Name: 研究成年蚊子排泄系统神经肽和其他调节剂的活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 学习利用Ramsay测定法、扫描离子选择性电极技术和体外收缩实验，研究成年蚊子排泄系统中神经肽和激素因子的调控机制。该方法可精确测量离子分泌、液体分泌及肠道收缩活性，为昆虫内分泌调节研究提供重要技术支持。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）向 AD 和 J-PP 提供的发现基金资助。AL 和 FS 获得了 NSERC 硕士研究生奖学金，以支持其研究生阶段的研究工作。

无。

吸血昆虫在摄取血液餐后，面临血淋巴中溶质和水分过量的挑战2。为应对这一问题，它们具有特化的排泄系统，该系统受到激素因子的严密调控，使昆虫能够迅速启动餐后利尿。拉姆齐（Ramsay）测定法结合离子选择性微电极技术，可用于测量离体昆虫马氏管中的液体分泌速率、离子浓度及离子转运速率。这些方法中的关键步骤包括确保昆虫马氏管的正确解剖。从昆虫体内逐一取出每根马氏管时必须小心操作，因为任何对马氏管的损伤都可能导致液体从破裂处漏出，或导致制备物功能丧失。Aedes 马氏管在未受刺激的对照组中不易分泌液体，因此可施加激素或药物以刺激分泌。然而，即使使用利尿剂处理或精细解剖，部分马氏管仍可能因损伤（即使肉眼无法察觉）而无法分泌，因此可能需要重复多次实验。在离子选择性微电极（ISME）和扫描离子电极技术（SIET）测量过程中，为正确使用离子选择性电极，应确保标准曲线的斜率处于该离子载体所报道的正常范围内，以获得最准确的读数。若读数不稳定，应在显微镜下检查电极，确认离子载体已充分填充且无泄漏。若电极中存在气泡、尖端破损或离子载体未正确填充，则应重新制备新电极。若离子载体与回填液界面呈凸形，则表...

