Name: 使用刺激拉曼散射显微镜对 卡诺哈布迪炎电子人 中的脂质存储动力学进行无标签成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 了解受激拉曼散射显微镜技术，用于在活体秀丽隐杆线虫中进行无标记脂质成像。该方法可实时追踪脂质储存动态，为研究脂质代谢与基因调控提供高效工具。

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本研究由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）R01AG045183（M.C.W.）、R01AT009050（M.C.W.）、R01AG062257（M.C.W.）、DP1DK113644（M.C.W.）、March of Dimes基金会（M.C.W.）、Welch基金会（M.C.W.）以及霍华德·休斯医学研究所（HHMI）研究员项目（M.C.W.）。我们感谢线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供秀丽隐杆线虫（C. elegans）菌株。

1. 受激拉曼散射显微镜的仪器设置
注意：受激拉曼散射（SRS）显微系统基于一台皮秒激光器，该激光器集成了光参量振荡器（OPO）泵浦源和共聚焦激光扫描显微镜。振荡器提供两束皮秒脉冲序列，包括波长为1,064 nm的斯托克斯光束和波长可在700–990 nm范围内调谐的泵浦光束。两束光在激光器内部实现时间和空间上的重叠。系统内置的电光调制器（EOM）专为SRS显微设计。本方案将重点介绍激光器与显微镜的耦合，以及该系统的日常操作（图1）。在过去十年中，SRS显微系统的配置不断发展。需注意的是，以下描述仅代表多种配置中的一种。
<ol>
	<li>将激光束导入显微镜
	<ol>
		<li>设置潜望镜，将皮秒光源出口的光束提升至显微镜扫描器的红外激光输入端口。 
		警告：操作前请仔细阅读激光系统手册，并采取所有必要的防护措施，因为该四类激光系统产生的近红外辐射可能对眼睛和皮肤造成严重伤害。完成机构环境安全部门要求的培训。佩戴防护眼镜，并穿着袖口收紧的实验服。</li>
		<li>首先将泵浦光束设定在 750 nm，并将激光功率降低至 50 mW，以便在进行光路准直时进行目视检查。然后使用扩束镜（图1，L1 和 L2）调节光束直径，使其匹配显微镜物镜的后孔径。使用两个中继反射镜（图1，M1 和 M2）将激光束引导至潜望镜（图1，P1 和 P2）。潜望镜将光束提升至扫描器开口的高度，同时作为准直用的转向镜。</li>
		<li>将潜望镜上的调节旋钮置于调谐范围的中心位置，并初步设定每面反射镜的位置和角度，使激光束大致照射在反射镜中心。</li>
		<li>使用物镜转盘上的空置端口进行粗略准直，并放置功率计探头以测量透射光的功率。将显微镜扫描器设为最高放大倍数（50×），然后测量聚焦激光光斑下透射光的功率。反复优化 M1 和 M2 每个反射镜上的旋钮，以获得最高的透射激光功率。</li>
		<li>使用准直工具进行精细准直。将荧光靶准直帽安装在空置的物镜插槽上，调节 M1 的旋钮使光斑居中。然后接入靶标的延长管，调节 M2 的旋钮使光斑居中。</li>
		<li>重复步骤 1.1.4 和 1.1.5，直至光束在两个位置均能准确对准靶标中心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接检测与电子系统
	<ol>
		<li>搭建受激拉曼散射（SRS）检测模块。在聚光镜后放置一个立方体分束器，将透射激光引导至光电二极管模块。该模块包含一个望远镜系统，用于中继并调节光束尺寸以匹配光电二极管的有效感光区域，同时配备光学滤光片以滤除调制的斯托克斯光束，仅允许泵浦光束通过以进行解调。</li>
		<li>连接电子系统（图1）。斯托克斯光束的强度由皮秒可调谐激光器内部的电光调制器（EOM）在 20&#160;MHz 下进行调制。将激光器输出的调制频率作为参考信号输入锁相放大器，用于解调。将光电二极管的输出信号输入锁相放大器，以解调 SRL 信号。 
