Name: 通过中子自旋回声光谱研究蛋白质动力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解中子自旋回声光谱技术如何用于研究蛋白质溶液中的动力学，观察蛋白质结构域在皮秒至纳秒时间尺度上的重排。该方法为生物物理学研究提供了重要工具。

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本研究使用了橡树岭国家实验室运营的美国能源部科学用户设施——散裂中子源（Spallation Neutron Source）的资源（束线15、束线6，生物学与化学实验室）。本研究还使用了德国加兴MLZ-FRM2反应堆（KWS-2、Phoenix-J-NSE）以及德国于利希研究中心有限公司（Forschungszentrum Jülich GmbH）JCNS1的资源。作者感谢Ralf Biehl博士和Andreas Stadler博士在建模方面的帮助，以及他们在IgG和MBP蛋白研究中的贡献；感谢Piotr A. Żołnierczuk博士在中子自旋回声（NSE）数据约化方面的支持；感谢Changwoo Do博士在小角中子散射（SANS）测量方面的支持；并感谢Rhonda Moody和Kevin Weiss博士在SNS生物化学实验室提供的支持。

本研究表征了两种蛋白质：一种常规的人源抗体蛋白IgG，以及一种内在无序的MBP蛋白。这些蛋白质的冻干粉购自商业来源（见材料表）。
1. 蛋白质样品制备
<ol>
	<li>通过称量并分别将固体试剂溶解于重水（D2O）中，配制 50 mM 磷酸钠 + 0.1 M 氯化钠缓冲液（参见材料表）。此为IgG的氘代缓冲溶剂。
	<ol>
		<li>将缓冲液的pH值调节至6.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过称量并分别将固体组分溶解于重水（D2O）中，配制 20 mM 磷酸钠 + 6 M 尿素缓冲液。此为MBP的氘代缓冲溶剂。
	<ol>
		<li>将缓冲液的pH值调节至4.7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用孔径为0.2 µm的滤膜过滤缓冲溶剂（参见材料表）。</li>
	<li>将纯化的蛋白冻干粉末称量后，分别溶于对应的氘代溶剂（步骤1.1–1.2）中，配制成高蛋白浓度（约50 mg/mL）的溶液。</li>
	<li>将蛋白溶液装入带有3.5 K MWCO透析膜的透析篮中，在过滤后的缓冲液中透析24小时，MBP在10 °C下透析，IgG在25 °C下透析（参见材料表），并轻微振荡管子以形成扩散梯度。</li>
	<li>使用透析缓冲液将蛋白溶液稀释成一系列浓度：1、2、5、10和50 mg/mL。</li>
	<li>使用Nanodrop分光光度计测定蛋白溶液的准确浓度（参见材料表）。</li>
</ol>
2. 通过动态光散射（DLS）进行样品的初步表征
<ol>
	<li>将上述浓度系列（步骤 1.6）中的每种蛋白质溶液各 80 µL 加入动态光散射一次性比色皿（参见材料表），测定扩散系数，并对 10 次测量结果取平均值。</li>
	<li>绘制平移扩散系数随蛋白质浓度变化的曲线，并外推至零浓度。</li>
	<li>将浓度系列中的每种蛋白质溶液分别注入黏度计的毛细管中（参见材料表），测量其动态黏度。</li>
	<li>绘制动态黏度随蛋白质浓度变化的曲线，并外推至零浓度。 
	注意：将动态光散射测得的扩散系数外推至零浓度，可得到单个蛋白质分子的平移扩散系数；将动态黏度外推至零浓度，应得到缓冲液溶液在实验条件下测得的动态黏度值。</li>
</ol>
3. 小角散射（中子或X射线）的采集
<ol>
	<li>在四种蛋白质浓度（建议为 2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL 和 50 mg/mL）下测量小角中子散射（SANS）和/或小角X射线散射（SAXS）（参见材料表）。</li>
	<li>通过蛋白质浓度对SANS和SAXS谱图进行归一化处理。</li>
	<li>使用系综优化31和/或SasView32软件，将蛋白质形状因子 P(Q) 拟合到SANS和SAXS谱图上。</li>
	<li>通过将每个浓度下的SANS和SAXS信号除以 P(Q)，计算结构因子 S(Q, c)。 
	注意：希望了解如何测量和解释小角散射数据以支持NSE测量的读者，建议仔细查阅参考文献23,28,31,32,33。</li>
</ol>
4. 神经元特异性烯醇化酶（NSE）的测定
<ol>
	<li>按照以下步骤准备实验并安装样品。
	<ol>
		<li>根据蛋白质溶液的浓度、测量所需的温度以及可用溶液的量，选择用于加样样品池的厚度。 
		注：本研究使用了尺寸为 40 mm × 30 mm × 4 mm 的顶部加载透明石英容器。</li>
		<li>交替使用无磷酸盐洗洁剂（见材料表）、去离子水和 70% 乙醇反复清洗样品池。</li>
		<li>将样品池置于鼓风烘箱中干燥；石英样品池的温度不得超过 80 °C。</li>
		<li>向样品池中加入 4 mL 蛋白质溶液，并盖上盖子。使用石蜡膜或任何密封剂（见材料表）密封样品池。 
		注：在本研究中，使用了约 50 mg/mL 浓度的 4.8 mL 溶液，以获得足够的散射强度。</li>
		<li>在与蛋白质样品相同的容器中加入 4 mL 透析缓冲液，并进行密封。</li>
		<li>将样品运送至光束线，关闭快门，并进入谱仪屏蔽室区域34。</li>
		<li>通过拧紧螺丝和固定板，将样品池安装在铝制样品支架上（图 2，左图）。 
		注：若所有样品需要相同的测量程序，则可同时安装两个样品池。</li>
		<li>将石墨样品和/或装在与蛋白质样品相同容器中的 Al2O3 粉末样品进行安装。这些标准样品由 SNS-NSE 光束线支持团队提供。</li>
		<li>轻轻滑动样品支架，将其放入温度强制系统（TFS，见材料表）的套筒中。 
		注：TFS 是 SNS-NSE 最常用的样品环境系统，通过向样品容器内泵入干燥空气以达到设定温度（图 2，中图和右图）。</li>
		<li>关闭 TFS 盖子，并通过访问 TFS 的交互式屏幕将温度设置为所需值。</li>
		<li>安装中子相机（见材料表），用于将样品对准中子束。</li>
		<li>清扫仪器屏蔽室，抽真空，关闭门，并打开光束快门。 
		注：样品池由 SNS-NSE 光束线支持团队提供。有关可用的样品池和样品环境库，请参阅 SNS-NSE 光束线网页7,35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤采集 NSE 数据。
	<ol>
		<li>使用中子相机和四个独立的样品光阑，将样品在中子束中对准。</li>
		<li>打开 SNS-NSE 数据采集软件36，通过运行所需散射角和波长的衍射扫描来采集样品统计数据。</li>
		<li>根据协助仪器科学家提供的测量宏文件，编辑并设置每个样品的测量参数。</li>
		<li>在命令提示符中输入协议名称以开始扫描，并采集样品的回波信号。</li>
		<li>同样对弹性参考样品和缓冲溶剂开始扫描并采集回波信号。在更换样品期间进行间歇性的光束快门操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="中子相机装置，带有铝制和TFS样品架，用于散射实验的中子束窗口。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：NSE测量系统。 左图：石英容器中的蛋白质溶液样品，通过螺钉和压板固定在铝（Al）样品架上。铝制样品架可在样品环境中同时安装两个样品。中图：温度控制装置（TFS）样品可安装在样品台处，中子束窗口位于右侧，用于准直的中子相机可见于左侧。右图：将带有两个样品的样品架装入带有硅（Si）窗口的样品罐中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. NSE 数据处理
注意：SNS-NSE 配备了专用软件 DrSpine（自旋回波数据约简软件）37,38，该软件位于橡树岭国家实验室中子科学远程分析集群上，同时提供快速用户指南和内置帮助支持。
<ol>
	<li>使用 ORNL 用户凭证登录中子科学远程分析集群（参见材料表），然后点击启动会话按钮。</li>
	<li>按照以下步骤设置数据还原软件。
	<ol>
		<li>在用户目录中，打开一个终端窗口并输入：source/SNS/software/nse/etc/setup_nse.sh。</li>
		<li>接着输入：drspine_create_env.sh。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在主目录中创建一个用于数据还原的文件夹，并从共享目录复制提供的脚本和宏文件。</li>
	<li>根据需要编辑、重命名并保存提供的还原宏文件。</li>
	<li>在命令提示符下输入drspine，然后按回车键以启动软件还原环境。</li>
	<li>在软件环境中，于命令提示符下输入第 5.4 步中编辑的“还原宏名称”，然后按Enter键。</li>
</ol>
6. NSE 数据拟合
<ol>
	<li>使用辅助仪器科学家提供的名为“stapler-drspine.py”的Python脚本，并编辑其中的已约化数据文件名称。 
	注意：该Python脚本对仪器用户完全开放。</li>
	<li>从提供的库中编辑拟合函数。</li>
	<li>在命令行提示符中输入已编辑的脚本名称“stapler-drspine.py”，然后按 Enter 键，以读取、拟合并绘制约化的NSE数据。 
	注意：仪器科学家将提供一个用于数据约化的宏模板，以及“stapler-drspine.py”Python脚本，该脚本可用于读取和拟合约化的NSE数据。最终的约化NSE数据为ASCII格式，可用多种用户偏好的软件读取。</li>
</ol>

<ol><li>Fitter, J., Gutberlet, T., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitter%2C+J+%22Neutron+Scattering+in+Biology%3A+Techniques+and+Applications%22">Neutron Scattering in Biology: Techniques and Applications</a>. , New York. (2006).</li>
<li>Stadler, A., Monkenbusch, M., Biehl, R., Richter, D., Ollivier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+spin-echo+and+TOF+reveals+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physical+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Neutron spin-echo and TOF reveals protein dynamics in solution.</a> Journal of the Physical Society of Japan. 82, (2013).</li>
