Name: 无激光羟基基蛋白足迹，对蛋白质进行更高级的结构分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习无激光羟基自由基蛋白质足迹技术，利用等离子光源和在线自由基剂量测定法进行蛋白质结构分析。该方法提高了标记重现性，为蛋白质相互作用位点鉴定和构象变化研究提供了更安全高效的实验方案。

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本工作由美国普通医学科学研究所资助（R43GM125420 和 R44GM125420）。

1. 安装毛细管
<ol>
	<li>使用石英切割石将内径（ID）为 250 µm 的石英毛细管切割至 27 英寸长。检查毛细管两端是否切口平整、平直。</li>
	<li>通过烧除聚酰亚胺涂层，制备两个长度约为 15 mm 的窗口。从“下端”开始，第一个光解窗口位于距“下端” 90 mm 处，第二个剂量计窗口位于距“下端” 225 mm 处。 
	注意：一旦涂层被烧除，毛细管将变得非常脆弱。</li>
	<li>拧松 5 号端口的螺母和卡套，并将毛细管的“下端”插入，使其略微超过卡套的锥形末端（图 1A）。</li>
	<li>在光解模块上，将光解池盖直接向外拔出以取下，然后取下磁性固定的金属掩模，该掩模用于固定毛细管。 
	警告：光解池盖内部有一个曲面镜，切勿让任何物体接触镜面。</li>
	<li>在剂量计模块上，通过按压左侧的卡舌打开剂量计池，并将剂量计池向右旋转打开。取下用于固定毛细管的磁性固定夹。</li>
	<li>将毛细管放入光解池底部的带槽通道中，使毛细管窗口与光解池窗口居中对齐。用一只手固定毛细管位置的同时，装上磁性掩模以固定毛细管。将光解池盖重新安装到位。</li>
	<li>将毛细管放入剂量计池底部的带槽通道中，使第二个毛细管窗口与剂量计池底中心的小孔对齐。用一只手固定毛细管位置的同时，将两个磁性夹安装到位以固定毛细管。关闭剂量计池，直至听到咔嗒声表示已闭合。</li>
	<li>将毛细管穿过产物收集器毛细管升降装置顶部的滚花螺母（图 1B），并将毛细管延伸至小瓶底部稍上方。 
	注意：在实验运行期间，为确保毛细管浸没在淬灭溶液中，毛细管必须到达小瓶底部附近。</li>
</ol>
2. 安装进样阀环
<ol>
	<li>使用外径为1/16英寸、内径为0.015英寸（381 µm）的聚四氟乙烯（Teflon）管。根据公式1计算所需管长。 
	<img alt="流体动力学公式 \(L=\frac{V}{π(\frac{d}{2})^2}\)；与流动动力学相关的公式。" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式1"> 
	其中L为以毫米为单位的管长，V为以微升为单位的所需体积，d为以毫米为单位的管道内径。当进样体积为25 µL、内径为381 µm时，所需管长约为219.3 mm。 
	注意：对于小于20 µL的体积，应使用内径为0.01英寸的PTFE管。</li>
	<li>使用切管器将聚四氟乙烯管切割至所需长度。检查管端是否切口平整、笔直。</li>
	<li>将新的进样环一端穿过一个螺母，并在管端装入一个新的卡套。固定卡套和螺母位置，将管插入进样阀的3号端口，直至完全插入阀体底部。牢固握住管子，用手拧紧螺母，再用扳手额外拧紧1/4圈。拆下并检查组装情况。 
	注意：如果卡套未固定到位，请重新安装并再拧紧1/8圈。对进样环的另一端重复相同操作。</li>
	<li>当两端均装有螺母和固定卡套后，将一端松松地拧入3号端口，另一端拧入6号端口（图1C）。就位后，先用手拧紧两侧，再用扳手在手紧基础上额外拧紧1/4圈。</li>
</ol>
3. 启动光解系统
<ol>
	<li>按以下顺序开启光解模块：（1）流体模块 （2）光解模块 （3）剂量测定模块 （4）产物收集器，最后（5）系统计算机并启动控制软件 
	注意：剂量测定模块从冷启动开始至少需要半小时预热时间。</li>
	<li>将注射泵上“阀门”位置的管路（图1D）完全浸入10 mL缓冲液中。将“废液”位置的管路（图1D）以及注射端口2号端口的管路（图1C）置于空容器中以收集废液。 