		注：一体式激光系统可升级，因此其规格可能因生产日期不同而有所差异。本方案中使用的早期皮秒可调谐激光系统的斯托克斯光束波长为 1,064 nm，而近期版本的斯托克斯光束波长为 1,031&#160;nm。本方案中使用的 EOM 调制频率定制为 8 MHz，而近期系统的默认调制频率可能为&#160;10 或 20 MHz。</li>
		<li>最后，将锁相放大器的输出信号接入显微镜的模拟信号盒，将电信号由模拟信号转换为数字信号。系统即可准备处理 SRS 信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化成像条件
	<ol>
		<li>制备用于系统准直的化学样品。例如，使用十二烷优化显微镜，因为十二烷的 C-H 键具有很强的 SRS 信号。使用密封盖片构建微型样品室，加入 5 μL 十二烷，并用盖玻片覆盖。 
		注：当十二烷样品出现浑浊或有杂质时，应更换为新样品；新样品可用于准直约 2–3 个月。</li>
		<li>将样品置于显微镜载物台上，正确聚焦液滴。可通过寻找十二烷液滴边缘加快对焦过程。调节聚光镜以实现科勒照明。</li>
		<li>设置成像参数。检查延迟线阶段是否处于正确数值。将泵浦光束波长设为 795.8&#160;nm。使用红外传感卡和红外观察仪，检查泵浦光束的光路是否仍正确。</li>
		<li>在皮秒系统控制面板上，将泵浦光束功率设为 200 mW，斯托克斯光束功率设为 400 mW。 
		注：在此系统配置下，从激光出口到物镜后方的两束光透过率分别约为泵浦光 25%，斯托克斯光 14%。因此，物镜后方的泵浦光功率约为 50 mW，斯托克斯光功率约为 56 mW。近期皮秒激光系统的脉宽已从 6 ps 变为 2 ps，因此所施加的激光功率应进一步降低。</li>
		<li>将锁相放大器增益设为最大值。打开两束光的快门，以及激光主快门。</li>
		<li>扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。在成像软件中将显示模式改为Hi-Lo，调节显示范围以实现约 50% 的饱和度。检查饱和区域是否位于图像中心。若非如此，应仔细调节转向镜 M1 和 M2，以最大化图像强度并将峰值强度居中。</li>
		<li>微调延迟线阶段，从十二烷样品中找到最大的 SRS 信号强度。此时系统即可投入使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. SRS 显微成像用 C. elegans 样品的制备
注意：作为模式生物， 秀丽隐杆线虫 已被证实对多种成像技术具有重要价值。它们全身透明，因此可在不进行解剖的情况下对完整动物体内的各种组织进行成像。在 秀丽隐杆线虫， 中性脂质储存在肠道中的脂滴内，肠道由20个围绕肠腔呈双侧对称排列的上皮细胞组成16皮下细胞和卵母细胞也储存脂质。储存脂质的主要形式是 秀丽隐杆线虫 脂滴是三酰甘油（TAGs）17，由于富含CH而产生强烈的SRS信号2 脂肪酸链中存在的化学键。本节将重点介绍如何制备 秀丽隐杆线虫 用于SRS显微成像及其总肠道脂质储存水平定量的样品。
<ol>
	<li>成像载玻片的制备
	<ol>
		<li>首先，在蒸馏水（H2O）中配制2%琼脂糖溶液，并确保在制备琼脂糖垫前所有琼脂糖完全溶解。</li>
		<li>将一滴温热的2%琼脂糖溶液（约100 μL）加到置于两层实验室胶带之间的空白载玻片上，迅速将另一张载玻片盖在第一张之上。轻轻按压，形成一层薄而均匀的琼脂糖垫。</li>
		<li>将这些载玻片合起来放置，待线虫准备上样前不要分开。每次成像前均需制备新鲜载玻片，因为琼脂糖垫在一天后会变干。 
		注意：若在高通量遗传筛选中需对多个线虫进行成像，可使用多孔成像培养皿18。使用活体成像系统可对发育和衰老过程中脂质代谢的时空动态进行成像19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫的装载
	<ol>
		<li>通过在M9缓冲液中加入叠氮化钠或左旋咪唑，分别配制终浓度为100 mM或1 mM的麻醉剂。 
		注意：若在遗传筛选后需对线虫进行基因分型并回收使用，请选用左旋咪唑。 
		警告：多种麻醉剂（包括叠氮化钠和左旋咪唑）若被吸入可能有害。配制工作液时应佩戴防护手套和防护服，并在通风橱中操作。</li>
		<li>将一滴麻醉剂滴加至盖玻片上（10–20条线虫约需4–5 μL）。 