昆虫通过维持体内盐分和水分的平衡，得以在多种生态和环境位点中成功生存，并利用多样的摄食策略1。大多数昆虫已进化出机制，能够在狭窄范围内调节其血淋巴的成分，以应对特定环境带来的不同挑战2。陆生昆虫常面临保水的挑战，其排泄系统会启动抗利尿作用，防止水分和某些重要盐类的流失，从而避免脱水。相反，当昆虫摄食后面临过量水分及潜在过多盐分时，则会发生利尿作用3,4。通过其特化且高度活跃的排泄系统，昆虫已进化出相应的调控机制，以应对渗透调节所面临的挑战。在成年埃及伊蚊（Aedes aegypti）中，排泄系统由马氏管（MTs）和后肠组成，其中后肠又包括前部回肠和后部直肠5。马氏管负责生成原尿，其通常富含NaCl和/或KCl。原尿在沿马氏管向后流动并进入后肠的过程中，通过分泌和重吸收过程被进一步修饰5。最终排泄物的渗透压可高于或低于血淋巴，具体取决于摄食或环境条件，并富含毒性物质和含氮废物2。
马氏管（MTs）是研究上皮细胞液体和溶质转运多种特性的理想模型，因其可执行多种多样的转运和排泄功能2,6。通过激素调节2，马氏管将离子及其他溶质从血液中分泌至管腔内7，形成渗透梯度，使水分子通过水通道蛋白（aquaporins）进行转运8,9，共同形成原尿，随后原尿流向具有重吸收功能的后肠2。因此，通过收集离体马氏管分泌的液体，可连续监测跨上皮的液体和离子转运过程。测量分泌速率和尿液成分有助于揭示介导跨上皮离子和液体转运的机制。研究液体分泌速率的一种常用方法是Ramsay法，该方法由Ramsay于1953年首次提出10。在此方法中，将马氏管远端（封闭端）暴露于激素（或其他测试化合物/药物）中，而近端（开放端）则缠绕在浸润了水饱和石蜡油的针头上，分泌出的原尿在针尖处聚集成液滴。在优化的体外条件下，离体马氏管可长期存活并保持功能（长达24小时），使其成为测量液体分泌的合适且高效的模型。昆虫具有开放的循环系统，因此马氏管通常自由漂浮于血淋巴中，易于解剖和取出6。此外，除蚜虫缺乏马氏管11外，不同昆虫物种的马氏管数量差异较大，可从四条到数百条不等（例如，伊蚊（Aedes）有五条），从而允许从单个昆虫中进行多次测量。
Aedes蚊虫的马氏管与其他内变态昆虫类似，由两种细胞组成简单的上皮结构2,12：较大的主细胞负责将阳离子（如Na+和K+）主动转运至管腔，以及较薄的星形细胞，其有助于跨上皮的Cl-分泌13。马氏管无神经支配2，而是受多种激素调控，包括利尿和抗利尿因子，从而调节离子转运（主要是Na+、K+和Cl-）以及伴随的渗透性水分运输2。已有大量研究探讨了Aedes马氏管的激素调控机制，以阐明内分泌因子在跨上皮转运中的作用14,15,16,17,18。如代表性结果所示，本文所述实验方案展示了不同激素因子对成年雌性埃及伊蚊（A. aegypti）分离马氏管的作用，包括利尿和抗利尿调控（图1）。通过Ramsay法测定表明，抗利尿激素AedaeCAPA-1可抑制由利尿激素31（DH31）刺激的马氏管液体分泌（图1）。
由于昆虫体型较小，需要开发微型方法来测量体液样本中或马氏管（MTs）和肠道等分离组织表面附近的离子活性和离子浓度。已采用多种方法，包括使用离子的放射性同位素19，该方法需收集分泌的液滴以测定离子浓度20。Aedes 蚊虫离体马氏管在刺激状态下通常以约 0.5 nL/min 的速率分泌液体21，因此处理如此微量的液体可能带来操作困难，并在转移过程中引入误差。为此，离子选择性微电极（ISMEs）已被广泛用于体外测定马氏管分泌液滴中的离子浓度22。本实验方案改编自 Donini 及其同事的方法23，使用 Na+ 选择性离子载体来测定成年 Aedes 蚊虫受刺激马氏管分泌液滴中的离子活性。由于离子选择性微电极测量的是离子活性，若假设校准溶液与实验样品具有相同的离子活度系数，则可将测得数据表示为离子浓度21（图 1B,C）。
扫描离子选择性电极技术（Scanning Ion-selective Electrode Technique, SIET）也利用离子选择性微电极（ISMEs）来测量器官、组织或细胞附近静止层中离子浓度梯度，这些器官、组织或细胞正处于离子转运过程中。ISMEs测量电压梯度，进而可用于计算离子浓度梯度以及离子跨器官、组织或细胞的转运方向和通量大小20。在该技术中，ISME被安装在由计算机控制的微步进电机驱动的三维操纵器上，从而实现对其三维位置的微米级精确控制20。电压在静止层内的两个点进行测量，采样程序由计算机软件编程并控制。这两个点之间的距离通常为20–100 µm，其中一个点位于器官、组织或细胞表面5–10 µm范围内，另一个点则再远20–100 µm。通过计算两点间电压值的差异，获得电压梯度24,25,26，再据此推算出浓度梯度，并进一步依据菲克定律（Fick’s Law）计算净离子通量24,27。该方法适用于评估特定离子在昆虫肠道和马氏管不同区域的转运情况，或在吸血后或暴露于特定处理后的特定时间点的转运动态。例如，SIET可用于研究激素28以及不同摄食行为和饲养条件25如何调控蚊虫排泄系统的吸收与分泌过程。先前应用SIET的研究已揭示了幼虫和成虫蚊子肛乳突及直肠中参与离子转运的位点24,28。本实验方案此前由Paluzzi及其同事描述26，用于测量成年雌蚊直肠垫上皮中的Na+通量（图2）。
蚊虫排泄系统的末端需要协调的肌肉运动，以帮助混合食物并分泌废物26。中肠消化后产生的不可吸收产物，连同马氏管（MTs）分泌的原尿，经幽门瓣进入后肠2。后肠的自发性收缩起始于幽门瓣，并以蠕动波的形式传播，通过环绕上皮细胞基底面的环形肌和纵行肌的协调收缩，将收缩信号传递至回肠26。最后，直肠内的肌肉有助于推动并经肛道排出废物。尽管昆虫后肠的运动具有肌源性特征，依赖细胞外Ca2+产生自发性收缩，但这些过程也可受到神经系统的调控26,29,30。神经系统对外源性调控在摄食后尤为重要，因为动物必须将肠道废物排出，并恢复血淋巴的平衡31。因此，开展体外生物测定以鉴定促肌活性或抑肌活性的神经肽，对于评估神经化学物质如何影响后肠运动具有重要意义。本方案由Lajevardi和Paluzzi28建立，采用视频记录技术观察回肠对神经肽刺激的运动反应（图3）。类似地，也可使用力传感器或阻抗转换器，结合数据采集软件记录收缩轨迹32,33。然而，视频技术使我们能够直观地评估器官活动，并利用一系列参数进行进一步分析，从而明确激素在后肠运动中的作用。
采用这些技术有助于表征调控和协调排泄系统中液体与离子转运以及后肠蠕动的因素。重要的是，马氏管的利尿反应与后肠蠕动之间存在功能联系：一些利尿激素（如 DH31 和 5HT）已被证实能够刺激马氏管的液体分泌，同时也被发现可在蚊子后肠中表现出肌活性作用21,34,35。这些发现凸显了在需要快速排泄废物的昆虫中，例如餐后利尿期间，马氏管与后肠之间严格协调的重要性。