	注意：使用您的蛋白质将要悬浮于其中的缓冲液。推荐缓冲液为10 mM NaPO4。</li>
	<li>在产物收集器转盘上，将1.5 mL微量离心管放置在标记为H和6的位置。</li>
	<li>若使用内径为250 µm的毛细管，则设置加载流速为500 µL/min，处理流速为7.5 µL/min，废液流速为500 µL/min。</li>
	<li>使用公式2计算闪光延迟时间、产物时间和废液时间，以启用半自动模式。 
	<img alt="流体流速公式；公式：\( t = \frac{s \pi (d/2)^2}{f} \)；物理示意图。" src="/files/ftp_upload/61861/61861equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式2"> 
	其中t为时间（单位：分钟），s为毛细管长度（单位：毫米），d为毛细管内径（单位：毫米），f为流速（单位：µL/min）。
	<ol>
		<li>对于闪光延迟时间，距离为毛细管“下端”至第一个窗口的距离，约为90 mm。使用内径250 µm的毛细管和7.5 µL/min的处理流速时，样品约在35秒后到达光解窗口。在样品到达前应允许以1 Hz频率触发两次闪光，因此将闪光延迟时间设为33秒。</li>
		<li>对于产物时间，输入溶液从进样阀流至毛细管末端所需的时间。对于长度为27英寸、内径为250 µm的毛细管，将产物时间设为4.5分钟。</li>
		<li>对于废液时间，输入注入溶液总体积被完全收集所需的时间。在此期间，产物收集器将从产物位置移动至废液瓶。当进样体积为25 µL、流速为7.5 µL/min时，将废液时间设为7.8分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将进样阀置于加载位置，向进样口注入25 µL HPLC级水，重复5次以冲洗进样环。</li>
	<li>手动将进样阀旋转至“进样位置”，以冲洗系统的其余部分。在控制软件中选择处理（输出）以开始水流。在流动过程中，在产物收集器控制界面选择上升，提升产物收集毛细管的高度，以便观察毛细管末端。持续通水直至形成液滴。 
	注意：若未形成液滴，请检查进样阀是否泄漏。如有泄漏，松开螺母，重新安装毛细管后再次拧紧。</li>
</ol>
4. 测定实际的▪OH产率以检验缓冲液对自由基的清除作用。
<ol>
	<li>在控制软件中，选择流程（输出）以启动流体。在设置选项卡中，将闪光电压设为 0 V。在剂量计数据部分的手动控制选项卡下，选择开始采集数据 + 自动调零。</li>
	<li>选择产物小瓶（H）和废液小瓶（6）的位置。</li>
	<li>选择准备就绪，手动将进样阀旋至加载位置，并向进样口注入 25 µL 含 100 mM H2O2 的 1 mM 腺嘌呤溶液。注入完成后，手动将进样阀旋回进样位置。 
	注意：此操作将自动触发系统开始流动、启动等离子体源并采集剂量数据。</li>
	<li>通过进入设置选项卡并调整闪光电压，逐步升高电压。依次使用 500 V、750 V、1000 V 和 1250 V 重复步骤 4.2 和 4.3。在每个电压下，对腺嘌呤吸光度进行三次重复测量。</li>
	<li>选择计算选项卡以确定各样品的平均吸光度。首先点击选择，然后手动选取峰吸收值的起始点和终止点。在提供的空白区域中输入样品的描述信息。对所有采集的数据重复此操作。 
	注意：可能会形成气泡，导致剂量读数出现尖峰。在选择数据以计算平均吸光度时，应排除含气泡的区域。</li>
	<li>将数据复制粘贴至 Excel 中，计算每个电压下腺嘌呤吸光度的平均变化值，从而确定有效▪OH 产率。</li>
	<li>若使用多个样品条件（不同缓冲液/添加剂），需重复步骤 4.1–4.6，以对每种条件下的有效▪OH 产率进行归一化处理。</li>
</ol>
5. 修饰蛋白质以检测高级结构的变化。
<ol>
	<li>按1:1比例混合4 mM腺嘌呤与20 µM蛋白，制备含2 mM腺嘌呤和10 µM蛋白的溶液。</li>
	<li>使用0.3 mg/mL过氧化氢酶降解过量过氧化氢，并加入35 mM甲硫氨酸酰胺以淬灭任何残留自由基，配制淬灭溶液。将25 µL淬灭溶液分装至200 µL微量离心管中，以便与等体积的标记产物混合。</li>
