研究神经肽及其他调节因子在成年蚊子排泄系统中的活性

本方案描述了小型动物生理学家可用于阐明神经肽及其他调节消化和/或排泄系统激素因子作用的技术。这些技术能够对微型生物样本进行测量，而使用专为较大动物模型（例如啮齿类动物和蹄类动物）设计的技术则无法实现此类测量。该方法可深入了解肠道的内分泌调控机制，包括昆虫及体型相似的非昆虫物种胃肠道中与转运上皮以及平滑肌相关的功能。

本实验中的昆虫肾小管操作将由我实验室的博士候选人 Farwa Sajadi 演示。此外，我实验室前研究生 Aryan Lajevardi 将演示以后肠为重点的实验方案。首先准备用于实验的 Ramsay 法和收缩性测定用培养皿。

使用移液器向孔中加入最多20微升溶液。对于未刺激的对照组，向孔中加入20微升伊蚊生理盐水Schneider's培养基。所有孔加样完毕后，将水合矿物油倒入检测培养皿，直至孔和微型针均被浸没。

将肾小管浸入孔中后，用镊子夹住肾小管的近端，将其从灌流液滴中取出，并将末端缠绕在固定针上。将肾小管在针上缠绕两圈，同时保持仍在灌流液滴中的肾小管长度与其他肾小管一致。制备钠离子选择性微电极时，使用1毫升注射器将电极后向填充100毫摩尔/升的氯化钠溶液。

确保回填溶液充满至电极尖端。若出现气泡，可轻轻弹击微电极，或吸出溶液后重新填充。将10微升移液枪头浸入钠离子选择性离子载体溶液中。

将电极垂直对准移液管，然后用戴着手套的手指堵住吸头底部以产生压力，挤出少量离子载体。小心地将离子载体液滴接触微电极尖端，确保不要将其碰断。取一个小型烧杯，加入约一半体积的 100 毫摩尔氯化钠溶液，并在烧杯内壁顶部放置一些建模用黏土。

待离子载体被充分吸收后，将电极尖端朝下放置于烧杯内壁，使尖端浸入氯化钠溶液中。将ISME电极置于烧杯内，直至准备使用。制备ISME参比电极时，用500毫摩尔/升的氯化钾溶液反向填充电极，并将其存放在烧杯中。

使用约3.5%的聚氯乙烯溶于四氢呋喃的溶液涂覆电极尖端，以防止电极浸入石蜡油时离子载体发生位移。校准钠电极时，将氯化钠标准溶液以10微升液滴的形式滴加到含有孵育后马尔皮基管的拉姆齐培养皿边缘。标准液滴应相距两厘米，高浓度液滴置于上方。

将参比电极和氯离子选择性电极插入氯化银导线中，并使用连接在显微操作器上的电极夹具将其牢固固定。利用显微操作器将两个电极移至200毫摩尔的氯化钠液滴处，确保电极尖端不接触培养皿底部。打开静电计开始记录，并等待读数稳定。

记录读数，然后继续下一个标准品的测量。在获取分泌速率的测量数据后，使用显微操作器小心地将参比电极和离子选择性电极移入分泌的液滴中。开启记录，待读数稳定后，记录数据。

打开IPA-2离子/极谱放大器、光学显微镜和计算机。将钠选择性微电极安装在由氯化银丝构成的电极架上，并将其插入雌性连接器插孔中。从盛有氯化钾的烧杯中取出一支参比电极，用一根手指抵住其一端，并将玻璃毛细管向该手指方向倾斜，以防止琼脂漏出。

小心地将一端插入支架中，确保无气泡产生。若出现气泡，需取出参比电极，用三摩尔氯化钾重新填充支架，然后重复操作。将电极支架插入母连接插座中。

校准后，解剖器官。将含有已解剖样本的多聚赖氨酸培养皿置于显微镜载物台上，并将参考电极的尖端插入生理盐水中。将离子选择性微电极的尖端浸入生理盐水中，注意避免损坏尖端。

在光学显微镜下观察，同时使用手动调节旋钮调整微电极的位置。调节微电极的垂直位置，使其尖端与器官或组织处于同一平面，然后打开电机开关以启用。利用计算机的箭头键，将微电极水平移动至距离组织三毫米的位置，以测量背景信号。

准备就绪后，按下 F5 开始记录，获取五次背景活性的测量值。将微电极尖端移近组织，注意不要刺穿器官。降低按键灵敏度，将微电极尖端精确向右移动两微米，垂直于组织表面。

在直肠垫部位获取三处记录，以确定离子活性最高的位点，然后在活性最高的位点获取基础盐溶液测量值。为记录后肠收缩，在培养皿的一个孔中加入已知体积的埃及伊蚊盐溶液。解剖完成后，小心地将附着中肠的离体后肠转移至另一培养皿的孔中，注意避免夹伤回肠。

将肠道浸入孔板内的生理盐水中，并将显微固定针插入中肠和直肠部位。回肠不应受到张力，应观察到起始于前段回肠幽门瓣的自发性收缩。将视频相机连接至体视显微镜。

然后将含有已解剖器官的培养皿置于显微镜下，录制两分钟视频。将 DH31 作用于未受刺激的马尔皮基氏管时，会导致液体分泌速率显著增加，从而证实了 DH31 在埃及伊蚊中作为利尿激素的作用。当对 DH31 刺激的马尔皮基氏管施加 AedaeCAPA-1 时，其分泌速率降低。

采用离子选择性电极测定分泌液滴中的钠离子浓度。DH31作用于马尔皮基氏小管（MTs）对分泌液滴中的钠离子浓度无影响。然而，施加AedaeCAPA-1后，分泌液中的钠离子浓度显著升高。

此外，与未刺激的对照组相比，DH31 导致钠离子转运速率显著升高，而 AedaeCAPA-1 则消除了 DH31 刺激后肾小管中钠离子转运的增加。采用扫描离子选择电极技术（SIET）检测成年雌性蚊虫直肠垫上皮中钠离子转运的变化。使用一种类白细胞介素类似物来观察钠离子吸收的变化，结果与生理盐水对照组相比，钠离子吸收减少了四倍。

为了评估神经肽pyrokinin2对回肠运动性的作用，使用了美洲锥虫（Rhodnius prolixus）类似物，该类似物此前已被证明可激活埃及伊蚊（A.aegypti）回肠中富集的PK2受体。与基线水平相比，PK2显著抑制回肠收缩。在进行马尔皮基小管的Ramsay测定并测量离子或液体分泌速率时，必须确保小管在解剖过程中或转移至测定培养皿时未受到损伤。

在进行Ramsay实验后，可利用药理学方法或反向遗传学技术靶向特定的膜转运蛋白，以阐明其在简单上皮中对溶质跨上皮转运的具体作用。