<li>Inoue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+domain+fluctuations+on+50-ns+timescale+enable+catalytic+activity+in+phosphoglycerate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Large domain fluctuations on 50-ns timescale enable catalytic activity in phosphoglycerate kinase.</a> Biophysical Journal. 99 (7), 2309-2317 (2010).</li>
<li>Callaway, D. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controllable+activation+of+nanoscale+dynamics+in+a+disordered+protein+alters+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controllable activation of nanoscale dynamics in a disordered protein alters binding kinetics.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (7), 987-998 (2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Biehl, R., Changwoo, D., Richter, D., Stadler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+internal+friction+by+osmolyte+interaction+in+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced internal friction by osmolyte interaction in intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (1), 292-296 (2020).</li>
<li>Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+neutron+spectroscopy-a+tool+for+the+investigation+of+dynamics+of+polymers+and+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Physique%22%5BJournal%5D)">High resolution neutron spectroscopy-a tool for the investigation of dynamics of polymers and soft matter.</a> Comptes Rendus Physique. , (2007).</li>
<li>Richter, D., Monkenbusch, M., Schwahn, D. Neutron Scattering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRichter%2C+D+%22Polymer+Science%3A+A+Comprehensive+Reference%2C+10+Volume+Set%22">Polymer Science: A Comprehensive Reference, 10 Volume Set</a>. , (2012).</li>
<li>Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+CC+%22Single+Crystal+Neutron+Diffraction+From+Molecular+Materials%22">Single Crystal Neutron Diffraction From Molecular Materials</a>. , World Scientific. Singapore. (2000).</li>
<li>Marshall, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarshall%2C+W+%22Theory+of+thermal+neutron+scattering%22">Theory of thermal neutron scattering</a>. , Oxford University Press. (1971).</li>
<li>Roger Pynn Introduction & Neutron Scattering &#34;Theory&#34. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf">https://neutrons.ornl.gov/sites/default/files/intro_to_neutron_scattering.pdf</a> (2004).</li>
<li>Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+in+polymer+physics%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering in polymer physics.</a> Physica B: Condensed Matter. 276-278, 22-29 (2000).</li>
<li>Harroun, T. A., Wignall, G. D., Katsaras, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutron+scattering+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+Scattering+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutron scattering for biology.</a> Neutron Scattering in Biology. , (2006).</li>
<li>SNS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/sna">https://neutrons.ornl.gov/sna</a> (2020).</li>
<li>HFIR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/hfir">https://neutrons.ornl.gov/hfir</a> (2020).</li>
<li>CNCS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/cncs">https://neutrons.ornl.gov/cncs</a> (2020).</li>
<li>Perticaroli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+hydration+water+in+protein+%28green+fluorescent+protein%29+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Description of hydration water in protein (green fluorescent protein) solution.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (3), 1098-1105 (2017).</li>
<li>Perticaroli, S., Nickels, J. D., Ehlers, G., Sokolov, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigidity%2C+secondary+structure%2C+and+the+universality+of+the+boson+peak+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rigidity, secondary structure, and the universality of the boson peak in proteins.</a> Biophysical Journal. 106 (12), 2667-2674 (2014).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+flexibility+change+in+cytochrome+p450cam+substrate+binding+determined+by+neutron+scattering%2C+NMR%2C+and+molecular+dynamics+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coupled flexibility change in cytochrome p450cam substrate binding determined by neutron scattering, NMR, and molecular dynamics simulation.</a> Biophysical Journal. 103 (10), 2167-2176 (2012).</li>
<li>Mamontov, E., Zamponi, M., Hammons, S., Keener, W. S., Hagen, M., Herwig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASIS%3A+A+new+backscattering+spectrometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neutron+News%22%5BJournal%5D)">BASIS: A new backscattering spectrometer at the SNS.</a> Neutron News. 19 (3), 22-24 (2008).</li>
