质、建立并优化MRM检测方法，到靶标验证的完整工作流程（图1）。本文系统地阐述了利用人脑组织开展基于MRM的成功实验所涉及的主要步骤，旨在向更广泛的研究群体介绍该技术及其面临的挑战。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈（质谱级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0620/21</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>HiMedia</td><td>TC194-25G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（质谱级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>147930250</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma</td><td>1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇（质谱级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>Q13827</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fischer Scienific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（质谱级）</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>质谱级水</td><td>Pierce</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>HiMedia</td><td>TL1006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Merck</td><td>DF6D661300</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Merck</td><td>648310</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（质谱级）</td><td>Pierce</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Merck</td><td>MB1D691237</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18色谱柱</td><td>Thermo</td><td>25002-102130</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器</td><td>Gilson</td><td>F167380</td><td></td></tr><tr><td>Stage tips</td><td>MilliPore</td><td>ZTC18M008</td><td></td></tr><tr><td>氧化锆/二氧化硅珠</td><td>BioSpec products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>珠磨仪（均质器）</td><td>Bertin Minilys</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（分光光度计）</td><td>Thermo</td><td>MultiSkan Go</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Eutech</td><td>CyberScan pH 510</td><td></td></tr><tr><td>探头式超声破碎仪</td><td>Sonics Materials, Inc</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>振荡干浴器</td><td>Thermo</td><td>88880028</td><td></td></tr><tr><td>TSQ Altis质谱仪</td><td>Thermo</td><td>TSQ02-10002</td><td></td></tr><tr><td>超高效液相色谱仪 - Vanquish</td><td>Thermo</td><td>VQF01-20001</td><td></td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Thermo</td><td>Savant ISS 110</td><td></td></tr></tbody></table>

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

近十年来，对人类脑组织的蛋白质组学分析极大地增进了我们对大脑的理解。然而，与脑相关的疾病仍然是全球死亡的重要原因，迫切需要更深入地了解其发病生物学机制。传统的基于抗体的技术，如蛋白质印迹（western blotting）或免疫组织化学，存在通量低、劳动强度大以及仅为定性或半定量的局限性。即使是传统的基于质谱的鸟枪法（shotgun）分析方法，也往往无法提供支持特定假设的明确证据。靶向蛋白质组学方法在很大程度上由假设驱动，不同于长期使用的传统鸟枪法蛋白质组学方法。多反应监测（multiple reaction monitoring）即是一种此类靶向方法，其需要使用一种特殊的质谱仪，称为串联四极杆质谱仪或三重四极杆质谱仪。在本研究中，我们系统地阐述了利用人类脑组织成功实施基于串联四极杆质谱仪的蛋白质组学工作流程所涉及的主要步骤，旨在将该工作流程介绍给更广泛的研究群体。

我们对来自两组脑部异常患者（每组5个样本）的10个样本中的3种蛋白质进行了相对定量分析。这些蛋白质包括载脂蛋白A-I（APOA-I）、波形蛋白（VIM）和烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT），已知它们在脑细胞中发挥多种功能。数据的运行后分析使用Skyline-daily（版本20.2.1.286）完成。共监测了对应于3种蛋白质的10个肽段，其中包括APOA-I的3个肽段、VIM的4个肽段以及NAMPT的3个肽段。这10个肽段产生的总转换数为57。样本根据其所属的病理状态分为两组。利用Skyline软件中的组间比较功能，对这些肽段的峰强度进行了比较，并计算了相对定量值（图3）。
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本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。

