Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

该协议高效且用途广泛。它几乎可以应用于任何膜蛋白，整个生产过程在一天内完成。合成的膜蛋白可以通过提供的配体共翻译稳定。

完全避免了去污剂接触，蛋白质直接在提供的定制膜环境中插入和折叠。结构方法、功能表征和抗体生成是主要应用领域。此外，该技术在分析脂质对膜蛋白折叠和功能的影响方面非常简单。

在培养的第 3 天，将 10 升无菌 37 摄氏度 YPTG 培养基接种在 15 升搅拌罐反应器中，加入 100 毫升预培养物。并在 37 摄氏度下以每分钟 500 转的高通气速度培养细菌。为防止过度起泡，请添加无菌消泡剂。

当细胞达到对数中期时，向培养物中加入 300 毫升乙醇，并在 42 摄氏度下以每分钟 500 转的高通气方式孵育细胞再孵育 45 分钟。在孵育结束时，通过离心收获细胞，并使用刮刀和移液管将细胞完全重悬于 300 毫升 S30A 缓冲液中。将重悬的细菌离心两次，每次洗涤用 300 毫升新鲜 S30A 洗涤沉淀。

第二次洗涤后，将细胞重悬于 1.1 体积的 S30B 缓冲液中。将悬浮液加载到预冷的法式压力传感器中，并以每平方英寸 1， 000 磅的压力压碎细胞一次。为了去除任何不稳定的组分并从核糖体中释放 mRNA，将裂解物调节至 0.4 摩尔氯化钠，并将样品在 42 摄氏度的水浴中孵育 45 分钟。

为了组装膜支架蛋白纳米盘，将MSP1E3D1溶液与脂质溶液混合，并添加 DPC 至终浓度为 0.1%根据表格将反应调整至适当的最终体积，并在 21 摄氏度下轻轻搅拌反应一小时。在孵育结束时，用圆盘形成缓冲液预润湿透析盒的膜，并使用注射器将组装混合物加载到透析盒中。接下来，在室温下用三个 5 L 体积的圆盘形成缓冲液透析反应 10 至 20 小时，搅拌，然后将混合物转移到截留分子量为 10 kdalton 的圆盘形成缓冲液平衡离心过滤器装置中。

然后使用 UV-Vis 读数仪离心以测量浓度，将反应浓缩至至少 300 微摩尔。为了制备 3 mL 连续交换无细胞反应，请在 100 mV tris-乙酸中平衡 3 mL 透析盒的膜。并使用注射器将反应混合物转移到盒中。

使用注射器从反应混合物室中去除多余的空气，然后将透析盒放入透析室中。用 60 毫升补料混合物填充腔室，然后将盖子盖在腔室上。将盖子固定到位后，将腔室在 30 摄氏度下以每分钟 200 转的速度孵育 12 至 16 小时。

要制备用于镁离子筛选的 60 μL 细胞交换无细胞反应体系，请在反应混合物中加入 60 μL 新鲜制备的 3X 预混液，向补料混合物中加入 825 μL。并在饲料混合物中装满水。涡旋后，向 24 孔微孔板的三个孔中分别加入 825 微升补料混合物。

截留分子量为 10 至 14 道尔顿的再生纤维素透析管切成约 25 x 20 毫米大小的块，并将这些块储存在补充有 0.05% 叠氮化钠的水中。在组装微型细胞交换无细胞容器之前，使用纸巾去除透析膜上多余的水，并在每个容器上放置一块膜。用聚四氟乙烯环固定膜，并将迷你容器转移到一个补料混合物孔中。

如表所示，将高分子组分添加到反应混合物中，并通过移液混合。向反应容器中加入 60 微升反应混合物，注意避免气泡。并在 24 孔板周围包裹两张 8 x 10 厘米的密封热塑性薄膜。

用胶带将孔板的盖子固定到位，并将板以每分钟 200 转的速度置于 30 摄氏度下，搅拌 12 至 16 小时。第二天早上，使用移液器吸头刺穿微型细胞交换无细胞容器处的透析膜并吸出反应混合物。将反应混合物转移到新的离心管中并离心以去除沉淀物。

然后将上清液转移到新管中。这里显示了微调反应化合物对合成膜蛋白的最终产量或质量的代表性影响。在该分析中，在所有分析的膜组成下，T-β-one 肾上腺素能受体的总体合成和纳米盘溶解相似。

相比之下，在合成的 G 蛋白偶联受体的质量中检测到更高的变化，DMPC 和 POPC 脂质获得的活性最低，而在应用 DOPG 和 POPG 时观察到的最高活性。综上所述，这些结果表明脂质头部基团的电荷以及脂肪酸链的柔韧性是该细胞膜蛋白折叠和活性的重要调节剂。最终的纳米圆盘浓度也可能是膜蛋白质量的重要因素。

例如，如果在 3.75 至 60 微摩尔的范围内筛选纳米圆盘浓度，则在大约 30 微摩尔的纳米圆盘上获得 G 蛋白偶联受体的完全溶解，从而得到 1 比 3 的膜蛋白与纳米圆盘比率。相比之下，蛋白视紫红质的完全溶解可以用大约 10 微摩尔的纳米圆盘实现，从而获得 10 比 1 的蛋白视紫红质与纳米圆盘比率。准确的移液和高质量的组件当然是必不可少的。

裂解物制备的关键步骤是在对数中期收获细胞并应用高盐步骤。该技术大大降低了膜蛋白合成的复杂性。以前具有挑战性的靶标被有效地合成，因此可以研究迄今为止尚未探索的药学相关蛋白质的分子结构。