		注意：根据线虫数量调整麻醉剂用量，以使线虫尽可能彼此靠近。若线虫数量较少却使用过多液体，可能导致线虫在琼脂糖垫上分散。</li>
		<li>在解剖显微镜下挑选待成像的线虫，并将其转移至麻醉剂液滴中。待所有线虫加入液滴后，使用线虫挑取工具轻轻搅动，确保线虫之间不发生重叠。</li>
		<li>将步骤2.1中制备的载玻片分开，注意不要扰动琼脂糖垫。</li>
		<li>用带有琼脂糖垫的载玻片覆盖含有线虫的液滴，确保琼脂糖垫朝向线虫。或者，也可将麻醉剂液滴加至琼脂糖垫上，再用盖玻片覆盖线虫。</li>
		<li>最后，使用永久性记号笔在载玻片上标记线虫的位置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 图像采集与分析
<ol>
	<li>使用SRS显微镜系统获取图像。
	<ol>
		<li>在对任何样品成像之前，确定成像参数并验证SRS信号（如协议&#160;1中所述）。</li>
		<li>将载玻片盖玻片朝向物镜放置。打开明场光源，并将其引导至目镜以定位线虫。 
		注意：使用20倍物镜对整个肠道中的脂质储存进行成像。若需对表皮脂肪储存进行成像或量化脂滴大小/数量，可考虑使用60倍物镜。</li>
		<li>调节焦距使线虫清晰成像，并相应调整聚光镜位置。</li>
		<li>关闭明场光源，切换至激光扫描单元。以较快的扫描速度（例如512 × 512像素）开始扫描第一个线虫，并微调焦距以找到感兴趣区域。对于首次成像的样品，调节激光功率至SRS信号未饱和的水平。</li>
		<li>切换至较慢的扫描速度（例如2 μs/像素）和更高分辨率（例如1024 × 1024像素）以获取SRS图像。 
		注意：在整个成像过程中，对所有待成像样品保持激光功率恒定。</li>
		<li>以支持高分辨率的格式（如.tiff文件）保存SRS图像。根据所使用的成像软件和设置，在移动到下一个样品前保存第一个线虫的位置。</li>
		<li>完成载玻片上所有线虫的成像。关闭快门以阻断激光束。在所有样品成像完成前，请勿关闭激光源。</li>
		<li>在放置下一个样品载玻片前取下载玻片。重复步骤3.1.2–3.1.7。</li>
		<li>所有样品成像完成后，将激光源置于待机状态，并关闭相关设备，包括放大器、探测器、显微镜和计算机。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用ImageJ分析图像
	<ol>
		<li>选择图像文件（通常为.tiff格式）并将其拖放到ImageJ窗口中，以在ImageJ中打开待量化的图像文件。如果使用特定的Olympus显微镜格式（如.oib文件），请下载相应的ImageJ插件。</li>
		<li>选择要分析的参数（分析 &#62; 设置测量值）。对于总脂质储存的定量，选择面积、最小和最大灰度值以及平均灰度值。</li>
		<li>使用多边形选择工具勾画出需要量化的线虫肠道区域。点击分析 &#62; 测量以测量步骤3.2.2中选定的参数。将弹出一个显示测量结果的新窗口。对所有打开的图像重复此步骤。</li>
		<li>选择同一基因型下所有线虫的测量数据，并将其复制粘贴到新的电子表格中。在同一成像会话中，对所有基因型重复步骤3.2.1–3.2.4。</li>
		<li>选择线虫附近无SRS信号的区域作为背景进行量化。确保所选背景区域不含任何可能产生SRS信号的细菌或碎屑。</li>
		<li>从每条线虫的测量值中减去背景平均灰度值。计算同一基因型/测试组中所有线虫背景校正后平均灰度值的平均值和标准差，并将该值归一化至对照组的平均值。</li>
		<li>最后，使用平均灰度值作为每条线虫脂质水平的衡量指标，进行适当的统计分析。通常，对于两组数据使用Student’s t-检验，对于两组以上数据则使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合适当的多重比较检验。 
		注意：在选择用于图示展示的图像时，确保所选图像具有相同的像素强度分布。将同一图中所有图像的亮度和对比度设置为相同值（图像 &#62; 调整 &#62; 亮度和对比度）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

