Name: 使用打开的血管窗口和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗中的心室血流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习使用开放血管窗口和高分辨率荧光显微镜测量小鼠耳蜗血流的新方法。该技术可在正常和病理条件下详细观察耳蜗血流动态，为研究听力障碍相关的血流功能障碍提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院耳聋与其他沟通障碍研究所（NIH/NIDCD）R21 DC016157（X.Shi）、NIH/NIDCD R01 DC015781（X.Shi）和 NIH/NIDCD R01-DC010844（X.Shi）资助。&#160;俄勒冈健康与科学大学（OHSU）医学研究基金会（X.Shi）

注意：本实验为非存活手术。所有涉及动物使用的操作均经俄勒冈健康与科学大学机构动物护理与使用委员会审查并批准 &amp;#38; 科学大学（IACUC批准编号：TR01_IP00000968）。
1. 荧光标记血细胞的制备
<ol>
	<li>麻醉供体小鼠（约6周龄的雄性C57BL/6J小鼠），通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉溶液（5 mL/kg，参见 材料表). 
	&#8203;注意：该麻醉方案非常可靠，且能维持全身血压。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，打开&#160;用镊子和解剖剪打开皮肤并暴露胸腔。剪开膈肌，用持针钳夹住胸骨基部，剪开肋骨，抬起以暴露心脏。&#160;通过心脏穿刺采集1 mL血液至含肝素（15 IU/mL血液）的容器中，于3,000 × g 4 °C下离心3分钟。采血后通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>移除血浆，用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤血细胞沉淀，并以 3000 × g 离心 3 次 g 4 °C 下 3 分钟</li>
	<li>用1 mL浓度为20 mM的DiO或Dil PBS溶液标记血细胞，在室温下避光孵育30分钟23,24.</li>
	<li>离心并用 1 mL PBS 洗涤标记的血细胞，以 3000 × g 离心 3 次 g 4 °C下离心3分钟，然后将细胞沉淀重悬于约0.9 mL PBS中，调节至30%红细胞压积（终体积约1.3 mL），用于注射。</li>
</ol>
2. 创建开窗的手术操作 25
<ol>
	<li>准备无菌外科手术器械和成像平台，并在铺巾下方放置加热垫（图1A）。按照步骤1.1所述方法麻醉小鼠（约6周龄的雄性C57BL/6J小鼠），通过检测足部反射和总体肌张力来评估麻醉深度。将动物置于温热的加热垫上，并维持直肠温度在37 °C。</li>
	<li>将动物尾巴放入CODATM监测系统中以监测血压和心率（参见 材料表记录动物在麻醉状态下的收缩压、舒张压和平均动脉压（MBP）。 
	注意：动物在麻醉与非麻醉状态下，平均血压无显著差异（107 ± 11 mmHg 对比 97 ± 7 mmHg）。麻醉状态下动物心率稳定，虽较非麻醉状态偏低（仍在正常范围内）（357 ± 12 bpm 对比 709 ± 3 bpm）。对于被固定束缚的动物，预期会出现轻微的心率升高26.</li>
	<li>在体视显微镜下，通过外侧和腹侧入路打开左侧鼓泡 材料表），保留鼓膜和听小骨完整21.
	<ol>
		<li>将动物头部固定并调整位置以尽量减少移动，沿其颈部中线做一切口图1B切除左侧下颌下腺及二腹肌后腹并进行电凝止血。 
		注意：术中皮下注射布托啡诺（buprenorphine），剂量为0.05 mg/kg，以减轻疼痛。</li>
		<li>通过识别胸锁乳突肌和向前延伸至鼓室泡的面神经，定位并暴露骨性鼓室泡。</li>
		<li>用30 G针头打开骨性鼓室，再用手术镊子小心去除周围骨质，以清晰暴露耳蜗和镫骨动脉；镫骨动脉的内侧缘位于圆窗隐窝边缘上方，并向前上方走行至卵圆窗图1C，D). 
		注意：气管切开术旨在保持气道通畅，应&#160;仅在动物手术期间出现呼吸问题时进行。通常情况下，大多数处于麻醉状态的动物呼吸平稳。然而，如果动物在手术期间接受了气管切开术，则所记录的血流数据应&#160;不得用于任何比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用小型刀片（定制铣削的#16手术刀）刮除小鼠耳蜗顶回中段约距顶点1.25 mm处的侧壁骨，直至刮出一处薄弱点并使其破裂。用小型金属钩清除骨碎片图1E).</li>
	<li>用切割过的盖玻片覆盖血管窗，以维持正常的生理条件，并为记录血管图像提供光学观察视野。 
	注意：所有操作均需谨慎进行。除监测体温外，还应在整个手术过程中监测动物的生命体征，包括血压和心率。</li>
</ol>
3. 在FIVM下对CoBF进行成像
<ol>
	<li>沿右侧隐静脉做长约1 cm的切口，暴露血管（图1F）。</li>
	<li>通过隐静脉依次向动物体内注入100 μL FITC-葡聚糖溶液（2000 kDa，40 mg/mL，溶于PBS）和100 μL血细胞悬液（红细胞压积30%），以实现血管可视化并追踪血流速度（图1G）。</li>
	<li>注射后5分钟，在视频监视器上实时观察血流情况。使用配备长工作距离（W.D.）物镜（W.D. 30.5 mm，10倍，数值孔径0.26）以及带有多波段激发滤光片和匹配发射滤光片的灯箱的荧光显微镜对血管进行成像（材料表）。采用高分辨率黑白数码电荷耦合器件相机（材料表）以每秒2帧的速度录制视频。每段视频采集超过350帧图像，以确保血流速度分析的成功率。 
	注意：通过调节光学焦距，可对螺旋韧带和血管纹的血管进行成像（补充视频1）。</li>
</ol>
4. 视频分析
<ol>
	<li>使用适当的软件（材料表）测量血管直径，并确定所获图像中血管上两个固定点之间的距离。</li>
	<li>通过追踪标记的血细胞在图像位置间的空间移动距离，从捕获的视频帧中计算血流速度27。
	<ol>
		<li>在软件中打开血流视频（本方案使用 Fiji [ImageJ]），并设置图像的比例尺。</li>
		<li>使用追踪功能追踪选定的DiO染色血细胞。根据细胞移动的距离以及视频中图像帧之间的时间间隔，自动计算流速。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据以下公式计算体积流量（F）：F = V × A（V：流速；A：血管的横截面积）。</li>
</ol>
5. 噪声暴露
<ol>
	<li>将动物放入金属丝网笼中。在声暴露舱内，让其暴露于120 dB声压级的宽带噪声中，每次暴露3小时，次日再重复暴露3小时。 
	注意：本实验室常规使用的这种噪声暴露方案可导致耳蜗敏感性的永久性丧失28。</li>
</ol>