	<li>将H2O2稀释至200 mM，并置于冰上保存。</li>
	<li>在控制软件的设置选项卡中，将闪光电压从0 V开始，以测定背景氧化信号。</li>
	<li>在手动控制选项卡中，依次选择开始数据采集 + 自动调零，然后选择处理（输出），再点击就绪，最后将进样阀切换至加载位置。</li>
	<li>将淬灭溶液置于产物收集转盘的1号位置。在系统控制软件中将产物小瓶编号更改为1。</li>
	<li>进样前立即混合12.5 µL腺嘌呤与蛋白混合液和12.5 µL H2O2，使终浓度为1 mM腺嘌呤、5 µM蛋白和100 mM H2O2。轻轻吹打混匀，短暂离心，于混合后10秒内通过进样口注入25 µL样品。</li>
	<li>将进样阀切换至进样位置，并等待样品完成处理。</li>
	<li>依次在500 V、750 V、1000 V和1250 V条件下重复采集，每个电压水平进行三次重复测量。</li>
	<li>按步骤4.5所述计算平均吸光度。将所有数据复制并粘贴至Excel表格中。</li>
</ol>
6. 关闭系统
<ol>
	<li>所有样品收集完毕后，将进样阀置于上样位置，注入25 µL高效液相色谱用水，重复五次，以冲洗注射端口和样品环。</li>
	<li>将进样阀转至进样位置，用高效液相色谱用水冲洗系统的其余部分。</li>
	<li>停止流速，关闭系统控制软件，并依次关闭模块：先关闭产物收集器，然后是剂量模块、光解模块，最后是流体模块。</li>
</ol>
7. 样品制备与液相色谱-质谱联用
<ol>
	<li>在含有 50 mM Tris 和 1 mM CaCl2 的条件下，将样品于 80 °C 孵育 20 分钟以使蛋白质变性。将样品冷却至室温后，按 1:20 的比例加入胰蛋白酶。在 37 °C 下过夜消化蛋白质，并在孵育过程中混合样品。次日早晨，将样品加热至 95 °C 并维持 10 分钟，以终止胰蛋白酶消化反应。</li>
	<li>使用连接超高效液相色谱（UPLC）系统的高分辨 LC-MS/MS 系统检测肽段。</li>
	<li>首先将样品加载至捕获柱（300 µm 内径 × 5 mm，100 Å 孔径，5 µm 粒径），并以每分钟 5.0 µL 的流速用含 2% 溶剂 B（乙腈和 0.1% 甲酸）的水溶液洗涤 3 分钟。</li>
	<li>在 C18 纳米柱（0.75 mm × 150 mm，2 µm 粒径，100 Å 孔径）上，以 300 nL/min 的流速，采用溶剂 A（含 0.1% 甲酸的水）和溶剂 B 之间的梯度对肽段进行分离。肽段洗脱梯度包括：在 22 分钟内线性升高溶剂 B 从 2% 至 35%，随后在 5 分钟内升至 95% 并保持 3 分钟以清洗色谱柱，然后在 3 分钟内恢复至 2% B 并保持 9 分钟以重新平衡色谱柱。</li>
	<li>以正离子模式采集数据。设定喷雾电压为 2400 V，离子传输管温度为 300 °C。</li>
	<li>采集 m/z 范围为 250–2000 的全扫描质谱数据，随后对丰度最高的前八个肽离子进行八次数据依赖性的 MS/MS 扫描。采用 35% 归一化能量的碰撞诱导解离（CID）对肽段进行碎裂。</li>
	<li>使用可用的蛋白质分析软件，针对包含目标蛋白质序列及相关蛋白水解酶信息的 FASTA 文件，鉴定 MS/MS 分析中检测到的所有未修饰肽段。</li>
	<li>使用 HRPF 数据处理软件搜索并定量修饰肽段。每种已鉴定肽段的氧化程度通过公式 3 计算，即：将修饰肽段的总色谱峰面积除以该肽段修饰与未修饰形式的总色谱峰面积。 
	P = [I(单次氧化) X 1 + I(双次氧化) X 2 + I(三次氧化) X 3 + ...]/[Iunoxidized + I(单次氧化) + I(双次氧化) + I(三次氧化) ...] 
	其中 P 表示每个肽分子的平均氧化事件数，I 表示未氧化肽段（Iunoxidized）以及具有 n 次氧化事件的肽段的峰面积。</li>
</ol>
8. 对于差异研究，在第二个条件下重复步骤 5-7。
注意：为确认可重复性，建议每种条件下除技术重复三次外，还需进行两次生物学重复。

