一种用于从小鼠中分离心肌细胞的顺行灌流方法

我们开发了一种无需使用兰根多夫（Langendorff）装置的简单方法，通过顺行灌流技术分离单个小鼠心肌细胞。该方法适用于从幼年到老年小鼠的心肌细胞分离。基于兰根多夫系统的逆行灌流法长期以来被视为从多种实验动物中分离心肌细胞的金标准。

然而，由于小鼠体型较小，对左胸动脉（LTA）进行插管在技术上较为困难。在小鼠心脏采集时，确认安乐死后，剃除腹部毛发，迅速打开胸腔以暴露心脏，使用剪去尖端、口径大小约与心脏相当的塑料移液管，将心脏吸入管内。提起移液管以腾出足够空间，插入弯头剪刀，从背侧剪下心脏，注意避免损伤心房。

立即将心脏放入含有冰冻 CIB-EGTA 的 30 毫升玻璃烧杯中，持续约一分钟。当心脏收缩停止后，将心脏转移至含有冰冻 CIB-EGTA 的 35 毫升培养皿中，并去除肺组织及其他可见组织。将初步清理后的心脏倒置（心尖朝下）放置于盛有冷藏 CIB-EGTA 的心脏支架上，并将支架置于体视显微镜下。

去除主动脉周围的脂肪和结缔组织。如果截取的主动脉过长，可在头臂动脉下方修剪主动脉，并调整心脏方向，使心室前面朝前。用镊子提起主动脉末端，用小型血管夹在靠近心房处夹闭主动脉，同时轻轻下压心房。

然后将夹住的心脏放置在灌注板上，心室面朝上，并用几滴 CIB-EGTA 液体润湿心脏。进行顺行灌注时，将装有预热 CIB-EGTA 的 20 毫升注射器连接至一根柔性延长管和一根带标记的注射针，安装到输液泵上，并以 0.5 毫升/分钟的流速启动泵。当针头和泵内均已充满液体后，将注射针放置在灌注板上，使斜面对角线较短的一侧朝前，然后轻轻滑动针头，直至其刚好接触心脏的心尖部位。

小心地将针头插入左心室心尖附近的心室腔内，插入过程中不得扭转或使针头脱离载板，同时观察标记以估计针头插入的深度。当针头插入到位后，血液应开始从冠状动脉流出。使用胶带将注射针固定在载板上，并将泵速提高至每分钟1毫升。

如果心脏灌流成功，在心外膜下方应可观察到毛细血管中缓冲液的流动。在灌注 2 至 3 毫升 CIB-EGTA 后，将灌流缓冲液更换为酶混合液。当灌注了 1 至 2 毫升后，将泵速提高至 1.5 毫升每分钟。

根据需要使用移液管清除从心脏流出的含血灌注液，当灌注的酶液总体积达到10毫升时停止灌注。灌注结束时，将注射器中的10毫升酶混合液转移至加热板上的60毫米培养皿中，并向培养皿中加入20毫克BSA。轻轻摇动培养皿以溶解粉末，然后从心脏上移除注射针头和夹子。

去除心脏的心室和心房，并将组织放入含牛血清白蛋白（BSA）的酶混合液中。为分离心室心肌细胞，使用两对镊子夹住心外膜，轻柔地将心室撕成小块。当所有心室碎片制备完成后，用移液器轻柔吹打约30次以分散细胞，并通过100微米孔径的细胞滤网将未消化的残渣过滤至15毫升离心管中。

离心后，将心肌细胞沉淀重悬于预热的、添加了钙和牛血清白蛋白（BSA）的CIB溶液中，在37摄氏度孵育5分钟。孵育结束后，再次离心细胞，并将沉淀的心肌细胞重悬于适量的细胞重悬液中，于37摄氏度维持培养，直至进行后续分析。为分离心房肌细胞，将心房组织转移至含有预热的、添加钙和BSA的CIB溶液的容器中，并按示范方法将心房撕成小块。

使用设置为10微升的20微升移液器通过吹打破坏组织，并通过离心收集解离的细胞。然后将心房细胞重悬于适当体积的细胞重悬液中。在此图像中，可观察到新分离的心室肌细胞。

该分离方法可在大约五小时内，从8至10周龄小鼠中获得70%至80%产率的杆状静息状态心室肌细胞。在年龄超过两岁的小鼠中，新分离的活细胞比例较低。在心室肌细胞和心房肌细胞中记录的动作电位与通过Langendorff法获得的细胞中测得的动作电位相似。

免疫染色分析可用于评估心室肌细胞肌节结构的排列情况，以及心外膜成纤维细胞在传代培养后向肌成纤维细胞的转化。建议采用蛋白质印迹分析（Western blot）来检测处理后心房和心室中目标蛋白的特异性表达。经酶灌流后，可使用裂解缓冲液以较轻的机械力轻松匀浆心房和心室组织，以提取蛋白质。

控制针头插入的方向和深度非常重要。将针头插入左心室时，需注意不要刺穿室间隔或穿透瓣膜。可根据实验目的调整灌注液的成分。

例如，可使用添加了 EGTA 的去垢剂来制备心脏的无细胞支架。