为抵御肥胖及其相关代谢紊乱，科研界已投入大量努力，以深入理解脂质稳态的调控机制。在生物样本中对脂质分子进行定量检测时，无需标记的受激拉曼散射（SRS）显微成像技术已被证实是生化检测及其他染色方法的一种可靠替代方案。本课题组及其他研究团队通过结合使用 秀丽隐杆线虫 和SRS显微镜12,18,28,29,30,31在本实验方案中，我们利用受激拉曼散射显微技术（SRS显微技术）证明，在线虫中下调胰岛素信号通路会导致肠道总脂质水平升高。我们观察到，从成虫期第1天开始，脂质在线虫肠道中逐渐积累 daf-2 突变体，其胰岛素受体基因存在功能丧失型突变，而在野生型线虫中肠道脂质水平下降。此外，该结果与先前研究一致<sup c...

肥胖已成为威胁全球约三分之一人口的全球性健康问题，由于其与心理健康不良1以及糖尿病2、心血管疾病3和某些癌症4等致命疾病密切相关，已成为严重的医学问题。研究脂质代谢对于深入理解肥胖背后的生物学机制至关重要。快速且特异性地定量脂质储存需要高灵敏度地检测脂肪酸及其衍生物，以及含固醇的代谢物，并最好具备空间信息。由于脂质缺乏内在荧光特性，且难以通过荧光标记进行标记，因此成像难度较大。荧光标记物的分子尺寸通常大于脂质分子本身，因而可能具有化学侵入性，且不适用于活体应用。因此，必须采用无标记或最小标记的策略，以保持脂质分子的疏水结构5。近年来成像技术的发展为在活细胞、组织和生物体中实现脂质的无标记成像提供了令人振奋的新机遇。
生物样本中脂质储存分析的传统方法包括生化检测和使用亲脂性染料的染色方案。涉及质谱（MS）的生化定量检测在分子分辨能力方面无与伦比，但需要大量的样本量，且样本制备通常耗时数小时，限制了其在活体系统实时成像中的应用5。这些检测方法的另一个主要局限性是缺乏空间信息。另一方面，亲脂性染料（如油红O和苏丹黑）可提供脂质储存细胞器的组织和细胞分布信息，且与MS技术相比，这些染色方法成本较低且操作简便。然而，这些染色方案需要固定步骤，可能影响脂滴的疏水特性，导致其结构发生人为改变，并引起实验间的不一致性6。由于生化和染色技术相关的技术难题，研究人员开始寻求无需标记的脂质分子成像方法，从而推动了相干拉曼散射（CRS）显微镜在脂质成像中的迅速普及。
拉曼效应最初由拉曼（Raman）和克里希南（Krishnan）发现，他们报道了当分子与光子相互作用时，可产生波长不变的散射光（称为瑞利散射），或极少数情况下产生波长改变的散射光（称为拉曼散射），而这种波长的变化特征性地反映了分子内部的功能基团7。当分子内的化学键被入射光子（称为泵浦光子）激发至更高的振动能级时，散射光子（称为斯托克斯光子）的能量会降低；反之，若化学键原本处于较高能级，则可能跃迁至较低振动能级，使散射光子获得能量而成为反斯托克斯光子。入射光子与散射光子之间的频率差称为拉曼位移。分子中的每种化学键都具有特定且可量化的拉曼位移。例如，CH2 键的拉曼位移为 2,845 cm-1，在脂肪酸链中广泛存在8。这种自发拉曼信号通常非常微弱，严重限制了传统自发拉曼显微镜的成像速度。多年来，研究人员已开发出多种方法以提高自发拉曼显微镜的成像速度和灵敏度。相干拉曼散射显微技术，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术和受激拉曼散射（SRS）显微技术，是近年来的重要进展。CARS 与 SRS 的工作原理略有不同，但二者均为无需标记的成像技术，具备活体成像能力，可提供脂质储存动态的空间和时间信息，且仅需少量样品。CARS 显微技术存在非共振背景信号的问题，该背景来源于多种非线性过程，同时 CARS 信号与分子浓度之间呈非线性关系，这两者共同增加了定量分析的复杂性9。与 CARS 显微技术不同，SRS 显微技术不产生非共振背景信号，并且其信号强度与目标分子浓度呈线性关系。因此，目前 SRS 显微技术在脂质成像中应用更为广泛。
在受激拉曼散射（SRS）显微技术中，当使用两束同步的激光激发，且其频率差与化学键的振动频率相匹配时，微弱的自发拉曼信号可以被放大。由于相干激发，分子将经历向激发态的增强跃迁，从而提高斯托克斯光子的生成速率。结果，“斯托克斯”光束的透射强度增加（受激拉曼增益，SRG），而“泵浦”光束的透射强度降低（受激拉曼损耗，SRL）。对SRG或SRL信号的检测构成了SRS显微成像的基础，可用于对具有特定化学键的分子进行成像10。如果两束激光之间的频率差不匹配目标分子中化学键的振动频率，则不会产生SRG或SRL信号。SRS显微技术的成像速度约为每像素2 μsec，或每帧1秒，远快于自发拉曼显微技术11。SRS显微技术的典型横向分辨率受限于衍射极限，约为300 nm。此外，SRS显微技术的双光子光学过程可实现对相对较厚组织样本的三维体成像，成像深度可达300–500 μm。总体而言，SRS显微技术是一种高效、无需标记的成像方法，适用于检测特定生物分子，尤其是脂质。
脂滴是单层膜细胞器，是细胞内中性脂质的主要储存场所，包括三酰甘油（TAGs）和胆固醇酯（CEs）。这些脂质分子脂肪酸链中的CH2键在激发时可在2,845 cm-1处产生强烈的受激拉曼散射（SRS）信号8，从而实现对完整细胞、组织切片甚至整个生物体中储存脂质水平的检测与定量12,13,14,15。特别是，秀丽隐杆线虫（C. elegans）因其通体透明，适用于脂质成像研究。与哺乳动物类似，C. elegans也通过脂滴储存脂质，且其脂质分子的合成与降解通路高度保守16。在本实验方案中，我们将介绍SRS显微镜的工作原理、基本装置，并详细描述其在C. elegans脂质成像中的应用方法。