本文详细描述了拉姆齐测定法（Ramsay assay）用于测量埃及伊蚊（A. aegypti）体液分泌速率的技术，以及利用离子选择性微电极测定马氏管（MTs）分泌液中 Na+ 浓度的方法；将这两种方法结合，可推算出跨上皮离子转运速率。此外，还介绍了扫描离子选择性电极技术（SIET）和后肠收缩测定法，分别用于测量离子流和运动性，有助于阐明后肠的激素调控机制（图4）。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955456</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Corning Falcon (Fisher Scientific)</td><td>C351008</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝）&lt;br/&gt;（外径 1 mm，内径 0.58 mm，长度 100 mm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>用于 ISME 参比电极</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（带丝）&lt;br/&gt;（外径 2 mm，内径 1.12 mm，长度 102 mm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B200F-4</td><td>用于 SIET 参比电极</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管（无丝）&lt;br/&gt;（外径 1.5 mm，内径 1.12 mm，长度 100 mm）</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td>用于 ISME 和 SIET 电极</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 垫片</td><td>Diamed</td><td>GEN59-114</td><td></td></tr><tr><td>二甲基三甲基硅烷溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41716</td><td></td></tr><tr><td>法拉第屏蔽笼</td><td>定制</td><td></td><td>可由本地机械加工车间制作</td></tr><tr><td>氯化铁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>镊子（Dumont #5）</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-748A</td><td></td></tr><tr><td>水合矿物油</td><td>Fisher Scientific</td><td>8042-47-5</td><td>具体品牌不重要</td></tr><tr><td>INFINITY1-2CB 视频摄像机</td><td>Luminera</td><td>INFINITY1-2CB</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器（左、右手型）</td><td>World Precision Instruments</td><td>MMJL 和 MMJR</td><td>只要为高质量操作器，具体品牌不重要</td></tr><tr><td>轻质矿物油</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-4</td><td></td></tr><tr><td>微型钉针（0.1 mm 不锈钢）</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>非硬化型油泥</td><td>Sargent Art</td><td></td><td>具体品牌不重要</td></tr><tr><td>奥林巴斯光学显微镜（用于 SIET）</td><td>Olympus</td><td>定制系统</td><td></td></tr><tr><td>塑料巴斯德（转移）移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（0.1 mg/mL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-005-M</td><td>84 kDa</td></tr><tr><td>聚氯乙烯（PVC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81395</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-09</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's 果蝇培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>SIET 系统</td><td>Applicable Electronics</td><td>定制系统</td><td>详情请见：http://www.applicableelectronics.com/overview</td></tr><tr><td>银丝</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>钠离子载体 II 混合液 A</td><td>Fluka</td><td>99357</td><td></td></tr><tr><td>标准聚苯乙烯培养皿（细胞培养用）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012921</td><td>任何尺寸均可使用，但 60 mm 培养皿适用于解剖和检测</td></tr><tr><td>带目镜测微尺的体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Sutter P-97 Flaming Brown 毛细管拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>FGPN7</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Chemical Company</td><td>NC9285739</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>VWR 高级铝制加热磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>9578</td><td>具体品牌不重要</td></tr></tbody></table>