<ol><li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiopathology+of+the+cochlear+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Physiopathology of the cochlear microcirculation.</a> Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).</li>
<li>Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+cochlear+vascular+conductance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice.</a> Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).</li>
<li>Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decreases+in+endocochlear+potential+are+associated+with+vascular+abnormalities+in+the+stria+vascularis+%5Bcorrected+and+republished+article+originallly+printed+in+Hearing+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).</li>
<li>Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+noise-induced+hearing+loss+indicate+multiple+methods+of+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention.</a> Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).</li>
<li>Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrops-induced+changes+in+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Hydrops-induced changes in cochlear blood flow.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).</li>
<li>Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+inner+ear+blood+flow+in+animals+and+human+beings%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Studies of inner ear blood flow in animals and human beings.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Disorders of cochlear blood flow.</a> Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound-induced+cochlear+ischemia%2Fhypoxia+as+a+mechanism+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Noise+and+Health%22%5BJournal%5D)">Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss.</a> Noise and Health. 2 (5), 17(1999).</li>
<li>Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathophysiology+in+hearing+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hearing%22%5BJournal%5D)">Vascular pathophysiology in hearing disorders.</a> Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).</li>
<li>Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+measurements+in+the+ears+of+patients+receiving+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).</li>
<li>Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow+measured+by+averaged+laser+Doppler+flowmetry+%28ALDF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF).</a> Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).</li>
<li>Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laser+Doppler%3A+a+non-invasive+measure+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow.</a> Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).</li>
<li>Le Floc'h, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cochlear+inflammation+using+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Markers of cochlear inflammation using MRI.</a> Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).</li>
<li>Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+of+cochlear+microcirculation+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngologica%22%5BJournal%5D)">Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy.</a> Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).</li>
<li>Monfared, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mammalian+cochlear+blood+flow+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy.</a> Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).</li>
<li>Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+blood-flow+in+the+mouse+cochlea+using+an+endoscopic+laser+speckle+contrast+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system.</a> PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).</li>
<li>Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microsphere+method+for+studies+of+inner+ear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%22%5BJournal%5D)">The microsphere method for studies of inner ear blood flow.</a> ORL. 50 (6), 355-362 (1988).</li>
<li>Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+imaging+of+blood+flow+within+cochlea+in+gerbil+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Selected+Topics+in+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).</li>
<li>Subhash, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+in+vivo+imaging+of+microvascular+perfusion+within+the+intact+cochlea+in+mice+using+ultra-high+sensitive+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).</li>
<li>Reif, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+hypoxia+induced+changes+in+cochlear+blood+flow+and+hemoglobin+concentration+using+a+combined+dual-wavelength+laser+speckle+contrast+imaging+and+Doppler+optical+microangiography+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system.</a> PLoS One. 7 (12), 52041(2012).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+observation+and+measurement+of+red+blood+cell+velocity+in+vessels+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).</li>
<li>Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+blood+flow%3A+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Cochlear blood flow: measurement techniques.</a> American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).</li>
<li>Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+platelets+from+mouse+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of platelets from mouse blood.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+and+open+vessel+windows+for+intra-vital+fluorescence+imaging+of+murine+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow.</a> Hearing Research. 313, 38-46 (2014).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).</li>
<li>Dai, M., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-vascular+coupling+in+the+control+of+cochlear+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow.</a> PloS One. 6 (6), 20652(2011).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+pericyte+responses+to+acoustic+trauma+and+the+involvement+of+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor.</a> American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+subunit+B+signaling+promotes+pericyte+migration+in+response+to+loud+sound+in+the+cochlear+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).</li>
<li>Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hemodilution+on+cochlear+blood+flow+measured+by+laser-Doppler+flowmetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry.</a> American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文演示了如何在FIVM系统下，通过开放式血管窗制备结合荧光标记方法，对小鼠模型耳蜗侧壁（包括血管纹）中的毛细血管进行可视化观察。小鼠模型因其作为哺乳动物模型在研究中具有广泛应用而被广泛使用和优先选择&#160; 人类健康与疾病。本文所述方案是一种可行的方法，利用FIVM系统下开放的血管窗对小鼠外侧壁（特别是血管纹）中的耳蜗血流（CoBF）进行成像和研究。该方法具有足够的分辨率，可通过荧光标记的血细胞作为示踪剂来测定血流速度和血流量（如图所示） 图&#160;3 &amp;#38; 图&#160;4）。该方法可用于多种不同应用，例如血管通透性评估和检查&#160; 周细胞收缩力，以及&#160; 追踪循环骨髓细胞迁移25. 创伤、感染、噪声、异物、耳毒性药物或其他影响耳蜗侧壁的因素引起的耳蜗血流（CoBF）急性变化也可实时监测25,29.&#160;<br...