<table><tbody><tr><td>A/D转换器</td><td>Olympus</td><td>Analog Unit</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>GeneMate</td><td>3119</td><td>用于制备琼脂糖垫</td></tr><tr><td>校准工具 - 转接器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A4</td><td>用于将工具安装到显微镜上</td></tr><tr><td>校准工具 - 目标板</td><td>Thorlabs</td><td>VRC2SM1</td><td>用于观察红外激光</td></tr><tr><td>校准工具 - 套管</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L40</td><td>长度可变</td></tr><tr><td>自相关仪（可选）</td><td>APE</td><td>pulseCheck</td><td></td></tr><tr><td>带通滤光片</td><td>minicircuits</td><td>BBP-21.4+（若调制频率为20 MHz）或KR Electronics 2724（若调制频率为8 MHz）</td><td>用于调制信号的频率滤波</td></tr><tr><td>BNC电缆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>用于操作和挑选成像用线虫</td></tr><tr><td>十二烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44010</td><td>用于SRS信号的校准</td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Chroma Technology</td><td>890/220 CARS</td><td>用于去除斯托克斯光束</td></tr><tr><td>通用实验室标签胶带</td><td>VWR</td><td>89097</td><td>用于制备琼脂糖垫</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td>用于覆盖线虫以进行成像</td></tr><tr><td>玻璃载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td>用于制备琼脂糖垫</td></tr><tr><td>激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>透镜</td><td>Thorlabs</td><td>L1: AC254-050-B&lt;br/&gt; L2: AC254-075-B</td><td>用于扩束器</td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>Zurich</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>低通滤波器</td><td>minicircuits</td><td>BLP-1.9+</td><td>用于抑制电源噪声</td></tr><tr><td>反射镜</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>用于光路中继和潜望镜系统</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Olympus</td><td>UPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20</td><td></td></tr><tr><td>光电二极管</td><td>Thorlabs</td><td>FDS1010</td><td></td></tr><tr><td>皮秒激光光源</td><td>APE</td><td>picoEmerald</td><td></td></tr><tr><td>电源</td><td>TEKPOWER</td><td>TP1342U</td><td>为光电二极管供电，反向50 V电压</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>用于麻醉线虫</td></tr><tr><td>线虫挑取工具</td><td>WormStuff</td><td>59-AWP</td><td></td></tr></tbody></table>