<li>Mamontov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+diffusion+processes+measured+in+living+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microscopic diffusion processes measured in living planarians.</a> Scientific Reports. 9, 8708(2018).</li>
<li>Alpert, Y., Cser, L., Faragó, B., Franěk, F., Mezei, F., Ostanevich, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+flexibility+in+pig+immunoglobulin+G+studied+by+neutron+spin-echo+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Segmental flexibility in pig immunoglobulin G studied by neutron spin-echo technique.</a> Biopolymers. 24 (9), 1769-1784 (1985).</li>
<li>Bu, Z., Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupled+protein+domain+motion+in+Taq+polymerase+revealed+by+neutron+spin-echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coupled protein domain motion in Taq polymerase revealed by neutron spin-echo spectroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (49), 17646-17651 (2005).</li>
<li>Biehl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+correlated+interdomain+motion+in+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Direct observation of correlated interdomain motion in alcohol dehydrogenase.</a> Physical Review Letters. 101, 138102(2008).</li>
<li>Farago, B., Li, J., Cornilescu, G., Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+nanoscale+allosteric+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activation of nanoscale allosteric protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (10), 3473-3482 (2010).</li>
<li>Bu, Z., Callaway, D. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+propagation+of+long-range+allosteric+signals+by+nanoscale+protein+domain+motion+revealed+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Dynamic propagation of long-range allosteric signals by nanoscale protein domain motion revealed by neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 100 (3), 223(2011).</li>
<li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+a+compact+state+of+a+multidomain+protein%2C+the+mercuric+ion+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of a compact state of a multidomain protein, the mercuric ion reductase.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 393-400 (2014).</li>
<li>Longeville, S., Stingaciu, L. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin+diffusion+and+the+dynamics+of+oxygen+capture+by+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin diffusion and the dynamics of oxygen capture by red blood cells.</a> Scientific Reports. 7, 10448(2017).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+induction+due+to+free+larmor+precession%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Nuclear induction due to free larmor precession.</a> Physical Review. 77, 297(1950).</li>
<li>Hahn, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+echoes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Spin echoes.</a> Physical Review. 80, 580(1950).</li>
<li>Svergun, D. I., Koch, M. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+studies+of+biological+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution.</a> Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735-1782 (2003).</li>
<li>Sasview. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sasview.org">https://www.sasview.org</a> (2020).</li>
<li>Zhao, J. K., Gao, C. Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+Q-range+small-angle+neutron+scattering+diffractometer+at+the+SNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The extended Q-range small-angle neutron scattering diffractometer at the SNS.</a> Journal of Applied Crystallography. 43, 5 PART 1 1068-1077 (2010).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-resolution+neutron+spin-echo+spectrometer+for+the+SNS+with+%CF%84+%E2%89%A5+1+%C2%B5s%5BTitle%5D)+AND+%22Physica+B%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">The high-resolution neutron spin-echo spectrometer for the SNS with τ ≥ 1 µs.</a> Physica B: Condensed Matter. 350, 147-150 (2004).</li>
<li>SNS-NSE web page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://neutrons.ornl.gov/nse">https://neutrons.ornl.gov/nse</a> (2022).</li>
<li>Ohl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spin-echo+spectrometer+at+the+Spallation+Neutron+Source+%28SNS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research%2C+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">The spin-echo spectrometer at the Spallation Neutron Source (SNS).</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 696, 85-99 (2012).</li>
<li>Zolnierczuk, P. A., Holderer, O., Pasini, S., Kozielewski, T., Stingaciu, L. R., Monkenbusch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+data+extraction+from+neutron+time-of-flight+spin-echo+raw+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Efficient data extraction from neutron time-of-flight spin-echo raw data.</a> Journal of Applied Crystallography. 52 (5), 1022-1034 (2019).</li>