耳蜗侧壁微循环（包括大部分螺旋韧带和血管纹中的毛细血管）的正常功能对维持听力至关重要1。耳蜗血流（CoBF）异常参与多种内耳疾病的发生发展，包括噪声性听力损失、耳积水和老年性耳聋2,3,4,5,6,7,8,9。&#160;活体可视化耳蜗血流将有助于更深入理解听力功能与耳蜗血管病理之间的关联。
尽管耳蜗位于颞骨内，其结构复杂且位置深在，难以直接观察和测量耳蜗血流（CoBF），但目前已开发出多种评估CoBF的方法，包括激光多普勒血流仪（LDF）10,11,12、磁共振成像（MRI）13、荧光活体显微成像（FIVM）14、荧光微内窥成像（FME）15、内窥式激光散斑对比成像（LSCI）16，以及通过向血液中注射标记物和放射性标记微球的方法（光学微血管成像，OMAG）17,18,19,20。然而，除FIVM外，这些方法均无法实现对活体中CoBF变化的绝对实时追踪。FIVM结合耳蜗外侧壁的血管窗技术，已在不同实验条件下被多个实验室用于豚鼠，并经过验证14,21,22。
已成功建立一种FIVM方法，用于研究小鼠耳蜗微循环的结构和功能变化，该方法采用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖作为对比剂，并使用荧光染料DiO（3,3′-二辛基氧羰花青高氯酸盐，绿色）或Dil（1,1-二辛基-3,3,3,3-四甲基吲 carbocyanine 高氯酸盐，红色）预先标记血细胞，以实现血管可视化和血流速度追踪。本研究中，描述了该方法在正常及病理条件下（如噪声暴露后）对小鼠耳蜗血流（CoBF）变化进行成像和定量分析的实验方案。该技术为研究人员提供了必要的工具，可用于探究与听力功能障碍及血管纹病理机制相关的CoBF基础机制，尤其适用于结合现有转基因小鼠模型进行研究的情况。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1966-02</td><td>0.6 mL（配制成1 mL）</td></tr><tr><td>1,1&amp;prime;-二辛基-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>468495</td><td>20 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐（Dio）（3,3&amp;prime;-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4292</td><td>20 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>CODA 监测系统</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>CODA 监测仪，用于监测血压和心率</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>直流温度控制器</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>血管直径测量</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（2000 kDa）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000s</td><td>40 mg/mL</td></tr><tr><td>肝素钠注射液，USP 多剂量小瓶</td><td>Mylan</td><td>NDC 67457-374-12</td><td>5000 USP 单位/mL</td></tr><tr><td>Katathesia（100 mg/mL）</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0702-1</td><td>0.2 mL（配制成1 mL）</td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Mitutoyo</td><td>378-823-5</td><td>型号：M Plan Apo NIR 10x</td></tr><tr><td>ORCA-ER 相机</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>型号：C4742-80-12AG</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>2085387</td><td></td></tr><tr><td>Xyzaine（100 mg/mL，使用时稀释5倍）</td><td>Lloyd</td><td>LPFL04821</td><td>0.2 mL（配制成1 mL）</td></tr><tr><td>变倍体视显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>型号：SZ61，荧光显微镜</td></tr></tbody></table>

