基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

靶向蛋白质组学方法正迅速成为验证短期蛋白质组学实验或分子生物学实验中发现的蛋白质的首选方法。多反应监测（MRM）即为一种此类靶向方法，目前正被 increasingly 用于检测和定量生物样本中的蛋白质。在本研究中，我们逐步展示了从人脑组织中检测和定量蛋白质所涉及的各个步骤，旨在向读者介绍 MRM 实验的基本要求。

称取约 50 mg 脑组织，用 300 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。此步骤旨在去除组织表面的血液，因此应尽可能彻底清除血液。用 PBS 清洗后，向含有组织的离心管中加入 300 µL 裂解缓冲液。

将离心管置于冰浴中，使用探头式超声破碎仪裂解组织。随后使用珠磨机进行组织匀浆，以彻底裂解组织。将离心管中的内容物在4°C条件下以6000 g离心15分钟。

将上清液转移至新离心管中并混匀。取少量上清液，使用标准蛋白质定量方法测定蛋白含量。此处以Bradford法测定蛋白质为例。

取50微克蛋白质置于微量离心管中，加入TCEP进行还原，使终浓度为20毫摩尔。37摄氏度孵育一小时。孵育结束后，向管中加入碘乙酰胺，使终浓度为40毫摩尔，对还原后的蛋白质进行烷基化。

将离心管避光孵育30分钟。然后向含有还原和烷基化蛋白质的离心管中加入缓冲液B，使尿素的终浓度低于1摩尔。按1:30的酶与蛋白质比例加入胰蛋白酶，并在37摄氏度下持续振荡孵育过夜。

消化完成后，使用真空浓缩仪将消化后的肽段浓缩。在此步骤中，肽段可选择重新溶解并进行脱盐处理，或于-80°C保存以备后续使用。在将样品上载至任何液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）之前，脱盐（即肽段纯化）是必不可少的步骤。样品中的盐类及其他污染物长期积累可能堵塞色谱柱，并影响仪器的检测灵敏度。

该过程可使用市售的C18 STAGE小柱或色谱柱完成。此处我们展示了使用C18 STAGE小柱进行肽段脱盐的操作流程。脱盐后，在真空浓缩仪中将肽段干燥。

将这些纯化后的多肽重新溶解，并采用Scopes法进行定量。具体操作为：取两微升样品加入微量滴定板中，根据幻灯片所示计算其浓度。在SRM或MRM实验中，转换列表的制备是一个关键步骤。

转换列表包含质谱仪监测转换所需的所有信息，包括前体离子和产物离子的 m/z 值、转换的碰撞能量、仪器的极性以及数据采集的时间范围。使用 Skyline 制备转换列表。

使用 UniProt 提供的人类蛋白质组 Fasta 文件准备背景蛋白质组，并确保在肽段设置的“背景”选项卡下已选择该文件。在“筛选”选项卡中，设置最小长度为 8，最大长度为 25。若肽段无其他修改，继续使用默认设置。

设置好肽段参数后，单击“过渡参数设置”。在“筛选”选项卡下，将前体离子电荷设置为 2 和 3，将碎片离子电荷设置为 1，并将离子类型设置为 y。

可根据用户选择来选定产物离子。所有参数保持默认设置。现在插入所选目标蛋白的登录号。

可通过点击“编辑”选项卡，然后选择“插入”，最后粘贴登录号 ID 来完成此操作。系统将在背景蛋白质组中将这些 ID 映射到相应的蛋白质，并根据先前设置的肽段和过渡参数生成过渡列表。导出该过渡列表。

通过点击“仪器类型”下拉选项，确保选择正确的仪器。本例中仪器为 Thermo Altis。由于未定义的过渡列表包含过多过渡，每个列表仅保留最多 350 个过渡，并导出为多个方法。

采用二元溶剂系统。溶剂A为1% FA，溶剂B为80% ACN。保持流速为450微升/分钟，梯度按所示进行。

将色谱柱温箱温度设置为 45 摄氏度。有关色谱柱和液相色谱系统的更多细节，请参见正文。确保您的 TSQ Altis 质谱仪的质谱参数设置如图所示。

导入单个转换列表以创建新方法。我们建议将四极杆1和四极杆3的分辨率保持在7。如有需要，可进一步优化。

为了确保运行过程的一致性，从而保证数据质量，请按照所示方式准备运行序列。首先运行几个空白样品，空白混合液的组成请参见正文说明；接着运行已知浓度的轻链牛血清白蛋白（BSA）质控标准品，以监测仪器每日响应值的变化情况。质控应在样品运行前立即进行。

接下来将所有样品依次排列，样品之间留有空白。每个样品注入等体积溶液，每针进样量相当于 25 至 1 纳克肽。为优化方法，首先使用未定义方法对完整样品进行分析。

将结果导入 Skyline 并手动检查每种肽段。针对每种肽段，选择一个在所有样品中均呈现稳定良好峰形的前体离子。删除未呈现良好峰形的前体离子及肽段。

确保所有峰均已正确标注。为了选择正确的峰并进一步优化每个前体离子下的过渡离子，可以使用谱库。谱库是一组与当前实验数据中的肽段及过渡离子相匹配的串联质谱（MS-MS）谱图数据集。

选择 DART P 值接近 1 的峰，并剔除与谱库不匹配的离子对。DART P 值表示实验峰与谱库峰之间的匹配程度。经过一至两轮优化后，即可获得优化后的列表。

可针对单个样品运行此优化后的列表。将优化后的运行结果导入 Skyline，并正确标注峰。在文档设置中使用“注释”选项卡，仔细标注文档网格中的每个样品。

使用组间比较功能，创建实验中条件1与条件2之间的比较。这将生成一个包含两组间校正后P值和倍数变化值的表格。据我们所知，这是首次采用多反应监测（MRM）技术检测人脑组织样本中载脂蛋白A-1、波形蛋白和烟酰胺磷酸核糖转移酶这三种蛋白质的肽段的研究。

优化多种参数（如液相色谱梯度、延迟时间、循环时间以及碰撞能量）可显著影响多反应监测实验的成功率。我们认为，该技术可用于建立生物标志物模式，以区分不同的临床状态和疾病。