Name: PCR 突变体、克隆、表达、快速蛋白质纯化协议和色氨酸合成酶野生类型和突变形式的结晶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习快速纯化Salmonella typhimurium色氨酸合成酶的实验方案，利用硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱技术，可在一天内完成野生型与突变体蛋白的纯化与结晶。该方法适用于其他非标签蛋白的纯化研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（GM097569）资助。

<ol><li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li>
<li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+mine+for+enzymologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li>
<li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li>
<li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protozoan+genomics+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li>
<li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li>
<li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize%2C+two+evolutionarily+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li>
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<li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%2C+a+two-component+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li>
<li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification%2C+crystallization%2C+and+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li>
<li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li>
<li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li>
<li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li>
<li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li>
<li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li>
<li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86%2C+lysine+87%2C+arginine+148%2C+cysteine+170%2C+and+cysteine+230%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li>
<li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+K%2B+or+Cs%2B+for+Na%2B+induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+mutant+%28betaK87T%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li>
<li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li>
<li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crystallography+of+a+true+substrate%2C+indole-3-glycerol+phosphate%2C+bound+to+a+mutant+%28alphaD60N%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li>
<li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li>
<li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li>
<li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium%3A+On+the+roles+of+beta+%282%29+subunit+Lys-382%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li>
<li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+replacement+with+MOLREP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).</li>
<li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+content+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li>
<li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coefficient+probabilities%3A+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins%2C+DNA%2C+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露，并声明不存在竞争性财务利益。

我们已成功构建了用于结构与功能相关性研究的突变体 α2β2 βQ114A、α2β2 βK167T 和 α2β2 βS377A StTS 复合物。最初，我们尝试使用先前的纯化方案22来纯化这些突变体，该方案要求在纯化过程中使用 PEG 8000 和亚精胺诱导 α2β2 StTS 复合物结晶。尽管结晶速率取决于突变体类型及溶液中复合物的浓度，但在大体积溶液中难以预测晶体出现的时间。结晶可能在较长时间（48–96 小时）后发生，或在结晶启动后需额外添加 PEG 8000 才能实现15。
遗憾的是，本研究中呈现的 α2β2 StTS 复合物突变体形式无法通过该方案成功纯化，因为在方案初始步骤中未能形成晶体，从而阻碍了晶体学研究...