研究神经肽及其他调节因子在成年蚊子排泄系统中的活性

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

对昆虫生理学的研究，特别是在那些作为病原体传播媒介并导致人类和其他脊椎动物疾病的物种中，为开发新型害虫控制策略奠定了基础。本文描述了一系列常规用于研究神经肽及其他神经因子（如生物胺）在埃及伊蚊（Aedes aegypti）排泄系统中功能作用的方法。负责原尿形成的马氏管（MTs）在从蚊体取出后仍可维持数小时的功能，从而可在激素处理后进行液体分泌量的测定。因此，拉姆齐（Ramsay）测定法是一种用于测量离体马氏管分泌速率的有效技术。随后可使用离子选择性微电极（ISME）测定分泌液中离子浓度（如 Na+ 和 K+）。该方法可在同一时间测定多个马氏管，以评估不同激素和药物的作用效果。扫描离子选择性电极技术（SIET）利用离子选择性微电极测量离子转运器官表面静止层中代表离子活性的电压，从而近乎实时地测定跨上皮离子转运过程。该方法可用于理解激素及其他调节因子在上皮组织离子吸收或分泌过程中的作用。后肠收缩测定也是一种有效的工具，可用于表征具有肌活性的神经肽，这些神经肽可能增强或减弱该器官排出多余液体和废物的能力。总体而言，这些方法有助于深入了解成蚊排泄系统的调控机制。这一点至关重要，因为排泄器官的功能协调对于蚊虫在羽化后、寻找合适脊椎动物宿主获取血餐前应对干燥应激等挑战具有关键意义。

DH的应用31 与未刺激的MT相比，导致分泌速率显著增加，证实其作为利尿激素的作用 伊蚊 蚊子（图1A）。当小管用 AedaeCAPA-1，DH中分泌速率降低31-刺激的MTs。 图1B 演示使用离子选择性电极测量 Na+ 分泌液滴中的浓度。DH的处理31 在微管上的 Na 没有影响+ 分泌液滴中的浓度；然而，随着施加 AedaeCAPA-1，Na+ 分泌液中的浓度显著增加。此外，与未刺激的对照组相比，DH31 导致显著更高的 Na+ 转运速率，而 AedaeCAPA-1 消除了 DH 的这种升高31-受刺激的肾小管（图1C）。这些样本结果共同展示了如何测量利尿激素和抗利尿激素作用后分泌液的速率...

本方案概述了用于研究成年蚊虫排泄系统（包括马氏管和后肠）的拉姆齐测定法、离子选择性微电极、扫描离子选择性电极技术（SIET）以及体外收缩测定法，这些方法可共同用于测量离子和液体分泌速率、收缩活动以及跨上皮离子转运。