<li>Dr Spine hub. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine">https://jugit.fz-juelich.de/nse/drspine</a> (2022).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), (2014).</li>
<li>FZJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs">https://www.fz-juelich.de/portal/EN/AboutUs</a> (2022).</li>
<li>KWS2. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://miz-garching.de/kws-2">https://miz-garching.de/kws-2</a> (2022).</li>
<li>Moorhouse, M., Barry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+databank%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+Biocomputing+and+Perl%22%5BJournal%5D)">The protein databank.</a> Bioinformatics Biocomputing and Perl. , (2005).</li>
<li>Tria, G., Mertens, H. D. T., Kachala, M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+ensemble+modelling+of+flexible+macromolecules+using+X-ray+solution+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering.</a> IUCrJ. 2 (2), 207-217 (2015).</li>
<li>Holderer, O., Monkenbusch, M., Schätzler, R., Kleines, H., Westerhausen, W., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCNS+neutron+spin-echo+spectrometer+J-NSE+at+the+FRM+II%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The JCNS neutron spin-echo spectrometer J-NSE at the FRM II.</a> Measurement Science and Technology. 90 (4), 043107(2008).</li>
<li>Biehl, R., Monkenbusch, M., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+internal+protein+dynamics+by+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Exploring internal protein dynamics by neutron spin echo spectroscopy.</a> Soft Matter. 7 (4), 1299-1307 (2011).</li>
<li>Stingaciu, L. R., Ivanova, O., Ohl, M., Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+antibody+fragment+motion%3A+Flexible+linkers+act+as+entropic+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast antibody fragment motion: Flexible linkers act as entropic spring.</a> Scientific Reports. 6, 22148(2016).</li>
<li>Stadler, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+nanosecond+dynamics+in+the+intrinsically+disordered+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Internal nanosecond dynamics in the intrinsically disordered myelin basic protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6987-6994 (2014).</li>
<li>Biehl, R., Richter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+internal+protein+dynamics+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Slow internal protein dynamics in solution.</a> Journal of Physics: Condensed Matter. 26 (50), 503103(2014).</li>
<li>Hinsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+modeling+toolkit%3A+A+new+approach+to+molecular+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular modeling toolkit: A new approach to molecular simulations.</a> Journal of Computational Chemistry. 21 (2), 79-85 (2000).</li>
<li>Uhlenbeck, G. E., Ornstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion.</a> Physical Review. 36 (5), 823(1930).</li>
<li>Wang, M. C., Uhlenbeck, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+theory+of+the+Brownian+motion+II%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">On the theory of the Brownian motion II.</a> Reviews of Modern Physics. 17, 323(1945).</li>
<li>Callaway, D. J. E., Bu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+protein+domain+motion+and+long-range+allostery+in+signaling+proteins-a+view+from+neutron+spin+echo+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoscale protein domain motion and long-range allostery in signaling proteins-a view from neutron spin echo spectroscopy.</a> Biophysical Reviews. 7 (2), 165-174 (2015).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+scattering+function+for+macromolecules+in+solution+probed+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Intermediate scattering function for macromolecules in solution probed by neutron spin echo.</a> Physical Review E. 95, 020501(2017).</li>
<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+dynamics+of+proteins+in+solutions+studied+by+neutron+spin+echo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Short-time dynamics of proteins in solutions studied by neutron spin echo.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 42, 147-156 (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益和利益冲突。本文内容基于作者在2019年至2021年期间于HANDS-中子散射在结构生物学中的应用学校所作的讲座。

中子自旋回声（NSE）谱学能够提供蛋白质动力学的独特且详细的视图，这是其他光谱技术无法实现的。如本文所述，通过在较长时间尺度上的测量，可以同时观测到蛋白质的平动扩散和转动扩散。区段动力学及其他内部振荡在短时间尺度上表现为相干散射函数 S(Q, t) 的显著衰减，并且与整体扩散松弛过程有良好的分离。NSE 技术的主要局限性在于测量时间较长以及需要较大的样品体积，以获得良好的统计信号。这对于浓度较低、寿命较短的可移动物种相关的生物大分子体系的测量可能构成挑战。
IgG的内部动力学 
IgG蛋白具有抗体特异性的Y形结构，可近似为由柔性连接区相连的三个大片段。针对此类结构，假设了一个由处于谐振势中的三个大颗粒组成的数学模型。连接区被近似为弹性弹簧，其提供固定的平衡位置，但允许以布朗运动形式发生的波动。每个片段在其相对平衡位置周围具有三个自由度28。方程2中由Fint(Q, t)表示的内部动力学通过Ornstein-Uhlenbeck过程进行描...