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<li>Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping.</a> Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).</li>
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<li>Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Approach+Reveals+the+Composite+Conformational+Changes%2C+Order+of+Binding%2C+and+Affinities+for+Calcium+Binding+to+Calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).</li>
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<li>Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+the+Conformational+Ensemble+of+Cyt+C+Reveal+a+Compact+State+during+Peroxidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).</li>
<li>Poor, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+paramyxovirus+fusion+%28F%29+protein-refolding+event+from+pre-+to+postfusion+by+oxidative+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).</li>
<li>Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Buffer+Hydroxyl+Radical+Dosimetry+Using+Tris%28hydroxymethyl%29aminomethane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).</li>
<li>Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+critical+cysteine+in+EcoRI+DNA+methyltransferase+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).</li>
<li>Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+carboxyl+groups+on+uracil-DNA+glycosylase+inhibitor+protein+that+are+required+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).</li>
</ol>

E.E.C.、J.S.S. 和 S.R.W. 披露其在 GenNext Technologies, Inc. 拥有重大经济利益，该公司是一家致力于将高阶蛋白质结构分析技术商业化的早期企业。所提供的代表性数据已由无财务利益冲突的 S.K.M. 审核。

在任何氢自由基标记实验（HRPF）中，为确保蛋白质标记的准确性，有几个关键步骤需要注意。首先，需选择适当的流速和光源闪光频率，以确保样品的每个流份仅被照射一次。这可以保证蛋白质仅暴露于一次新生成的▪OH自由基脉冲中。一旦蛋白质被氧化，其高级结构可能发生改变。为了确保探测的是蛋白质的天然结构，每个蛋白质分子必须在单一瞬间内完成修饰。可通过剂量学方法来验证是否探测到了天然蛋白质结构：如果探测的是天然结构，则随着羟基自由基浓度的增加，氧化程度呈线性上升；然而，若高浓度的羟基自由基导致蛋白质在标记过程中发生部分去折叠，则氧化程度将显著增加，从而提供一种有效手段来确认实验是否在天然结构条件下进行。
确保适当终止反应也至关重要。这包括在标记过程中将适当的自由基清除剂与蛋白质混合。在本方法中，腺嘌呤不仅用于剂量测定，还能清除▪OH，从而限制自由基的寿命，同时实现对蛋白质的标记。通过限制自由基的寿命，可以更有把握地确认天然蛋白质结构正在被修饰。在完成标记过程后，重要的是将样品收集至含有过氧化氢酶和甲硫氨酸酰胺的淬灭溶液中，以分解过量的H2</s...