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（caenorhabditis elegans）的研究

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

脂质代谢是维持细胞和有机体健康的基本生理过程。脂质代谢失调常导致肥胖以及多种相关疾病，包括心血管疾病、2型糖尿病和癌症。为了深入理解脂质代谢的调控机制，能够在时间和空间上精确定量活体中脂质储存水平的方法变得日益重要和实用。传统的脂质储存分析方法在显微观察中为半定量性质，而在生化检测中则缺乏时空信息。受激拉曼散射（SRS）显微技术是一种无需标记的化学成像技术，可在亚细胞分辨率下快速、定量地检测活细胞中的脂质。由于其成像对比度来源于分子固有的振动信号，SRS显微技术还可实现活体动物中脂质的四维动态追踪。在过去十年中，SRS显微技术已广泛应用于生物医学研究中的小分子成像，克服了传统荧光染色和脂质提取方法的主要局限性。在本实验室中，我们将SRS显微技术与模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）所拥有的遗传学和生物化学工具相结合，研究不同细胞和组织中脂滴的分布与异质性，最终发现调控脂质代谢的新型保守信号通路。本文介绍了SRS显微镜的工作原理和详细配置，并提供了在野生型和胰岛素信号缺陷突变型秀丽隐杆线虫（C. elegans）不同发育阶段定量脂质储存水平的实验方法。

胰岛素信号通路是一条重要的内分泌通路，影响发育、繁殖、寿命和代谢。在蠕虫中，胰岛素信号通路包括约40种胰岛素样肽配体、胰岛素样生长因子受体同源物DAF-2、下游PI3K/AKT激酶级联反应，以及FoxO转录因子同源物DAF-1620。daf-2突变体缺乏胰岛素受体，其肠道（即蠕虫的脂质储存组织）中含有更多的脂滴21,22。利用SRS显微镜，我们定量分析了年龄同步化的野生型蠕虫和daf-2突变体在成虫期的肠道脂质水平。与先前的研究结果一致，我们发现daf-2突变体的脂质水平更高23,24（图2A）。我们观察到野生型蠕虫从成虫第1天到第9天脂质水平逐渐下降（图2A）。然而，daf-2...