色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α2β2）是一种别构酶，在细菌、植物和真菌中催化氨基酸L-色氨酸生物合成的最后两个步骤1,2,3。鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，St）可引起人类及其他动物严重的胃肠道感染。由于人类和高等动物体内不存在TS（EC 4.2.1.20），抑制S. typhimurium的α2β2 TS复合物（α2β2 StTS）已被探索作为治疗隐孢子虫病和结核病4、生殖器与眼部感染5的潜在药物靶点，以及在农业中作为潜在除草剂的应用6。α亚基催化吲哚-3-甘油磷酸（IGP）发生醛醇裂解反应，生成甘油醛-3-磷酸（GAP）和吲哚，该过程通过形成吲哚烯互变异构中间体，随后发生碳-碳键断裂，生成GAP和吲哚3,6。β催化位点含有一个与β-Lys87通过希夫碱连接的吡哆醛5′-磷酸（PLP）辅因子分子，其在酶β亚基的反应过程中起到电子阱的作用3,7。β位点催化L-丝氨酸侧链上的羟基被吲哚取代，通过PLP依赖性反应生成L-色氨酸和一分子水。StTS长期以来被用作研究多酶复合物内底物通道化及别构通讯的模型体系2,3。TS的α与β亚基之间双向的别构通讯对于协调催化步骤并在L-色氨酸合成过程中防止吲哚释放至关重要3。为进一步推进此项研究，我们通过单点突变构建了多个突变体（β-Gln114Ala、β-Lys167Thr和β-Ser377Ala），用于深入探究StTS β亚基催化位点处酶结构、机理与功能之间的关系。
关于α2β2StTS催化机制的详细研究最初由Edith W. Miles研究组启动。早期对天然大肠杆菌（Escherichia coli）α2β2 TS复合物的研究主要集中在分离的α亚基8,9、分离的β亚基10,11以及由分离亚基重建α2β2 TS复合物12的纯化与表征。纯化过程包括硫酸铵沉淀、样品透析、DEAE-Sephadex层析、透析，以及在DEAE-Sephadex柱上进行的第二轮层析12。在另一项方案中，通过将澄清的细胞裂解液上样至DEAE-Sephadex柱，随后在Sepharose 4B柱上进行层析、硫酸铵沉淀和透析，改进了该复合物的纯化流程13。这两种纯化方案均需耗时4至5天。大肠杆菌（Escherichia coli）α2β2 TS复合物虽已结晶，但当时的晶体不适合进行X射线衍射分析。
在一项创新研究中，对S. typhimurium的α2β2 TS复合物的重组型和野生型进行了纯化并获得晶体14,15。重组型α2β2 StTS复合物在携带pEBA-10表达载体的大肠杆菌（E. coli）CB149菌株中过量表达。此前已有报道对α2β2 StTS复合物进行了初步结晶以及X射线衍射数据的收集与分析14。然而，所获得的α2β2 StTS晶体呈细长针状，不利于结构研究。为了获得更高质量的X射线衍射数据，后续提出另一种纯化方案，用于纯化α2β2 StTS复合物的野生型及突变体形式15。该方案首先在澄清的细胞裂解液中加入亚精胺和PEG 8,000进行初步沉淀，通过离心去除大量絮状沉淀。含有高浓度α2β2 StTS复合物的上清部分在4 °C下保存16至48小时，直至黄色晶体析出。晶体经洗涤后，用不同缓冲液进行广泛透析。随后在含硫酸铵的缓冲液中对蛋白复合物进行重结晶并再次透析15。尽管蛋白结晶依赖于溶液中蛋白和沉淀剂的浓度，但该方法难以监测、预测和重复用于其他α2β2 StTS复合物突变体的纯化过程。该方案的优点是无需使用任何层析技术；但其缺点是纯化周期较长，包括结晶、透析和重结晶步骤，通常需要5至7天。为获得适合X射线数据收集的晶体，研究人员评估了超过600种结晶条件，组合并调整了蛋白浓度、温度、沉淀剂（PEG 4,000、6,000和8,000）以及添加剂（CaCl2、MnCl2、ZnCl2、尸胺、腐胺、亚精胺或精胺）的种类与浓度15。在含有12% PEG 8,000和2 mM亚精胺的条件下，晶体形态更佳且生长更快。相较于4、30或42 °C，25 °C更有利于结晶，晶体在3天内即可达到最大尺寸15。当时（1996–1999年）已报道了多个α2β2 StTS晶体结构16,17,18,19,20,21，至今已有更多相关结构被发表。
本文的主要目的是提供纯化色氨酸合酶及优化蛋白质结晶的替代性实验方案。本研究展示了对纯化野生型分离的α亚基（αStTS），分离的β亚基（βStTS），重建的 α2β2 St由分离的亚基组装TS复合物，以及α亚基的野生型和突变体形式2β2 StTS复合物. 相较于以往的实验方案，本方法具有显著优势，因为纯化时间大幅缩短，且结晶与冷冻保护条件得到了优化。α的突变体形式2β2 St本研究中构建的TS复合物在与野生型相近的条件下实现了结晶。然而，仍需进行精细的结晶优化，以获得足够大且质量优良的单晶，用于近原子分辨率的结构解析。截至目前，蛋白质数据库（PDB）中已收录了134个色氨酸合酶晶体结构，分别来自细菌（101个）、古菌（31个）和真核生物（2个）。其中，有73个结构属于 S. enterica 血清型 typhimurium 以及5个α的晶体结构2β2 StTS复合物的分辨率高于1.50埃。毫不奇怪，其中5个中有4个由我们的研究小组制备（PDB编号：5CGQ，分辨率为1.18 Å；4HT3，分辨率为1.30 Å；4HPJ，分辨率为1.45 Å；6DZ4，分辨率为1.45 Å）。突变型α的优化晶体结构2β2 StTS复合物有望为参与L-色氨酸合成的关键氨基酸残基的作用机制和功能提供新的见解。