蛋白质构象及其相关的高级结构（HOS）是决定其正常生物学功能和异常行为的主要因素1。这一原则同样适用于生物制药，其结构和功能活性依赖于生产过程和环境的多个方面。生物制药HOS的变化已被证实与不良药物反应（ADR）相关，这些反应源于非期望的药理作用以及患者的免疫应答2,3。ADR的出现使生物制药行业意识到蛋白质HOS在生物治疗药物安全性和有效性中的关键作用，并促使业界提出对新型和改进型HOS分析技术的迫切需求4。
羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种用于追踪蛋白质高级结构（HOS）变化的有前景的技术。HRPF通过▪OH对蛋白质表面进行不可逆标记，随后结合质谱（MS）分析，以鉴定蛋白质的溶剂可及表面5,6,7。HRPF已成功用于检测蛋白质高级结构及其功能的缺陷8,9，表征单克隆抗体（mAb）的高级结构10,11,12,13，测定配体的结合解离常数（Kd）14，以及更多应用15,16,17,18,19。生成HRPF所需▪OH的一种常用方法是蛋白质快速光化学氧化法（FPOP），该方法利用高能量、快速的紫外激光使H2O2发生光解，从而产生▪OH。目前大多数FPOP系统依赖昂贵的准分子激光器，其使用具有危害性的气体（KrF），必须采取大量安全措施以避免对呼吸系统和眼睛造成损伤20。为避免吸入性危害，其他研究者采用四倍频的钕掺杂钇铝石榴石（Nd:YAG）激光器21，该方法虽无需使用有毒气体，但仍成本高昂，需要较高的操作专业技术，并且必须实施严格杂散光控制措施以保护使用者免受眼部伤害。
尽管使用高重复频率等离子体闪光光解（HRPF）可以获得大量信息，但其在生物制药领域的广泛应用尚未实现。限制HRPF推广的两个主要障碍包括：1）使用危险且昂贵的激光器，需要采取大量的安全防护措施20；以及2）由于背景对羟基自由基（▪OH）的清除作用，导致HRPF实验结果不可重复，从而限制了比较研究的开展22。为替代激光的使用，已开发出一种高速、高能量的等离子体闪光光解装置，可安全、简便地进行流动场诱导光氧化（FPOP）实验。为改善HRPF实验的不可重复性问题，引入了实时自由基剂量测定技术。
由于背景物质对▪OH的清除作用，HRPF技术的应用受到不可重复性的限制22。尽管▪OH是探测蛋白质拓扑结构的优良探针，但它们也会与样品中多种组分发生反应，因此有必要测定可用于氧化目标蛋白质的活性自由基的有效浓度。缓冲液配制、过氧化氢浓度、配体性质或光解条件的差异，可能导致对照组与实验组之间的氧化程度不同，从而在HOS差异研究中引入不确定性。引入实时自由基剂量测定技术可调节实际作用的▪OH剂量，从而提高HRPF实验的可信度与可重复性。自由基剂量测定在FPOP中的应用已有其他文献报道23,24,25，并在最近一篇出版物中进行了更详细的讨论26。本文中，我们描述了一种新型闪光光解系统与实时剂量测定技术的应用，用于标记马源脱辅基肌红蛋白（aMb），并在FPOP实验中将其肽段氧化水平与使用准分子激光器所获得的结果进行比较。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>任何品牌均可满足要求</td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L SGE 耐压注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 纳米柱（0.75 mm × 150 mm，2 &amp;micro;m）</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% 甲酸（v/v）的乙腈，LC/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>脱辅基肌红蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>任何 30% 的过氧化氢均可满足要求</td></tr><tr><td>甲硫氨酸酰胺</td><td>Chem-Impex</td><td>03109</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td>其他高分辨仪器（例如 Q Exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）也可使用</td></tr><tr><td>Pierce 胰蛋白酶，MS 级</td><td>Thermo Scientific</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro 切割石，1&quot; × 1&quot; × 1/32&amp;rdquo;</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>任何毛细管切割器均可满足要求</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 0.1% 甲酸（v/v）的水，LC/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>水，LC/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

无需激光的羟基自由基蛋白质足迹法用于蛋白质高级结构分析

Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins

羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种新兴且前景广阔的高级结构分析技术，可提供有关蛋白质结构变化、蛋白质-蛋白质相互作用或蛋白质-配体相互作用的信息。HRPF利用羟基自由基（▪OH）对蛋白质溶剂可及表面进行不可逆标记。由于其内在复杂性、高昂成本以及操作过程中的危险性，HRPF在生物制药领域的广泛应用受到显著限制。这些限制因素包括：1）使用复杂、危险且昂贵的激光器，需要采取大量的安全防护措施；2）由于▪OH被背景物质清除而导致HRPF实验不可重复，限制了比较研究的开展。本出版物提供了一种无需激光的HRPF系统的操作方案。该无激光HRPF系统采用高能、高压等离子体光源闪光氧化技术，并结合在线自由基剂量测定。等离子体光源在生成羟基自由基方面比基于激光的HRPF系统更安全、更易于使用且效率更高，而在线自由基剂量计则提高了实验的可重复性。综上所述，无激光HRPF系统有效解决了基于激光技术所存在的上述缺点与局限性。