利用开放式血管窗和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗血管纹血流量

Measurement of Strial Blood Flow in Mouse Cochlea Utilizing an Open Vessel-Window and Intravital Fluorescence Microscopy

声音转导具有较高的代谢需求，耳蜗侧壁微血管系统的正常功能对于维持内耳电位、离子转运和液体平衡至关重要。已有报道指出，多种类型的听力障碍与耳蜗内微循环异常有关。由于缺乏可行的检测手段以及难以接近内耳，研究耳蜗血流（CoBF）病理变化如何影响听力功能具有较大挑战性。通过在耳蜗侧壁建立开放的血管观察窗，结合荧光活体显微技术，已可用于在体研究CoBF的动态变化。, 但主要在豚鼠中应用，直到最近才在小鼠中实现。本文及配套视频介绍了用于观察小鼠耳蜗血流的开放血管窗方法。具体内容包括：1）制备荧光标记的小鼠血细胞悬液；2）在麻醉小鼠体内构建用于活体显微观察的开放血管窗；3）通过离线分析成像记录，测量血流速度和血流量。本方法以视频形式展示，说明如何在小鼠中采用开放窗技术，研究正常和病理状态下耳蜗微循环的结构与功能变化。

在手术暴露耳蜗侧壁的毛细血管后（图1），可通过开放的血管窗利用活体高分辨率荧光显微镜观察FITC-葡聚糖标记血管中Dil标记的血细胞。图2A为FIVM下拍摄的代表性图像，显示小鼠耳蜗顶回至中回侧壁的毛细血管。这些血管的管腔因FITC-葡聚糖与血浆混合后产生的荧光而清晰可见。图像中还可清楚观察到分布在血管网络中的单个标记血细胞。根据位置可区分两种不同的毛细血管网络——螺旋韧带毛细血管和血管纹毛细血管（在直立显微镜下，血管纹位于螺旋韧带的光学下方，其毛细血管环更多，血管更细小25）。通过调节光学焦距，可分别评估两者的血流情况。如图2B、C所示，螺旋韧带的血管密度较血管纹稀疏。
噪声暴露小鼠模型的血管...