<table><tbody><tr><td>15 mL 10 kDa 滤膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC901024</td><td>离心过滤装置</td></tr><tr><td>15 mL 100 kDa 滤膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td>离心过滤装置</td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Corning</td><td>CLS430489</td><td>冻存管</td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-141</td><td>微量离心管</td></tr><tr><td>24 孔 Cryschem 板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-158</td><td>24 孔坐滴结晶板</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>50 mL 离心锥形管</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-270</td><td>离心锥形管</td></tr><tr><td>AB15 ACCUMET Basic</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB15</td><td>pH 计</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>琼脂糖凝胶</td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>S35836</td><td>培养箱</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>双(2-羟乙基)氨基乙酸（bicine）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Branson 450 数字超声破碎仪</td><td>Brason</td><td>B450</td><td>细胞破碎仪</td></tr><tr><td>氯化铯</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氢氧化铯</td><td>Acros Organics</td><td>AC213601000</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1391</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>高保真聚合酶</td></tr><tr><td>dNTP 混合物</td><td>Invitrogen</td><td>10-297-018</td><td>dNTP 混合液</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Excella E25R 轨道摇床</td><td>Eppendorf New Brunswick</td><td>M1353-0004</td><td>轨道式培养摇床</td></tr><tr><td>GE AKTA Prime Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-0004</td><td>快速蛋白液相色谱系统</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td>DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>His-Trap 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5255-01</td><td>5 mL HisTrap 柱</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>诱导剂</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>Kelvinator Series-100</td><td>Kelvinator</td><td>discontinued</td><td>超低温冰箱</td></tr><tr><td>LB 液体培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>液体培养基</td></tr><tr><td>LB 琼脂培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>固体培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0193S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>Ni-NTA 亲和珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R90115</td><td>Ni-NTA 琼脂糖珠</td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-865-0</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>磷酸吡哆醛</td><td>Acros Organics</td><td>AC228170010</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>S-200 HR</td><td>Cytiva</td><td>45-000-196</td><td>凝胶过滤柱</td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B 离心机</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1004</td><td>落地式离心机</td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Acros Organics</td><td>AC132750010</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Superdex 200 制备级</td><td>Cytiva</td><td>45-002-491</td><td>凝胶过滤柱</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>DNA 连接酶</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>化学试剂</td></tr><tr><td>Ubl 特异性蛋白酶 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12588018</td><td>SUMO 蛋白酶</td></tr></tbody></table>

pcr定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶

pcr定点突变, 克隆, 表达, 快速蛋白质纯化, 色氨酸合酶, 蛋白质结晶, 重组蛋白, 层析纯化, 酶学分析, 结构生物学

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

色氨酸合酶（TS）双酶复合物（α2β2 TS）来自 鼠伤寒沙门氏菌 已开展多项研究，以深入理解PLP依赖性酶的催化机制、变构行为以及底物向产物转化的酶促反应细节。在本研究中，建立了一种新型表达系统，用于分别制备独立的α亚基和独立的 β亚基 实现了大量高纯度亚基和α的纯化2β2 St在2天内从分离的亚基中重组TS复合物。纯化过程采用亲和层析，随后切除亲和标签，硫酸铵沉淀以及尺寸排阻色谱（SEC）。为了更深入理解酶β位点关键残基的作用，在前期结构研究中进行了定点突变。另设计了一种方案用于纯化野生型及突变型α2β2 StTS复合物。利用硫酸铵分级沉淀结合SEC的一种简单、快速且高效的方案实现了α的纯化2β2 StTS复合物可在一天内完成。本文所述的两种纯化方案与先前使用PEG 8000和亚精胺结晶α复合物的方法相比，具有显著优势。2β2 StTS复合物在纯化流程中的变化。野生型及某些突变体形式在略有不同的条件下发生结晶，使用PEG 8000和亚精胺时会干扰部分突变体的纯化。为获得适用于X射线晶体学研究的晶体，已进行多项尝试以优化结晶条件、晶体质量和冷冻保护效果。. 本文所述方法应普遍适用于色氨酸合酶亚基以及野生型和突变型α亚基的纯化2β2 StTS复合物。