高压等离子源与实时剂量测定相结合，可更精确地控制▪OH的产率，从而更准确地观察蛋白质高级结构的变化。添加腺嘌呤可实现有效的实时自由基剂量监测。腺嘌呤在被氧化后，其在265 nm处的紫外吸收会降低（图2A）。腺嘌呤吸光度的变化与可用于HRPF反应的自由基浓度直接相关，因此可在存在缓冲液、辅料和配体等自由基清除剂的情况下，有效监测自由基浓度的变化（图2B）。
在100 mM H2O2 和 1 mM 腺嘌呤存在下，肌红蛋白脱辅基蛋白（aMb）在四种逐渐升高的等离子体电压条件下进行了修饰（图3）。检测到六个肽段的氧化程度随腺嘌呤在265 nm处紫外吸收值的变化呈线性增加。腺嘌呤的紫外吸收是有效▪OH浓度的替代指标。氧化程度与自由基浓度变化之间的线性关系证实了标记过程中蛋白质高级结构未发生人为假象的改变。此外，使用高压等离子体源...

本方案介绍了一种利用在线自由基剂量测定和等离子体光源进行闪光氧化蛋白质足迹分析的方法。该方法取代了具有潜在危险的紫外激光，从而简化了蛋白质快速光化学氧化研究的操作，并提高了其实验重复性。

羟基自由基蛋白质足迹法（Hydroxyl Radical Protein Footprinting, HRPF）是一种新兴且具有前景的高级结构分析技术，可提供有关结构变化的信息……

无需激光的羟基自由基蛋白质足迹技术使得识别蛋白质相互作用位点及构象变化区域变得更加简便，从而加速了蛋白质聚集、结构与稳定性研究的进程。通过在线自由基剂量测定，用户可实时调节有效的羟基自由基剂量；借助实时自由基剂量监测，可在提高标记重复性的同时，节省实验时间与珍贵样品。首先，使用石英切割刀将内径为250 µm的石英毛细管切割至27英寸长，并检查毛细管两端是否具有平整且笔直的切口。制作两个长度约为15毫米的窗口。从毛细管的底端开始，向上烧除90毫米处的聚酰亚胺涂层以形成光解窗口，再向上烧除225毫米处的涂层以形成剂量计窗口。将毛细管的底端插入接头螺母和卡套的锥形末端稍超出的位置。将毛细管接入五号端口，用扳手拧紧至略超过手拧紧度即可。笔直向外拔出光解模块的光解池帽盖，然后取下磁性固定金属掩模，该掩模用于固定毛细管。按下左侧的卡舌，打开剂量计池，并向右翻开剂量计池。取下用于固定毛细管的磁性夹具。然后将毛细管放入光解池底部的凹槽通道中，并使毛细管窗口与光解池窗口居中对齐。固定毛细管位置后，加入磁性掩模。将光解帽重新放回原位。将毛细管插入剂量计细胞底部的凹槽通道中，并使第二根毛细管的窗口对准剂量计细胞中心的小孔。用一只手固定毛细管位置的同时，用另一只手将两个磁性夹具放置到位，以固定毛细管。关闭剂量计细胞室，直至听到咔嗒声表示已闭合。最后，将毛细管穿过产品收集器毛细管提升装置顶部的滚花旋钮，使毛细管延伸至小瓶底部略上方位置。使用切割工具截取所需长度的聚四氟乙烯管，并检查管端是否切口平整、笔直。将新的进样环的一端穿过其中一个螺母，并在管端装上一个新的卡套。在将管子插入进样阀的六号端口直至完全到位的过程中，用手固定螺母和卡套。用扳手拧紧螺母，然后确认螺母和卡套已牢固就位。当两端均装有螺母和固定卡套环后，将一端松松地拧入三号端口，另一端拧入六号端口。就位后，先用手拧紧两侧，然后用扳手再额外拧紧四分之一圈。依次启动流体模块、光解模块、剂量计模块、产物收集器和系统计算机，以开启无激光的 HRPF 系统。启动系统软件。将管路从注射泵的阀门位置完全浸入10毫升缓冲液中。将废液端的管路和注射泵端口2的管路引至一个空容器，用于收集废液。将1.5毫升微量离心管放置在产品收集器转盘上标记为HN6的位置。将进样阀置于上样位置，注入25微升HPLC级水，重复冲洗进样环5次。手动旋转进样阀以冲洗系统的其余部分。选择控制软件中的“Process”以开始流水，直至形成液滴。配制含有2毫摩尔腺嘌呤和10微摩尔蛋白的溶液。然后使用0.3毫克/毫升过氧化氢酶和35毫摩尔甲硫氨酸酰胺配制淬灭溶液。取25微升淬灭溶液分装至200微升微量离心管中。将过氧化氢稀释至200毫摩尔，并置于冰上保存。在控制软件中将闪光电压从0伏开始设置。该零电压对照将用于确定目标蛋白是否存在背景氧化。选择“开始数据自动归零”，然后选择“处