采用荧光示踪剂的开放式血管窗方法可提供足够的分辨率用于测量耳蜗血流（CoBF）。该方法有助于研究小鼠在正常和病理状态下CoBF的结构和功能变化。

声音的转导过程具有较高的代谢需求，侧壁微血管系统的正常功能对于维持……至关重要

耳蜗的正常血液供应对于耳蜗功能至关重要，尤其是对于维持耳蜗内电位，这是毛细胞信号转导所必需的驱动力。这一血液循环功能与多种类型的听力损失密切相关。深入了解耳蜗血流将有助于更有效地管理由血流功能障碍引起的听力障碍。然而，由于内耳难以检测，直接测量血流非常非常具有挑战性。目前评估耳蜗血流的技术仍在开发中。本文展示了我们实验室近期建立的一种方法：结合高分辨率荧光显微镜，打开肌肉窗以观察小动物（如小鼠）耳蜗内的血流情况。将该技术应用于转基因大鼠模型，有望推动研究深入揭示听力功能与血管内风险相关的耳蜗血流病理之间的联系。我们的操作应谨慎进行。除短暂的体表出血外，在手术过程中必须监测动物的生命体征，包括血压和心率。首先通过心脏穿刺采集约一毫米的肝素抗凝血液。在4°C条件下，以3000 × g离心3分钟。移除血浆后，用1毫升PBS重悬血细胞沉淀，于4°C、3000 × g离心3分钟，重复洗涤三次。用1毫升PBS中20微摩尔的DiO或Dil标记血细胞，在室温下避光孵育30分钟。用1毫升PBS洗涤标记的血细胞，并在3000 × g下离心3次，每次3分钟。将细胞沉淀重悬于PBS中，调节压积至约30%，体积约为0.9毫升，然后进行注射。准备无菌手术器械和成像平台，并在铺巾下放置加热垫。通过监测麻醉小鼠的翻正反射和全身肌张力来评估麻醉深度。将动物置于温热的加热垫上，并将其尾巴放入监测系统中以监测血压和心率。在麻醉状态下，维持动物的直肠温度为 37 摄氏度，并记录其收缩压、舒张压和平均动脉压。在体视显微镜下，通过外侧和腹侧入路打开左侧鼓室骨囊，保留鼓膜及听小骨完整。固定动物头部以减少移动，沿颈部正中线做切口。切除左侧下颌下腺及二腹肌后腹并进行电凝止血。通过辨认胸锁乳突肌和向前延伸至鼓室的面神经，定位并暴露骨性鼓室。用30号针头打开骨性鼓室，并用手术镊小心去除周围骨质，以清晰暴露耳蜗动脉和镫骨动脉，其中镫骨动脉的内侧缘覆盖在圆窗隐窝边缘，并向前上方延伸至卵圆窗。使用小刀片在距小鼠耳蜗顶点半约1.25毫米的中回侧壁骨处轻轻刮擦，直至骨壁出现变薄并裂开。用细金属钩清除骨碎片。用裁剪过的盖玻片覆盖血管窗，以维持正常的生理条件，并为记录血管图像提供光学视野。沿右侧隐静脉做一厘米切口，暴露血管。依次通过隐静脉向动物体内注入100微升FITC-葡聚糖溶液和100微升血细胞悬液，以实现血管的可视化和血流追踪。注射后五分钟，在视频监视器上实时观察血流情况。使用配备长工作距离物镜和带有多波段激发滤光片及相容发射滤光片灯箱的荧光显微镜对血管进行成像。采用高分辨率黑白CCD相机记录视频，每个视频采集超过350帧图像，以确保能够成功分析血流速度。使用适当的软件测量血管直径，并确定所获图像中血管上两个固定点之间的距离。在软件中打开血流视频并设置图像比例尺。利用追踪功能追踪选定的DiO标记的血细胞。然后利用细胞移动的距离以及视频中图像帧之间的时间间隔，自动计算流速。使用文稿中给出的公式计算体积流量。在记录血流之前，建立噪声暴露模型时，将动物置于金属丝网笼中，并在声暴露舱内使其暴露于120分贝声压级的宽带噪声中，持续三小时。然后在次日继续进行额外三小时。在噪声暴露后两周记录血流情况。在手术暴露耳蜗外侧壁的毛细血管后，通过开放的血管窗，对DiL标记的血细胞在FITC葡聚糖标记的血管中进行活体高分辨率荧光显微观察。此处显示了用FITC葡聚糖标记的血管中的DiL标记血细胞。用FITC葡聚糖标记的Dio标记血细胞显示，螺旋韧带的血管密度较血管纹致密区域更为稀疏。高分辨率IVM显示了对照组和噪声暴露组的血流模式。在暴露于噪声的各组中可观察到血流循环模式的紊乱。异常现象包括血管直径减小以及血管直径变异程度增加。通过追踪DiO标记的血细胞的运动轨迹，计算了对照组和噪声暴露组的血流速度。噪声暴露组的血流速度和血流量均显著低于对照组。成功建立开放血管窗需要较高的外科手术技巧。在去除耳蜗外侧壁的骨质时必须格外小心。