纯化 α- 和 β色氨酸合酶的亚基 
The α-亚基（αStTS）和β亚基（βStTS）的 Salmonella typhimurium 色氨酸合酶被亚克隆至修饰的pET SUMO载体中。 图1A 显示两条强条带的代表性SDS-PAGE结果，对应于His6-SUMO-αStTS（αON 泳道）和 His6-SUMO-βStTS（βON亚基）融合蛋白。本研究所描述的纯化方案可在2天内分别纯化得到两个亚基。第一天用于通过Ni-NTA亲和层析、硫酸铵沉淀、His-SUMO标签切割、去除His-SUMO标签残留物以及蛋白浓缩等步骤对每种蛋白进行纯化。 图1B 和 1C 展示 S...

本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化Salmonella typhimurium色氨酸合酶复合物，并提供了一种可在一天内快速纯化该蛋白复合物的实验方案。所涵盖的方法包括定点诱变、在Escherichia coli中进行蛋白表达、亲和层析、凝胶过滤层析以及结晶。

PCR定点突变、克隆、表达、快速蛋白质纯化方案及色氨酸合酶野生型与突变体的结晶

PCR定点突变, 克隆, 表达, 快速蛋白质纯化, 色氨酸合酶, 蛋白质结晶, 重组蛋白, 层析纯化, 酶学分析, 结构生物学

对来自鼠伤寒沙门氏菌的色氨酸合酶双酶复合物（α₂β₂ TS）进行的结构研究已开展，旨在更好地理解……

本方案可快速、简便且高效地从鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）中纯化色氨酸合酶，利用硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱法，可在一天内完成野生型及突变型色氨酸合酶复合物的纯化。该技术也可用于纯化其他相关蛋白，因为硫酸铵分级沉淀和尺寸排阻色谱法常用于纯化无标签蛋白。首先，在冰水浴中以80%的振幅进行超声处理，采用20个循环，每个循环为10秒脉冲、20秒间隔，以破碎细胞沉淀。将细胞裂解液在25摄氏度下以30,000 × g离心30分钟，并吸取上清液，注意不要扰动沉淀。在室温下，使用0.45微米滤膜过滤澄清的上清液组分。缓慢向滤液中加入少量硫酸铵，直至达到 20% 饱和度。在 25 °C 下进行硫酸铵分级沉淀，轻轻搅拌溶液 10 分钟，注意避免产生气泡。再次将溶液离心 10 分钟，将上清液转移至洁净的烧瓶中以供后续使用。轻轻将沉淀重悬于20毫升样品缓冲液中，并取样用于进行SDS-PAGE。向上清液中加入硫酸铵至终浓度为30%饱和度，搅拌溶液，避免产生气泡。再次离心10分钟，将上清液转移至洁净的烧瓶中以供后续使用。将获得的40%沉淀组分轻轻重悬于10毫升样品缓冲液二中，并制备用于SDS-PAGE电泳的样品。然后在4°C条件下，以10,000 × g离心20分钟，对40%蛋白样品进行微量离心，将所得上清液以0.5毫升/分钟的流速上样至预先平衡的连接在快速蛋白液相色谱仪上的HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR柱。通过12% SDS-PAGE凝胶电泳并用考马斯亮蓝染色，分析收集到的洗脱峰组分和硫酸铵沉淀组分。使用100千道尔顿的离心过滤器，在4°C、3,000 × g条件下离心，浓缩野生型或突变型鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶α₂β₂复合物。将浓缩后的蛋白质转移至新的2毫升离心管中，再次在4°C、10,000 × g条件下离心10分钟，以去除聚集体。