利用中子探测软物质的动力学 
研究蛋白质和多肽的动力学特性是生物物理研究的重要组成部分，目前已有多种成熟的方法可用于探索广泛的能量图景1。将实验揭示的蛋白质动力学与其生物学功能相关联则是一项更为艰巨的任务，需要复杂的数学模型和计算机辅助的动力学模拟。中子谱学在分析蛋白质运动方面的重要性已在多项广受认可的研究中被强调1,2,3,4,5。在深入探讨蛋白质内部动力学所涉及的多样化能量图景之前，有必要简要概述软物质中的动力学过程以及中子如何探测这些过程。
中子对同位素构型的敏感性及其与软物质相互作用的类型，使得中子散射成为最通用的探测技术之一6。中子能够探测的关联长度尺度和关联时间范围非常广泛，从核激发和原子振动，到集体运动以及各向同性旋转和扩散运动等缓慢弛豫过程。在研究散射中子的能量转移时，可以区分出三种主要的相互作用：弹性散射，即入射中子与样品中的粒子之间没有能量交换；非弹性散射，中子与粒子之间发生显著且可量化的能量交换；以及准弹性散射这一特殊情形，其能量转移相对于入射中子能量非常小1,7。这些相互作用为所研究材料提供了精确的信息，并构成了多种中子散射技术的理论基础。
在弹性散射中，探测器记录中子的方向，形成衍射图样，从而显示样品中原子之间的相对位置。由此获得有关原子位置关联的信息（即关于动量转移Q的积分强度S(Q)，仅反映结构信息）。这一原理构成了中子衍射的基础8。
当样品材料中的激发和内部涨落导致能量转移不再为零时，情况变得复杂。这构成了中子谱学的基础，其中散射中子作为能量转移 E 和动量转移 Q 的函数被研究，从而获得动力学和结构信息。中子谱学测量的是相同积分强度 S(Q)，即能量转移（即中子因样品散射引起的速度变化）下的 S(Q,ω) = S(Q, E)，这也被称为动态结构因子9。
在计算材料的散射时，使用对关联函数更为合适7,10。在衍射情况下，静态对关联函数 G(r) 表示在另一个粒子中心距离为 r 处找到某粒子中心的概率。光谱学将静态对关联函数推广，将能量/频率/时间引入散射方程中。此时，对关联函数 G(r) 变为时间的函数 G(r, t)，可分解为明确的原子对关联函数 GD(r, t) 和自关联函数 GS(r, t)。这两者描述了两种类型的关联：由原子对关联运动主导的相干散射，以及由自关联主导的非相干散射10。
相干散射来源于“平均”散射，依赖于散射波之间的相对相位。在小角散射范围内，来自不同散射中心（不同原子）的中子波发生相长干涉（相位相近），从而观测到原子集体运动并表现出强烈的强度增强。相干散射本质上描述的是单个中子与样品中所有原子核的散射作用10。
当来自不同散射中心的中子波之间不发生相长干涉时，可追踪单个原子随时间的变化，观测该原子在时间 t = 0 和时间 t 时位置的自相关性。因此，原子间相对位置的信息丢失，研究重点仅在于局域涨落。局域涨落引起的散射主导了非相干散射。非相干散射是各向同性的，会贡献于背景信号，并降低信噪比10,11。
综合以上内容，我们区分出四种主要的中子散射过程10：（1）弹性相干散射（测量原子位置的相关性）；（2）非弹性相干散射（测量原子的集体运动）；（3）弹性非相干散射（对背景有贡献，通过德拜-沃勒因子（DWF）降低散射强度，并测量弹性非相干结构因子（EISF），用于描述受限几何条件下扩散运动的几何特征）；（4）非弹性非相干散射（测量单个原子的动力学行为和自相关性）。
中子在生物学中可探测的动力学过程包括：低频原子和分子振动的阻尼、溶剂分子与生物表面的相互作用、大分子水合层及受限几何空间中的扩散过程，以及短程的平移、旋转和翻滚扩散运动，还有蛋白质结构域及变构运动1。用于测量蛋白质动力学的中子方法和仪器种类繁多，其差异主要在于入射或出射中子束的消色差方式以及散射中子能量分析的实现方式。从三轴谱仪到飞行时间谱仪、背散射谱仪和自旋回波谱仪，可研究特征时间范围在 1 × 10-14 s 至 1 × 10-6 s（飞秒到微秒）之间的动力学过程12。
橡树岭国家实验室拥有两个著名的中子源——散裂中子源（Spallation Neutron Source, SNS）13 和高通量同位素反应堆（High Isotope Flux Reactor, HFIR）14，配备有全球最先进的生物材料动力学研究谱仪系统。其中一些典型的应用实例包括：利用SNS的冷中子斩波谱仪（CNCS）15 研究溶液中绿色荧光蛋白周围水合水的动力学扰动16，以及多种蛋白质的亚皮秒集体振动17。非弹性中子散射研究中一个常见的问题是，某些生物过程过于缓慢而难以观测。在不采用导致中子强度大幅损失的极端配置的情况下，飞行时间谱仪的能量分辨率通常被限制在10 µeV，对应的最大时间尺度约为200 ps10,11。这一时间尺度不足以观测蛋白质中的大尺度运动。因此，通常需要使用更高能量分辨率的仪器，例如背散射谱仪。结合飞行时间与背散射技术已被证明在研究细胞色素P450cam（CYP101）——一种催化樟脑羟基化的酶——内部动力学变化方面具有强大能力18。
通过SNS-BASIS上的背散射谱仪测得的微观扩散性19表现出出人意料的清晰特征，能够区分为水（包括结合水、胞质水和类体相水）的扩散性以及细胞组分的扩散性，研究对象为涡虫，这是首个通过中子散射技术进行研究的活体动物20。背散射是一种高分辨率光谱技术，但其时间范围仅限于几个µeV（即几纳秒）；而生物材料中的慢速动力学过程还表现为原子位置或自旋取向之间相关性的持续时间（例如弛豫过程，通常发生在十到数百纳秒的时间范围内）。
中子自旋回波谱学（NSE）是唯一能够达到如此高分辨率的中子散射技术。与其他中子技术不同，NSE 不需要对中子束进行消色差处理，因为它利用的是中子的量子力学相位，即中子的磁矩。通过对磁矩的操控，该技术可以使用波长分布较宽的中子束，同时对中子速度的微小变化极为敏感，可探测到约 1 × 10-4 量级的速度变化。NSE 已成功用于研究多种蛋白质在溶液中的慢动力学过程。在众多开创性研究中，我们特别指出：猪免疫球蛋白的片段柔性研究21；Taq DNA 聚合酶中结构域耦合运动的研究22；酵母乙醇脱氢酶四聚体中结构域运动的研究23；磷酸甘油酸激酶在底物结合后构象变化的研究3；Na+/H+ 交换调节因子 1（NHERF1）蛋白中结构域运动的激活及别构信号动态传播的研究4,24,25；汞离子还原酶致密态的动力学研究26；以及血红蛋白在红细胞中扩散行为的研究27。另外两项较近期的蛋白质动力学研究揭示了人源抗体免疫球蛋白 G（IgG）的柔性可被视为一种熵弹簧28，以及溶剂对固有无序蛋白髓鞘碱性蛋白（MBP）动力学贡献的特征5。