measurement-strial-blood-flow-mouse-cochlea-utilizing-an-open-vessel

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

使用打开的血管窗口和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗中的心室血流

介绍了一种用于观察微循环的新颖且多功能的方法。该方法适用于长期观察，并可与药理生理学或分子生物学干预相结合。...

活体显微镜下测量骨骼肌内微循环

可通过双光子显微镜成像经尾静脉注射荧光葡聚糖染料的啮齿类动物，从而在活体中研究大脑皮层的血流动力学。本视频展示了如何通过覆盖玻璃的颅窗制备方法，对小鼠新皮层的血流动力学进行成像。...

一种通过颅窗对新皮层血流进行双光子成像的方法

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。...

一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

本视频展示了利用活体荧光显微技术在小鼠模型中研究血栓形成的方法。通过向小鼠注射荧光标记的多糖以监测血液循环。当耳部微血管受到高强度光照时，光毒性诱导产生损伤，进而导致血栓形成；通过观察血流阻塞现象可确认血栓的生成。...

活体荧光显微镜观察微血管血栓形成

小鼠提睾肌微循环的活体显微镜观察提供了一种独特且高度标准化的方法 体内...

小鼠提睾肌微循环中周围干细胞迁移分析的活体显微镜观察

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。...

小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

本文报道了一种利用活体显微成像结合特定图像采集与分析方法，对小鼠肝脏血管系统中单个血管内血流速度进行动态测量与定量的详细实验方法。...

肝脏活体显微成像 利什曼原虫 感染：肝脏血流动力学评估

对眼循环中标记的血细胞进行活细胞成像，可提供有关糖尿病视网膜病变和年龄相关性黄斑变性中炎症与缺血的信息。本文描述了一种标记血细胞并在视网膜循环中对这些标记细胞进行成像的实验方案。...

荧光染料标记红细胞和白细胞以研究小鼠视网膜循环中的血流动力学

本文介绍了一种通过离体监测维持压力的动脉灌注压和血流，以及血管树组分（包括毛细血管床和周细胞），在活体小鼠心脏组织中研究冠状微循环的实验方案，其中间隔动脉被插管并加压。...

小鼠心脏毛细血管、小动脉及周细胞的动态测量与成像

小鼠视网膜血管系统在研究血管模式形成机制方面具有重要意义。本方案通过荧光血管造影眼底图像，自动测量距视盘固定距离处的小鼠视网膜血管直径。...

从小鼠荧光血管造影图像中测量视网膜血管直径

学习使用开放血管窗口和高分辨率荧光显微镜测量小鼠耳蜗血流的新方法。该技术可在正常和病理条件下详细观察耳蜗血流动态，为研究听力障碍相关的血流功能障碍提供重要工具。

利用开放式血管窗和活体荧光显微镜测量小鼠耳蜗血管纹血流量

探索更多视频