PCR定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶 PCR定点突变, 克隆, 表达, 快速蛋白质纯化, 色氨酸合酶, 蛋白质结晶, 重组蛋白, 层析纯化, 酶学分析, 结构生物学

本方案可快速、简便且高效地从鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中纯化色氨酸合酶，利用硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱法，可在一天内完成野生型及突变型色氨酸合酶复合物的纯化。该技术也可用于纯化其他相关蛋白，因为硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱法常用于纯化无标签蛋白。

首先，在冰水浴中以80%的振幅进行超声处理，采用20个循环，每个循环为10秒脉冲、20秒间隔，以破碎细胞沉淀。将细胞裂解液在25摄氏度下以30,000 × g离心30分钟，并吸取上清液，注意不要扰动沉淀。在室温下，使用0.45微米滤膜过滤澄清的上清液组分。

缓慢向滤液中加入少量硫酸铵，直至达到 20% 饱和度。在 25 °C 下进行硫酸铵分级沉淀，轻轻搅拌溶液 10 分钟，注意避免产生气泡。再次将溶液离心 10 分钟，将上清液转移至洁净的烧瓶中以供后续使用。

轻轻将沉淀重悬于20毫升样品缓冲液中，并取样用于进行SDS-PAGE。向上清液中加入硫酸铵至终浓度为30%饱和度，搅拌溶液，避免产生气泡。再次离心10分钟，将上清液转移至洁净的烧瓶中以供后续使用。

将获得的40%沉淀组分轻轻重悬于10毫升样品缓冲液二中，并制备用于SDS-PAGE电泳的样品。然后在4°C条件下，以10,000 × g离心20分钟，对40%蛋白样品进行微量离心，将所得上清液以0.5毫升/分钟的流速上样至预先平衡的连接在快速蛋白液相色谱仪上的HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR柱。通过12% SDS-PAGE凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色，分析收集到的洗脱峰组分和硫酸铵沉淀组分。

使用100千道尔顿的离心过滤器，在4°C、3,000 × g条件下离心，浓缩野生型或突变型鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶α₂β₂复合物。将浓缩后的蛋白质转移至新的2毫升离心管中，再次在4°C、10,000 × g条件下离心10分钟，以去除聚集体。测定样品的蛋白质浓度后，将蛋白溶液分装为每份0.5毫升，浓度为20至25毫克/毫升。

在液氮中快速冷冻，并于-80摄氏度保存。配制5毫升200毫摩尔的亚精胺水溶液，分装为500微升每份，于-20摄氏度保存。然后配制50毫升30%聚乙二醇8,000的水溶液，取25毫升置于50毫升一次性离心锥形瓶中，在25摄氏度下保存。

分别在水中配制25毫升的一摩尔氯化铯和氯化钠储备液，并在25摄氏度下保存。配制三份50毫升的一摩尔Bicine储备液，并用氢氧化铯或氢氧化钠滴定，得到pH值分别为7.6、7.8和8.0的缓冲溶液。将25毫升的溶液等分试样在4摄氏度下保存。

将一管α₂β₂沙门氏菌色氨酸合酶复合物在冰浴中解冻，然后在25°C下以10,000 × g离心10分钟。将澄清的上清液转移至一支干净的离心管中。

估算上清液的蛋白浓度，并用含50毫摩尔氯化铯或氯化钠、pH为7.8的50毫摩尔双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷-氢氧化铯或双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷-氢氧化钠缓冲液将蛋白分装样品稀释至15毫克/毫升。在无菌1.5毫升微量离心管中为三块24孔坐滴板配制各500微升的储液。针对每组样品，按照文稿中所述调整PEG 8,000和亚精胺的浓度，并改变缓冲液的pH值。

盖上管盖，剧烈涡旋振荡10秒，然后在25°C下以10,000 × g离心10分钟，以去除气泡。将500 µL该溶液加入每个储液槽中。使用P-10微量移液器，将5 µL浓度为15 µg/L的蛋白质溶液加入每个坐滴板孔中。

然后向蛋白液滴中加入5 µL相应的储液溶液。混合时避免产生气泡，不要反复吹打。最后，用透明胶带密封板子，并在25 °C下保存。

晶体在两到五天内出现，并在两周内生长至完全尺寸。本实验方案用于将鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶的α亚基和β亚基亚克隆至修饰后的pET SUMO载体中。此处展示了SDS-PAGE的代表性结果，显示两条明显的条带，分别对应于His6-SUMO-α和His6-SUMO-β色氨酸合酶融合蛋白。

每种蛋白质均通过镍-次氮基三乙酸亲和层析和硫酸铵沉淀进行纯化，随后进行His-SUMO标签切割、去除残留的His-SUMO标签以及蛋白质浓度测定。此处展示了α亚基、β亚基以及α₂β₂沙门氏菌色氨酸合酶复合物在凝胶过滤层析（SEC）中的洗脱曲线及其主峰组分的纯度。在构建色氨酸合酶复合物的突变体后，采用硫酸铵分级沉淀法去除异源表达系统中的污染蛋白。

此处展示的是沙门氏菌色氨酸合酶 α₂β₂ 复合物在排阻色谱柱上洗脱的代表性洗脱曲线，其洗脱位置为相对位置。在合并之前，使用 SDS-PAGE 分析了排阻峰组分的纯度。通过优化 PEG 8,000 和亚精胺浓度以及 Bicine 缓冲液的 pH 值，实现了精细的结晶条件优化，从而获得了较大的单晶。

不同形态的晶体在两到五天内出现，并在两周内生长至完全大小。在晶体结构精修后，解析了野生型α₂β₂鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶复合物晶体结构的电子密度图。进行本方案时，应尽快在室温下完成初始纯化步骤，以防止色氨酸合酶活性丧失。

这些突变体的晶体结构有望为L-色氨酸合成中关键残基的作用机制提供新的见解。