测定样品的蛋白质浓度后，将蛋白溶液分装为每份0.5毫升，浓度为20至25毫克/毫升。在液氮中快速冷冻，并于-80摄氏度保存。配制5毫升200毫摩尔的亚精胺水溶液，分装为500微升每份，于-20摄氏度保存。然后配制50毫升30%聚乙二醇8,000的水溶液，取25毫升置于50毫升一次性离心锥形瓶中，在25摄氏度下保存。分别在水中配制25毫升的一摩尔氯化铯和氯化钠储备液，并在25摄氏度下保存。配制三份50毫升的一摩尔Bicine储备液，并用氢氧化铯或氢氧化钠滴定，得到pH值分别为7.6、7.8和8.0的缓冲溶液。将25毫升的溶液等分试样在4摄氏度下保存。将一管α₂β₂沙门氏菌色氨酸合酶复合物在冰浴中解冻，然后在25°C下以10,000 × g离心10分钟。将澄清的上清液转移至一支干净的离心管中。估算上清液的蛋白浓度，并用含50毫摩尔氯化铯或氯化钠、pH为7.8的50毫摩尔双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷-氢氧化铯或双(2-羟乙基)亚氨基-三(羟甲基)甲烷-氢氧化钠缓冲液将蛋白分装样品稀释至15毫克/毫升。在无菌1.5毫升微量离心管中为三块24孔坐滴板配制各500微升的储液。针对每组样品，按照文稿中所述调整PEG 8,000和亚精胺的浓度，并改变缓冲液的pH值。盖上管盖，剧烈涡旋振荡10秒，然后在25°C下以10,000 × g离心10分钟，以去除气泡。将500 µL该溶液加入每个储液槽中。使用P-10微量移液器，将5 µL浓度为15 µg/L的蛋白质溶液加入每个坐滴板孔中。然后向蛋白液滴中加入5 µL相应的储液溶液。混合时避免产生气泡，不要反复吹打。最后，用透明胶带密封板子，并在25 °C下保存。晶体在两到五天内出现，并在两周内生长至完全尺寸。本实验方案用于将鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶的α亚基和β亚基亚克隆至修饰后的pET SUMO载体中。此处展示了SDS-PAGE的代表性结果，显示两条明显的条带，分别对应于His6-SUMO-α和His6-SUMO-β色氨酸合酶融合蛋白。每种蛋白质均通过镍-次氮基三乙酸亲和层析和硫酸铵沉淀进行纯化，随后进行His-SUMO标签切割、去除残留的His-SUMO标签以及蛋白质浓度测定。此处展示了α亚基、β亚基以及α₂β₂沙门氏菌色氨酸合酶复合物在凝胶过滤层析（SEC）中的洗脱曲线及其主峰组分的纯度。在构建色氨酸合酶复合物的突变体后，采用硫酸铵分级沉淀法去除异源表达系统中的污染蛋白。此处展示的是沙门氏菌色氨酸合酶 α₂β₂ 复合物在排阻色谱柱上洗脱的代表性洗脱曲线，其洗脱位置为相对位置。在合并之前，使用 SDS-PAGE 分析了排阻峰组分的纯度。通过优化 PEG 8,000 和亚精胺浓度以及 Bicine 缓冲液的 pH 值，实现了精细的结晶条件优化，从而获得了较大的单晶。不同形态的晶体在两到五天内出现，并在两周内生长至完全大小。在晶体结构精修后，解析了野生型α₂β₂鼠伤寒沙门氏菌色氨酸合酶复合物晶体结构的电子密度图。进行本方案时，应尽快在室温下完成初始纯化步骤，以防止色氨酸合酶活性丧失。这些突变体的晶体结构有望为L-色氨酸合成中关键残基的作用机制提供新的见解。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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