本文介绍了中子自旋回声（NSE）的基本原理，推荐了多种用于全面研究蛋白质动力学的样品制备方法，以及在散裂中子源（SNS）的NSE谱仪（SNS-NSE）上进行NSE数据采集的方法学和实验方案。该实验方案表征了两种蛋白质：IgG（一种常见的人体抗体蛋白）和内在无序蛋白MBP。文中简要讨论了这些实例的生物物理意义、研究相关性以及该技术的局限性。
NSE 谱学：用于慢动力学测量的方法 
中子自旋回声（NSE）是一种极化技术，利用中子飞行时间来测量中子与样品中原子发生准弹性相互作用时的能量交换（即极化损失）。NSE 谱学的核心基于两个基本原理：（1）中子自旋在磁场中以与磁场强度成正比的频率进动的能力，即拉莫尔频率 <img alt="磁场矢量，\(\vec{B}\)，方程；示意图；物理学，矢量场分析。" src="/files/ftp_upload/61862/61862eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1">29；（2）自旋回波或汉恩回波，指通过施加一系列射频脉冲对极化信号进行操控和重新聚焦的过程30。
NSE 过程的基本原理可以通过几个简单的步骤进行概括6,11，如图1所示。（1）由中子源产生的中子束（位置1）经过极化（位置2），被引导并传输（位置3），到达 NSE 谱仪入口，并由第一个π/2翻转器将其旋转90°（位置4）。（2）极化的中子束（例如中子磁矩）变为垂直于第一个磁体的磁场方向（第一进动区，位置5），并开始进动。（3）在磁体末端，中子自旋累积了一个与磁场强度以及在磁体内飞行时间成正比的进动角度（基本与中子速度成反比）。各个中子的速度信息被编码在其通过第一进动区结束时的进动角度中。（4）在样品位置附近，π翻转器（位置6）将自旋方向反转180°，从而改变进动角度的符号。（5）中子与样品分子相互作用（位置7）并发生散射。（6）散射后的中子进入第二进动区（位置8）并发生进动，但其自旋方向已被反转。（7）另一个π/2翻转器（位置9）用于将自旋方向从垂直转为水平方向，从而停止进动，并将进动角度φ转化为与cos(φ)成正比的极化度。（8）分析器（位置10）根据某一特定取向选择中子。如果与样品的相互作用是弹性的，则中子速度不会改变。中子在第一和第二进动区飞行的时间相同，累积的进动角度被完全恢复。完整的极化度在探测器上得以重建（位置11），表现为原始极化度的回波（即自旋回波）。（9）然而，在 NSE 中，散射是准弹性的，因此中子与样品分子之间发生微小的能量交换，导致散射后中子速度发生变化。由于速度不同，中子在第二进动区飞行的时间有所增加，无法完全恢复其进动角度。探测器上获得的是部分极化，而由于自旋弛豫导致的极化损失与谱函数S(Q, ω)的余弦傅里叶变换——即中间散射函数F(Q, t)——成正比。（10）函数F(Q, t)的时间参数与进动磁场强度成正比。因此，通过扫描极化损失随磁场强度的变化，可以获得一个依赖于样品内部动力学过程的弛豫函数。
<img alt="粒子加速器示意图，显示用于高能物理实验的同步加速器装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61862/61862fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：SNS处的NSE谱仪（SNS-NSE）照片及中子飞行路径示意图，标示了最重要的功能组件。 从右至左：1 = 中子源；2 = 斩波器-弯转器-偏振器-次级快门系统；3 = 光束传输导管；4 = π/2自旋翻转器，用于第一次90°自旋转向；5 = 第一进动区；6 = π自旋翻转器，用于180°自旋转向；7 = 样品区域及样品环境（此处显示为低温炉）；8 = 第二进动区；9 = π/2自旋翻转器，用于第二次90°自旋转向；10 = 分析器；11 = 探测器。（注意：3的一部分以及2和1位于屏蔽层内蓝色墙后方；对于基于反应堆的NSE，斩波器被速度选择器取代。）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61862/61862fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>牛MBP蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1891</td><td>冻干粉末用...重悬&amp;nbsp; D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O - 重水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>产品编号 151882</td><td>液体</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>自主研发</td><td>-</td><td>用于洗涤/清洁细胞</td></tr><tr><td>DLS 仪器</td><td>Zetasizer Nano ZS，FZ-J&amp;uuml;地衣</td><td>-</td><td>动态光散射仪</td></tr><tr><td>弹性散射标准品</td><td>SNS-NSE，ORNL</td><td>-</td><td>Al&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp; 和石墨粉</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65350-M</td><td>用于清洁细胞的70%乙醇</td></tr><tr><td>IgG 蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4506</td><td>冻干粉末用...