过去十年中，对人类脑组织进行的蛋白质组学分析极大地增进了我们对大脑的理解。然而，与脑相关的……

靶向蛋白质组学方法正迅速成为验证短期蛋白质组学实验或分子生物学实验中发现的蛋白质的首选方法。多反应监测（MRM）即为一种此类靶向方法，目前正被 increasingly 用于检测和定量生物样本中的蛋白质。在本研究中，我们逐步展示了从人脑组织中检测和定量蛋白质所涉及的各个步骤，旨在向读者介绍 MRM 实验的基本要求。称取约 50 mg 脑组织，用 300 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。此步骤旨在去除组织表面的血液，因此应尽可能彻底清除血液。用 PBS 清洗后，向含有组织的离心管中加入 300 µL 裂解缓冲液。将离心管置于冰浴中，使用探头式超声破碎仪裂解组织。随后使用珠磨机进行组织匀浆，以彻底裂解组织。将离心管中的内容物在4°C条件下以6000 g离心15分钟。将上清液转移至新离心管中并混匀。取少量上清液，使用标准蛋白质定量方法测定蛋白含量。此处以Bradford法测定蛋白质为例。取50微克蛋白质置于微量离心管中，加入TCEP进行还原，使终浓度为20毫摩尔。37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，向管中加入碘乙酰胺，使终浓度为40毫摩尔，对还原后的蛋白质进行烷基化。将离心管避光孵育30分钟。然后向含有还原和烷基化蛋白质的离心管中加入缓冲液B，使尿素的终浓度低于1摩尔。按1:30的酶与蛋白质比例加入胰蛋白酶，并在37摄氏度下持续振荡孵育过夜。消化完成后，使用真空浓缩仪将消化后的肽段浓缩。在此步骤中，肽段可选择重新溶解并进行脱盐处理，或于-80°C保存以备后续使用。在将样品上载至任何液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）之前，脱盐（即肽段纯化）是必不可少的步骤。样品中的盐类及其他污染物长期积累可能堵塞色谱柱，并影响仪器的检测灵敏度。该过程可使用市售的C18 STAGE小柱或色谱柱完成。此处我们展示了使用C18 STAGE小柱进行肽段脱盐的操作流程。脱盐后，在真空浓缩仪中将肽段干燥。将这些纯化后的多肽重新溶解，并采用Scopes法进行定量。具体操作为：取两微升样品加入微量滴定板中，根据幻灯片所示计算其浓度。在SRM或MRM实验中，转换列表的制备是一个关键步骤。转换列表包含质谱仪监测转换所需的所有信息，包括前体离子和产物离子的 m/z 值、转换的碰撞能量、仪器的极性以及数据采集的时间范围。使用 Skyline 制备转换列表。使用 UniProt 提供的人类蛋白质组 Fasta 文件准备背景蛋白质组，并确保在肽段设置的“背景”选项卡下已选择该文件。在“筛选”选项卡中，设置最小长度为 8，最大长度为 25。若肽段无其他修改，继续使用默认设置。设置好肽段参数后，单击“过渡参数设置”。在“筛选”选项卡下，将前体离子电荷设置为 2 和 3，将碎片离子电荷设置为 1，并将离子类型设置为 y。可根据用户选择来选定产物离子。所有参数保持默认设置。现在插入所选目标蛋白的登录号。可通过点击“编辑”选项卡，然后选择“插入”，最后粘贴登录号 ID 来完成此操作。系统将在背景蛋白质组中将这些 ID 映射到相应的蛋白质，并根据先前设置的肽段和过渡参数生成过渡列表。导出该过渡列表。通过点击“仪器类型”下拉选项，确保选择正确的仪器。本例中仪器为 Thermo Altis。由于未定义的过渡列表包含过多过渡，每个列表仅保留最多 350 个过渡，并导出为多个方法。采用二元溶剂系统。溶剂A为1% FA，溶剂B为80% ACN。保持流速为450微升/分钟，梯度按所示进行。将色谱柱温箱温度设置为 45 摄氏度。有关色谱柱和液相色谱系统的更多细节，请参见正文。确保您的 TSQ Altis 质谱仪的质谱参数设置如图所示。导入单个转换列表以创建新方法。我们建议将四极杆1和四极杆3的分辨率保持在7。如有需要，可进一步优化。为了确保运行过程的一致性，从而保证数据质量，请按照所示方式准备运行序列。首先运行几个空白样品，空白混合液的组成请参见正文说明；接着运行已知浓度的轻链牛血清白蛋白（BSA）质控标准品，以监测仪器每日响应值的变化情况。质控应在样品运行前立即进行。接下来将所有样品依次排列，样品之间留有空白。每个样品注入等体积溶液，每针进样量相当于 25 至 1 纳克肽。为优化方法，首先使用未定义方法对完整样品进行分析。将结果导入 Skyline 并手动检查每种肽段。针对每种肽段，选择一个在所有样品中均呈现稳定良好峰形的前体离子。删除未呈现良好峰形的前体离子及肽段。确保所有峰均已正确标注。为了选择正确的峰并进一步优化每个前体离子下的过渡离子，可以使用谱库。谱库是一组与当前实验数据中的肽段及过渡离子相匹配的串联质谱（MS-MS）谱图数据集。选择 DART P 值接近 1 的峰，并剔除与谱库不匹配的离子对。DART P 值表示实验峰与谱库峰之间的匹配程度。经过一至两轮优化后，即可获得优化后的列表。可针对单个样品运行此优化后的列表。将优化后的运行结果导入 Skyline，并正确标注峰。在文档设置中使用“注释”选项卡，仔细标注文档网格中的每个样品。使用组间比较功能，创建实验中条件1与条件2之间的比较。这将生成一个包含两组间校正后P值和倍数变化值的表格。据我们所知，这是首次采用多反应监测（MRM）技术检测人脑组织样本中载脂蛋白A-1、波形蛋白和烟酰胺磷酸核糖转移酶这三种蛋白质的肽段的研究。优化多种参数（如液相色谱梯度、延迟时间、循环时间以及碰撞能量）可显著影响多反应监测实验的成功率。我们认为，该技术可用于建立生物标志物模式，以区分不同的临床状态和疾病。

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生物学

使用基于多反应监测的人类脑组织蛋白质的多反应监测工作流程定量蛋白质组学工作流程

来源：Wulf, M., 等. 基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组谱LC-MS/MS分析方案. J. Vis. Exp.

人脑组织中分离的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS/MS分析

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

本方案介绍了如何在复杂的生物样品中使用选择反应监测技术对目标蛋白质进行绝对定量分析。该方法已用于准确量化小鼠巨噬细胞趋化信号通路中的蛋白质。文中详细描述了目标肽段的选择、检测方法的建立，以及定性和定量分析过程。...

选择性反应监测质谱法用于蛋白质绝对定量

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。...

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

本文建立了一种基于质谱的蛋白质组学方法，利用福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中分离出的特定区域进行分析。该方案用于分析存档的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片中特定组织区域的蛋白质组。...

一种利用选定组织区域进行质谱法蛋白质组学的简化方法

本方案利用激光显微切割技术，成功从胶质瘤样本中制备出足量高质量的新生血管组织，用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，克服了传统研究主要集中于血管生成因子的局限性，提供了胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。...

从人脑胶质瘤组织制备新生血管组织用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析

学习使用多反应监测（MRM）技术对人类脑组织进行蛋白质定量分析的标准化工作流程。本方法涵盖从样本制备到数据分析的完整步骤，有助于提高临床蛋白质组学中生物标志物发现的准确性和可靠性。

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

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