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）脂质储存成像中的应用方法。

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

脂质代谢是维持细胞和机体健康所必需的基本生理过程。脂质代谢失调通常会引发……

受激拉曼散射显微技术是一种化学成像技术，能够快速、定量地检测脂质，并可在无需标记的情况下对活体动物中的脂质进行追踪。与传统脂质检测技术相比，受激拉曼散射显微技术最重要的优势在于其无需标记，因此不像其他荧光和染色方法那样容易发生光漂白。将受激拉曼散射显微技术与模式生物（尤其是秀丽隐杆线虫）中可用的遗传学和生物化学工具相结合，为研究脂质生物学和代谢的正常调控机制提供了一个强大的研究框架。为了将激光束导入SRS显微镜，首先设置潜望镜，将皮秒光源出口的光束提升至显微镜扫描器的红外激光输入端口，并打开激光控制软件以启动激光器。将泵浦激光功率降低至50毫瓦，并将泵浦光波长设为750纳米。使用扩束镜调节光束直径，使其匹配显微镜物镜的后孔径。使用两个中继镜 M1 和 M2 将激光束引导至潜望镜，并将潜望镜的俯仰角设置在调谐范围的中心位置。选择每面镜子的初始位置和角度，使激光束大致照射到镜面中心，从而将光束导入显微镜；利用显微镜物镜转换器上的一个空置端口进行粗调对准。将功率计探头置于物镜端口处，测量透射光的功率，并将显微镜扫描器设置为最高放大倍数 50X。使用聚焦的激光光斑测量透射光的功率，并反复调节反射镜 M1 和 M2 的旋钮，以获得最高的透射激光功率。使用准直工具对透射光进行精细准直，确保光线穿过物镜中心，并将荧光目标准直帽安装在空的物镜插槽上。调节第一个转向反射镜 M1 的旋钮，使激光光斑居中，并将另一端带有准直帽的延长管插入另一个空的物镜插槽，用于监测激光光斑位置。然后，调节第二转向镜 M2 的旋钮，使激光光斑再次位于延伸管另一端的中心。为设置 SRS 检测模块，在聚光镜后放置一个分束立方体，将透射的激光引导至光电二极管模块。为建立电子连接，使用皮秒可调激光器内部集成的电光调制器（20 兆赫兹）对斯托克斯光束的强度进行调制，并将光电二极管的输出信号输入锁相放大器，以解调受激拉曼散射损失信号。然后，将锁相放大器的输出信号输入显微镜的模拟信号盒，以将电信号从模拟信号转换为数字信号。为优化成像条件，向微型显微镜载玻片腔室中加入五微升油酸，并用盖玻片覆盖样品。将样品放置于显微镜载物台上，利用垫片边缘定位并聚焦液滴。调节聚光镜以实现科勒照明，并使用红外传感器卡和红外观察仪检查泵浦光束路径是否仍然正确。确认延迟阶段已设置为零飞秒，并将泵浦光束波长设置为795.8纳米。将泵浦光束功率设为50毫瓦，斯托克斯光束功率设为100毫瓦。打开两束光的快门以及激光的主快门。扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。将显示模式更改为高低模式，并调整范围以获得约50%的饱和度。检查饱和信号是否位于图像中央，必要时仔细调节皮秒可调激光系统内部的转向镜，以优化泵浦光与斯托克斯光的重叠，从而最大化图像强度并将峰值强度居中。每次成像前，在由两层实验室胶带支撑的洁净载玻片上加入100微升温热的2%琼脂糖，迅速将另一张载玻片盖在上方，轻轻按压以形成一层薄而均匀的琼脂糖垫，并让琼脂糖冷却凝固。为进行成像，将每10至20条线虫使用4到5微升麻醉剂滴加在盖玻片上，利用解剖显微镜挑选待成像的线虫，并在收集过程中将其放置于麻醉剂液滴中。当所有线虫收集完毕后，用带有琼脂糖垫的载玻片覆盖线虫。成像时，将样本以盖玻片朝向物镜的方向安装，并调节明场光源至目镜，以便定位线虫。将蠕虫调至焦点，并相应调整聚光镜位置。通过将泵浦激光功率设为 200 毫瓦、红外激光功率设为 400 毫瓦来调节激光功率。设置锁相放大器以对蠕虫的受激拉曼散射（SRS）信号进行解调。以较快的扫描速度开始扫描第一条线虫，调节微调焦旋钮以找到目标区域。当信号优化后，切换至较慢的扫描速度和更高的像素分辨率，以获取受激拉曼散射（SRS）图像，并以支持高分辨率的格式保存图像。所有样品成像完成后，将激光光源置于待机状态，并关闭所有相关设备。为了分析图像，在 ImageJ 中打开文件，选择“分析”并设置测量选项以选定待分析的属性。使用多边形选择工具勾勒出需要定量的线虫肠道区域，然后再次点击“分析”并选择“测量”。测量结果将显示在结果窗口中。当所有线虫的轮廓绘制完成后，将给定基因型中每条线虫的测量值复制并粘贴到电子表格中。对于背景测量值，选择线虫附近无SRS信号的区域，将每个个体线虫的测量值减去背景的平均灰度值，从而计算出该基因型或测试组中所有线虫背景校正后平均灰度值的平均值和标准差。随后，可将这些值归一化至对照组的平均值。在此代表性分析中，对年龄同步的野生型线虫和缺乏胰岛素受体的 daf-2 突变体在成年期间的肠道脂质水平进行了定量。正如预期，野生型线虫的脂质水平从成年第一天开始下降，并持续至第九天。然而，daf-2 突变体的脂质水平则持续上升，直到其成年第五天，此后保持稳定，约为野生型的 2.5 至 3 倍。daF-16 失活可抑制 daf-2 突变体脂质水平的升高。在 daf-2、daf-16 双突变体中表达 daf-16a 或 daf-16b 亚型不能恢复其脂质水平。然而，表达 daf-16d/f/h 亚型则足以使 daf-2、daf-16 双突变体的脂质水平恢复至 daf-2 单突变体所观察到的水平。这些结果表明，daf-16d/f/h 亚型特异性调控 daf-2 突变线虫中的脂质代谢。在整个成像过程中，必须对泵浦光束和斯托克斯光束使用相同的激光功率，并且每次进行六次和四次重复定量时均需包含对照组。除了定量脂质储存外，受激拉曼散射（SRS）显微技术还可与生物正交标记（如氘标记）联用，用于可视化脂质的掺入、合成和降解动态过程。SRS显微技术具有多重成像能力，可用于对不同亚细胞区域中的多种生物分子进行成像。这种所谓的高光谱SRS显微技术在探索代谢动态方面具有广阔的应用前景。

