动物源性血液及人工饲料的喂食与定量方法 埃及伊蚊 蚊子

该技术可使研究人员喂养蚊虫，并单人完成高通量测量，以比较数百只个体蚊虫所摄取的餐液体积。该方法具有适应性，可调整餐液成分，或用于比较不同实验组蚊虫的摄食量。本方案旨在操作简便且成本低廉。

为了进行药理学和遗传学操作，以研究蚊子的吸血行为及吸血后的活动，本实验方案中组织工作至关重要。请提前准备好实验装置和试剂，以便能够迅速为蚊子提供血餐。

首先，将1.98至2毫升去纤维蛋白羊血转移至一个15毫升的锥形管中。若需进行基于荧光的摄食量定量，加入荧光素溶液至终浓度为0.002%，同时相应减少等体积的羊血以保持总体积不变。保留1毫升最终配制的饲喂液用于生成参考标准曲线。

所有含有荧光素的餐食和溶液均应使用铝箔包裹或避光保存。制备无蛋白盐水餐时，在15毫升锥形管中加入600微升400毫摩尔的碳酸氢钠溶液和1.39毫升双蒸水。若后续需通过荧光定量法测定餐物体积，请加入荧光素溶液至终浓度为0.002%，同时将水的体积减少与所加荧光素溶液相同的体积。

保留至少一毫升含有 0.002% 荧光素的最终餐食配方，用于生成参考标准曲线。将制备好的餐食放置一旁，待准备使用时再取出。所有含有荧光素的餐食和溶液均应包裹在铝箔中或避光保存。

将实验组的雌蚊放入容器中，并用纱网覆盖。让这些雌蚊在饲喂室中适应环境。另设一组未吸血的雌蚊作为对照组，不提供血餐。

构建GLI管时，将40毫升100%甘油加入50毫升锥形管中。用两层封口膜密封开口的锥形管，以尽量减少泄漏风险。可选步骤：使用橡皮筋固定封口膜。

将管子倒置，以确保没有孔洞或缝隙。要制作食物递送装置，使用锋利的剃刀或打孔器在锥形管的螺帽中心切割一个直径为2.5厘米的孔。将一片封口膜均匀拉伸，使其面积大致扩大一倍。

Parafilm 应足够薄，以便蚊子能够轻松刺穿，但不应有泄漏。用 Parafilm 密封螺旋盖的外表面，完全覆盖住孔洞，并将盖子放置一旁。将密封的甘油管、血液和生理盐水餐以及 42 至 45 摄氏度的水浴加热至少 15 分钟。

将ATP加入温热的培养基中，并充分涡旋混匀。用移液器吸取2毫升温热的培养基，加入螺口盖的内室中，然后轻轻将装有温热甘油的倒置锥形管置于其上。将装有培养基的螺口盖部分拧紧到装有甘油的管子上，力度以足以防止培养基或甘油泄漏为宜。

将组装好的糖饲管置于蚊虫容器上方，通入二氧化碳，让蚊虫取食至少15分钟，以达到最大取食率。取食结束后，GLI管帽可作为生物危害废物丢弃，或在低浓度漂白剂溶液中浸泡并用清水彻底冲洗后重复使用。为建立参考标准曲线，需制备一系列稀释梯度的餐液，其中含有与实验组蚊虫所摄入的0.002%荧光素相同的成分。

配制标准曲线的第一个溶液时，取50微升含有0.002%荧光素的餐液加入950微升PBS中，并充分涡旋混匀。对标准曲线的其余溶液进行两倍系列稀释，每次稀释前均需充分涡旋混匀。将每种标准曲线溶液各100微升分别加入96孔PCR板第一列的八个孔中。

将一只麻醉或冷冻的未吸血对照蚊虫加入相同八孔中的每一孔中。在另一列中重复操作，以进行重复测量。向其余各孔中的未吸血对照组和实验组分别加入 100 µL PBS。

作为阴性对照，在培养板接下来的两列中，每个孔加入一只未吸血的蚊子。将吸血后的实验组蚊子按每孔一只加入剩余的孔中。若使用珠磨机裂解组织，则向每孔加入三颗毫米级硼硅酸盐实心玻璃珠。

小心密封酶标板，裂解组织，然后以2000 RPM离心1至2分钟以收集裂解液。准备一块黑色96孔板，每孔加入180微升PBS。然后，向每孔加入20微升裂解液并混匀。

使用酶标仪，设置激发波长为485，发射波长为520，测定荧光素的荧光强度。通过将已知的餐液体积与相应的荧光强度测量值作图，绘制参考标准曲线。根据所生成的参考标准曲线，推算实验组每只蚊虫摄入的餐液体积。

用各实验组个体的荧光强度读数减去未进食阴性对照组的平均荧光强度读数，以校正组织本底自发荧光。为了测量血液饲喂实验中荧光素标记餐液的摄入量，通过绘制含有未进食蚊虫及已知体积含0.002%荧光素餐液的指定参考孔的荧光读数，生成标准曲线。将剩余孔中来自未进食阴性对照组蚊虫或接受餐液的实验组蚊虫的荧光读数与此标准曲线进行比较，以定量摄入的餐液体积。

尽管实验组中的所有雌蚊均提供了血液餐，但部分蚊虫吸血，部分则未吸血。该方案可用于递送并定量含有不同蛋白质成分的餐食。此处展示的是使用添加了氟代亮氨酸（fluoricine）的餐食所收集的数据。

另进行了一项独立实验，在未添加氟啶虫酰胺的情况下提供血餐后，通过肉眼观察对蚊虫是否吸血进行评分。该实验方案用于测定含有调节蚊虫宿主寻找行为药物的餐液摄入量。在这些实验中，雌蚊被提供含有盐水及三磷酸腺苷，并添加人源NPY2受体激动剂的餐液。

该技术还可通过将糖管替换为浸有含0.002%荧光素的10%蔗糖溶液的棉球，用于测量传粉昆虫的取食行为，表明该方法可用于测量较小或变异较大的取食量，而这些取食量无法通过群体称重准确分辨。执行本方案时最重要的事项是将样本按事件分类，并将未进食的蚊虫以及每餐的一毫升样本留出，用于生成标准曲线。按照此步骤操作后，可观察动物在吸血后的行为，并追踪其消化过程。

该方法可使研究人员评估基因改造蚊虫摄食行为的变化，同时也提供了一种简单、快速且非侵入性的途径，用于向蚊虫递送药物并检测药物对其行为的影响。