重悬&amp;nbsp; D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>KWS-2 仪器</td><td>位于MLZ的JCNS分站，&amp;nbsp; 德国加兴</td><td>-</td><td>小角中子散射仪</td></tr><tr><td>Liquinox 洗洁精</td><td>Alconox</td><td>-</td><td>无磷酸盐液体实验室玻璃器皿清洗剂</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>产品编号 S9390</td><td>七水合磷酸氢二钠盐</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>产品编号 S9888</td><td>氯化钠盐</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>产品编号 S9638</td><td>一水合磷酸二氢钠盐</td></tr><tr><td>Nanodrop 分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>货号：&amp;nbsp;ND-2000</td><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td></tr><tr><td>中子对准相机</td><td>中子光学，格勒诺布尔</td><td>NOG210222</td><td>100 x 100 毫米相机，配备 Sony IMX249 CMOS 传感器</td></tr><tr><td>Parafilm M - 石蜡封口膜</td><td>贝米斯</td><td>Parafilm M - 5259-04LC PM996</td><td>带纸板分配器的通用实验室保鲜膜</td></tr><tr><td>Phoenix-J-NSE 谱仪</td><td>位于MLZ的JCNS分站，&amp;nbsp; 德国加兴</td><td>-</td><td>中子谱仪</td></tr><tr><td>SasView</td><td>https://www.sasview.org/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAXSpace，安东帕仪器</td><td>FZ-J&amp;uuml;地衣</td><td>-</td><td>小角X射线仪器</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88400-88405</td><td>Slide-A-Lyzer 超滤管（3.5 K 截留分子量）</td></tr><tr><td>SNS 远程分析集群</td><td>中子科学远程分析（sns.gov）</td><td>https://analysis.sns.gov</td><td></td></tr><tr><td>SNS-NSE 谱仪</td><td>美国田纳西州橡树岭橡树岭国家实验室</td><td>-</td><td>中子谱仪</td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>VWR</td><td>N.A. 货号：28145-501</td><td>0.2 &amp;micro;m 孔径滤膜</td></tr><tr><td>温度诱导系统（TFS）</td><td>SP Scientific</td><td>部件编号 100004055</td><td>样品环境设备</td></tr><tr><td>尿素-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>产品编号 176087</td><td>氘代尿素盐</td></tr><tr><td>粘度计</td><td>FZ-J&amp;uuml;地衣</td><td>-</td><td>落球粘度计</td></tr></tbody></table>

蛋白质动力学研究 通过 中子自旋回波谱学

Study of Protein Dynamics via Neutron Spin Echo Spectroscopy

大多数人体蛋白质的活性和功能与蛋白质晶体结构中整个亚结构域的构型变化相关。晶体结构是描述蛋白质结构或动力学的任何计算的基础，通常具有较强的几何限制。然而，这些来自晶体结构的限制在溶液中并不存在。由于环区或亚结构域在皮秒到纳秒时间尺度上的重排（即蛋白质内部动力学时间范围），溶液中蛋白质的结构可能与晶体结构不同。本研究描述了如何利用中子散射技术探测数十纳秒时间尺度上的缓慢运动。特别是，通过中子自旋回波谱学（NSE）结合一系列实验室表征方法，对两种主要的人体蛋白质——一种缺乏明确定义的二级结构的内在无序蛋白和一种经典的抗体蛋白——进行了动力学表征。通过数学建模来描述实验中获得的中子数据，并确定扩散运动与蛋白质内部运动之间的转变，从而进一步揭示了蛋白质结构域的动力学特性。从中子自旋回波实验获得的中间散射函数中提取出内部动力学贡献，包括各种运动的时间尺度，有助于进一步理解单个蛋白质的力学性质以及在接近天然环境的拥挤蛋白溶液中蛋白质的柔韧性。

将人血清IgG蛋白和牛MBP蛋白在D2O为基础的缓冲液中重悬至高浓度（约50 mg/mL）。由于蛋白质溶解在高浓度条件下，所得溶液为拥挤的蛋白质溶液。使用中子自旋回波（NSE）研究的蛋白质动力学受到蛋白质所处拥挤环境的影响（结构因子相互作用和流体动力学效应）5,28,39。为校正拥挤效应，对每种蛋白质进行了一系列不同浓度的动态光散射（DLS）测量。通过DLS测得的平移扩散系数随浓度变化进行外推至零浓度，可获得单个蛋白质的平移扩散值。此外，在进行NSE实验前，还必须测定动态黏度随蛋白质浓度的变化，以校正流体动力学相互作用。动态黏度随浓度变化的曲线需外推至零浓度，所得值应与各制备蛋白样品对应缓冲液溶液的实验测得值一致。
在进行任何中子自旋回波（NSE）实验之前，需评估浓溶液中蛋白质的形状和结构，以了解蛋白质的形状因子以及结构因子的强度，这些因素可能影响蛋白质在溶液中的运动方式。小...