label-free-imaging-lipid-storage-dynamics-caenorhabditis-elegans

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用刺激拉曼散射显微镜对 卡诺哈布迪炎电子人 中的脂质存储动力学进行无标签成像

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。...

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

我们介绍了用于研究Caenorhabditis elegans脂质储存的可靠生化与显微方法。一种快速、简便的固定-染色法可利用亲脂性染料尼罗红（Nile...

秀丽隐杆线虫中脂肪含量的生化与高通量显微评估

脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

本文描述了一种通过将受激拉曼散射（SRS）实验装置与激光扫描显微镜集成而实现的受激拉曼散射显微镜。该SRS显微镜基于两束飞秒（fs）激光光源，分别为钛宝石（Ti:Sa）激光器和同步的光学参量振荡器（OPO）。...

基于受激拉曼散射的非线性显微镜的实现

本研究中，我们描述了一种使用脂肪酸盐油酸钠在分化型HepaRG细胞中诱导肝泡性脂肪变性的详细方案，并介绍了脂质积聚的检测与定量方法，包括相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像、细胞荧光分析、油红O染色以及定量PCR。...

在分化型HepaRG细胞中诱导并表征囊泡性脂肪变性

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

可视化髓鞘化是许多研究神经系统研究人员的重要目标。CARS...

相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

我们报道了一种用于直立式受激拉曼散射显微镜透射信号检测的台面式灵活环境培养室，可用于活细胞的延时成像。利用该系统，以3分钟的时间间隔，对经油酸处理长达24小时的SKOV3细胞中的脂滴进行了成像。...

用于受激拉曼散射显微镜时间序列活细胞成像的柔性腔室

本文提供了有效使用SegElegans的详细说明。SegElegans是我们开发的一种深度学习系统，可用于对宽场显微镜图像中的单个线虫进行自动分割，进而用于ImageJ等图像分析软件。我们提供了该系统的在线和离线使用方法。...

自动化分析 秀丽隐杆线虫 使用 SegElegans 进行荧光成像

了解受激拉曼散射显微镜技术，用于在活体秀丽隐杆线虫中进行无标记脂质成像。该方法可实时追踪脂质储存动态，为研究脂质代谢与基因调控提供高效工具。

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

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