对昆虫生理学的研究，尤其是在那些作为病原体传播媒介并导致人类及其他脊椎动物患病的物种中，提供了……

本方案描述了小型动物生理学家可用于阐明神经肽及其他调节消化和/或排泄系统激素因子作用的技术。这些技术能够对微型生物样本进行测量，而使用专为较大动物模型（例如啮齿类动物和蹄类动物）设计的技术则无法实现此类测量。该方法可深入了解肠道的内分泌调控机制，包括昆虫及体型相似的非昆虫物种胃肠道中与转运上皮以及平滑肌相关的功能。本实验中的昆虫肾小管操作将由我实验室的博士候选人 Farwa Sajadi 演示。此外，我实验室前研究生 Aryan Lajevardi 将演示以后肠为重点的实验方案。首先准备用于实验的 Ramsay 法和收缩性测定用培养皿。使用移液器向孔中加入最多20微升溶液。对于未刺激的对照组，向孔中加入20微升伊蚊生理盐水Schneider's培养基。所有孔加样完毕后，将水合矿物油倒入检测培养皿，直至孔和微型针均被浸没。将肾小管浸入孔中后，用镊子夹住肾小管的近端，将其从灌流液滴中取出，并将末端缠绕在固定针上。将肾小管在针上缠绕两圈，同时保持仍在灌流液滴中的肾小管长度与其他肾小管一致。制备钠离子选择性微电极时，使用1毫升注射器将电极后向填充100毫摩尔/升的氯化钠溶液。确保回填溶液充满至电极尖端。若出现气泡，可轻轻弹击微电极，或吸出溶液后重新填充。将10微升移液枪头浸入钠离子选择性离子载体溶液中。将电极垂直对准移液管，然后用戴着手套的手指堵住吸头底部以产生压力，挤出少量离子载体。小心地将离子载体液滴接触微电极尖端，确保不要将其碰断。取一个小型烧杯，加入约一半体积的 100 毫摩尔氯化钠溶液，并在烧杯内壁顶部放置一些建模用黏土。待离子载体被充分吸收后，将电极尖端朝下放置于烧杯内壁，使尖端浸入氯化钠溶液中。将ISME电极置于烧杯内，直至准备使用。制备ISME参比电极时，用500毫摩尔/升的氯化钾溶液反向填充电极，并将其存放在烧杯中。使用约3.5%的聚氯乙烯溶于四氢呋喃的溶液涂覆电极尖端，以防止电极浸入石蜡油时离子载体发生位移。校准钠电极时，将氯化钠标准溶液以10微升液滴的形式滴加到含有孵育后马尔皮基管的拉姆齐培养皿边缘。标准液滴应相距两厘米，高浓度液滴置于上方。将参比电极和氯离子选择性电极插入氯化银导线中，并使用连接在显微操作器上的电极夹具将其牢固固定。利用显微操作器将两个电极移至200毫摩尔的氯化钠液滴处，确保电极尖端不接触培养皿底部。打开静电计开始记录，并等待读数稳定。记录读数，然后继续下一个标准品的测量。在获取分泌速率的测量数据后，使用显微操作器小心地将参比电极和离子选择性电极移入分泌的液滴中。开启记录，待读数稳定后，记录数据。打开IPA-2离子/极谱放大器、光学显微镜和计算机。将钠选择性微电极安装在由氯化银丝构成的电极架上，并将其插入雌性连接器插孔中。从盛有氯化钾的烧杯中取出一支参比电极，用一根手指抵住其一端，并将玻璃毛细管向该手指方向倾斜，以防止琼脂漏出。小心地将一端插入支架中，确保无气泡产生。若出现气泡，需取出参比电极，用三摩尔氯化钾重新填充支架，然后重复操作。将电极支架插入母连接插座中。校准后，解剖器官。将含有已解剖样本的多聚赖氨酸培养皿置于显微镜载物台上，并将参考电极的尖端插入生理盐水中。将离子选择性微电极的尖端浸入生理盐水中，注意避免损坏尖端。在光学显微镜下观察，同时使用手动调节旋钮调整微电极的位置。调节微电极的垂直位置，使其尖端与器官或组织处于同一平面，然后打开电机开关以启用。利用计算机的箭头键，将微电极水平移动至距离组织三毫米的位置，以测量背景信号。准备就绪后，按下 F5 开始记录，获取五次背景活性的测量值。将微电极尖端移近组织，注意不要刺穿器官。降低按键灵敏度，将微电极尖端精确向右移动两微米，垂直于组织表面。在直肠垫部位获取三处记录，以确定离子活性最高的位点，然后在活性最高的位点获取基础盐溶液测量值。为记录后肠收缩，在培养皿的一个孔中加入已知体积的埃及伊蚊盐溶液。解剖完成后，小心地将附着中肠的离体后肠转移至另一培养皿的孔中，注意避免夹伤回肠。将肠道浸入孔板内的生理盐水中，并将显微固定针插入中肠和直肠部位。回肠不应受到张力，应观察到起始于前段回肠幽门瓣的自发性收缩。将视频相机连接至体视显微镜。然后将含有已解剖器官的培养皿置于显微镜下，录制两分钟视频。将 DH31 作用于未受刺激的马尔皮基氏管时，会导致液体分泌速率显著增加，从而证实了 DH31 在埃及伊蚊中作为利尿激素的作用。当对 DH31 刺激的马尔皮基氏管施加 AedaeCAPA-1 时，其分泌速率降低。采用离子选择性电极测定分泌液滴中的钠离子浓度。DH31作用于马尔皮基氏小管（MTs）对分泌液滴中的钠离子浓度无影响。然而，施加AedaeCAPA-1后，分泌液中的钠离子浓度显著升高。此外，与未刺激的对照组相比，DH31 导致钠离子转运速率显著升高，而 AedaeCAPA-1 则消除了 DH31 刺激后肾小管中钠离子转运的增加。采用扫描离子选择电极技术（SIET）检测成年雌性蚊虫直肠垫上皮中钠离子转运的变化。使用一种类白细胞介素类似物来观察钠离子吸收的变化，结果与生理盐水对照组相比，钠离子吸收减少了四倍。为了评估神经肽pyrokinin2对回肠运动性的作用，使用了美洲锥虫（Rhodnius prolixus）类似物，该类似物此前已被证明可激活埃及伊蚊（A.aegypti）回肠中富集的PK2受体。与基线水平相比，PK2显著抑制回肠收缩。在进行马尔皮基小管的Ramsay测定并测量离子或液体分泌速率时，必须确保小管在解剖过程中或转移至测定培养皿时未受到损伤。在进行Ramsay实验后，可利用药理学方法或反向遗传学技术靶向特定的膜转运蛋白，以阐明其在简单上皮中对溶质跨上皮转运的具体作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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