laser-free-hydroxyl-radical-protein-footprinting-to-perform-higher

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生物化学

无激光羟基基蛋白足迹，对蛋白质进行更高级的结构分析

本实验方案介绍了通过两种羟基自由基足迹法来定量分析依赖于镁离子（Mg(II)）的RNA三级结构形成的方法。...

通过“过氧化”和“氧化”羟基自由基足迹法监测RNA结构的平衡变化

精确质量测定是蛋白质研究过程中的重要步骤。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱（MS）可用于此类测定，其主要优势在于对盐类、去污剂和污染物具有良好的耐受性。本文展示了一种利用MALDI-MS分析分子量大于100...

基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法分析完整蛋白质（分子量大于100 kDa）

蛋白质构象与动力学对于理解蛋白质结构与功能之间的关系至关重要。氢交换结合高分辨率质谱法是一种多功能方法，可用于研究蛋白质的构象动力学，以及表征蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括结合界面和变构效应。...

利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

本文介绍了一种在单分子水平上评估复杂蛋白质样品中每种蛋白质组分标记均一性的实验方案。...

单分子水平下蛋白质组范围内的标记均一性定量分析

本文介绍了一种使用切片机的多功能冷冻切片BN-MS方案，适用于高分辨率复合物组分析。...

通过冷冻切片BN-MS分析实现高分辨率复合物组学分析

活体快速光化学蛋白质氧化（IV-FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，可用于在天然环境中绘制蛋白质结构图。本方案描述了IV-FPOP微流控流动系统的组装与设置。...

体内羟基自由基蛋白质足迹法用于研究蛋白质相互作用 秀丽隐杆线虫

本文利用一种称为细胞内快速光化学蛋白质氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，在活细胞中表征蛋白质结构及相互作用位点。...

利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

蛋白质的快速光化学氧化是一种新兴的蛋白质结构表征技术。不同的溶剂添加剂和配体具有各异的羟基自由基清除特性。为了比较不同条件下的蛋白质结构，需要对反应中产生的羟基自由基进行实时校正，以标准化反应条件。...

实现快速蛋白质光化学氧化中实时校正以确定蛋白质拓扑结构变化

本文描述了基于焦碳酸二乙酯的共价标记实验步骤，并结合质谱检测方法。焦碳酸二乙酯可直接与目标蛋白质或蛋白质复合物混合，从而修饰溶剂可及的氨基酸残基。经过蛋白酶消化及液相色谱-质谱分析后，即可鉴定出被修饰的残基。...

通过质谱法研究蛋白质高级结构的二乙基焦碳酸酯共价标记

一种新的静态平台被用于在天然细胞环境中表征蛋白质结构及相互作用位点，该方法利用了一种称为细胞内快速光化学氧化蛋白质（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术。...

带有可移动XY载物台的培养箱平台：一种用于细胞内快速光化学蛋白质氧化的新平台

学习无激光羟基自由基蛋白质足迹技术，利用等离子光源和在线自由基剂量测定法进行蛋白质结构分析。该方法提高了标记重现性，为蛋白质相互作用位点鉴定和构象变化研究提供了更安全高效的实验方案。

无需激光的羟基自由基蛋白质足迹法用于蛋白质高级结构分析

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