本实验方案描述了研究两种在人类健康中具有重要作用的模型蛋白质结构与动力学特性的方法。该技术结合了台式生物物理表征与中子自旋回波谱学，可在与蛋白质结构域间运动相关的时间和长度尺度上探测其动力学行为。

大多数人体蛋白质的活性和功能与其晶体结构中整个亚基区域的构型变化相关。

以下方案介绍了如何设置中子自旋回波实验，以测量中间散射函数并研究溶液中蛋白质的动力学行为。中子自旋回波谱学的主要优势在于其能够探测蛋白质结构域及亚结构域在皮秒至纳秒时间尺度上的重排过程；这一时间范围对应于蛋白质在接近天然环境及高浓度蛋白溶液中所发生的慢速运动。中子自旋回波技术还对同位素构型敏感，因此可通过对比匹配实现高度特异性和靶向性的研究。深入了解蛋白质结构域的动力学是生物物理研究中的重要组成部分，旨在将蛋白质结构域的运动与其生物学功能关联起来，这是当前一项颇具挑战性的任务。本方案可普遍适用于在SNS-NSE谱仪上进行的任何中子自旋回波测量，只要所选样品属于软物质材料范畴，无论具体样品选择如何。实验设置时，应首先根据蛋白质样品的浓度、测量所需温度以及可用溶液量，来确定样品池的装样厚度。使用无磷酸盐的洗洁精、去离子水和70%二乙醇清洁比色皿，然后在鼓风烘箱中干燥。向比色皿中加入四毫升蛋白质溶液，并盖上盖子。使用石蜡膜或任何密封剂密封样品池。在与蛋白质样品相同的容器中加入四毫升透析缓冲液，并进行密封。将样品运送至光束线。关闭快门，进入光谱仪屏蔽室区域。通过拧紧螺丝和固定板，将样品池安装在铝制样品架上。将石墨样品和氧化铝粉末样品（装在与蛋白质样品相同的容器中）一同安装。将相同的样品架轻轻滑入温控系统的腔体中。关闭温控系统的盖子，并通过温控系统的交互式屏幕将温度设定为所需值。安装中子相机，用于将样品与中子束对准。为了采集中子自旋回波谱学数据，使用中子相机和四个独立的样品光阑将样品在中子束中对准。打开散裂中子源中子自旋回波谱学数据采集软件，通过运行所需散射角和波长的衍射扫描来收集样品统计信息。根据每个样品采集到的统计信息，通过编辑辅助仪器科学家提供的测量宏来设置测量参数。在命令提示符下输入协议名称并采集样品的回波信号，开始扫描。使用橡树岭国家实验室（ORNL）的用户凭证登录中子科学远程分析集群，然后按下启动会话按钮。在用户目录中打开终端窗口，输入软件设置命令。接下来，输入环境命令。在主目录中创建一个用于数据处理的文件夹，并从共享目录复制提供的脚本和宏。根据需要编辑、重命名并保存提供的处理宏。在命令提示符中输入 drspine 并按 Enter 键，以启动软件还原环境。在软件环境中的命令提示符内输入还原宏的名称，然后按 Enter 键。使用已还原的文件数据的名称，编辑辅助仪器科学家提供的 Python 脚本。编辑函数以从提供的库中进行拟合。在命令提示符处输入已编辑脚本的名称，然后按 Enter 键以读取、拟合并绘制约化后的中子自旋回声（NSE）数据。IgG 和 MBP 蛋白的中子自旋回声（NSE）测量得到的中间散射函数在较短的四纳秒时间尺度上明显偏离简单的扩散型弛豫过程，表明 NSE 能够探测蛋白质内部动力学，并且需要更复杂的模型来描述所观察到的动力学过程。利用所开发的模型对两种蛋白质进行原子建模，并据此拟合中间散射函数计算结果，其结果与实验测得的中子自旋回声（NSE）数据高度一致。研究结果证明，在较长傅里叶时间下观察到的较慢动力学行为可归因于整体的平移和旋转扩散过程，而在较短时间尺度下观察到的动力学行为则可归因于蛋白质结构域的动力学。需要牢记的一个重要事项是，NSE测量需要制备良好且洁净的样品。一个良好的自旋回波样品应具有高于三的翻转比，即样品相干散射与非相干散射的比值。在样品制备及将样品装入NSE池的过程中，也应确保样品溶液安全，避免任何化学或生物交叉污染。出于安全考虑，只有在快门关闭后，并额外等待半小时以使屏蔽 enclosure 内的辐射充分冷却，方可进入谱仪屏蔽区域。建议使用小角中子散射来评估浓溶液中蛋白质的形状和结构。该方法可在中子自旋回声实验之前或同时进行。其他方法，如动态光散射和黏度测量，可提供有关浓蛋白溶液中平移扩散和流体动力学相互作用的信息，同样建议使用。

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蛋白质动力学研究通过中子自旋回波谱学

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