无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

受激拉曼散射显微技术是一种化学成像技术，能够快速、定量地检测脂质，并可在无需标记的情况下对活体动物中的脂质进行追踪。与传统脂质检测技术相比，受激拉曼散射显微技术最重要的优势在于其无需标记，因此不像其他荧光和染色方法那样容易发生光漂白。将受激拉曼散射显微技术与模式生物（尤其是秀丽隐杆线虫）中可用的遗传学和生物化学工具相结合，为研究脂质生物学和代谢的正常调控机制提供了一个强大的研究框架。

为了将激光束导入SRS显微镜，首先设置潜望镜，将皮秒光源出口的光束提升至显微镜扫描器的红外激光输入端口，并打开激光控制软件以启动激光器。将泵浦激光功率降低至50毫瓦，并将泵浦光波长设为750纳米。使用扩束镜调节光束直径，使其匹配显微镜物镜的后孔径。

使用两个中继镜 M1 和 M2 将激光束引导至潜望镜，并将潜望镜的俯仰角设置在调谐范围的中心位置。选择每面镜子的初始位置和角度，使激光束大致照射到镜面中心，从而将光束导入显微镜；利用显微镜物镜转换器上的一个空置端口进行粗调对准。将功率计探头置于物镜端口处，测量透射光的功率，并将显微镜扫描器设置为最高放大倍数 50X。

使用聚焦的激光光斑测量透射光的功率，并反复调节反射镜 M1 和 M2 的旋钮，以获得最高的透射激光功率。使用准直工具对透射光进行精细准直，确保光线穿过物镜中心，并将荧光目标准直帽安装在空的物镜插槽上。调节第一个转向反射镜 M1 的旋钮，使激光光斑居中，并将另一端带有准直帽的延长管插入另一个空的物镜插槽，用于监测激光光斑位置。

然后，调节第二转向镜 M2 的旋钮，使激光光斑再次位于延伸管另一端的中心。为设置 SRS 检测模块，在聚光镜后放置一个分束立方体，将透射的激光引导至光电二极管模块。为建立电子连接，使用皮秒可调激光器内部集成的电光调制器（20 兆赫兹）对斯托克斯光束的强度进行调制，并将光电二极管的输出信号输入锁相放大器，以解调受激拉曼散射损失信号。

然后，将锁相放大器的输出信号输入显微镜的模拟信号盒，以将电信号从模拟信号转换为数字信号。为优化成像条件，向微型显微镜载玻片腔室中加入五微升油酸，并用盖玻片覆盖样品。将样品放置于显微镜载物台上，利用垫片边缘定位并聚焦液滴。

调节聚光镜以实现科勒照明，并使用红外传感器卡和红外观察仪检查泵浦光束路径是否仍然正确。确认延迟阶段已设置为零飞秒，并将泵浦光束波长设置为795.8纳米。将泵浦光束功率设为50毫瓦，斯托克斯光束功率设为100毫瓦。

打开两束光的快门以及激光的主快门。扫描样品并在计算机屏幕上查看图像。将显示模式更改为高低模式，并调整范围以获得约50%的饱和度。

检查饱和信号是否位于图像中央，必要时仔细调节皮秒可调激光系统内部的转向镜，以优化泵浦光与斯托克斯光的重叠，从而最大化图像强度并将峰值强度居中。每次成像前，在由两层实验室胶带支撑的洁净载玻片上加入100微升温热的2%琼脂糖，迅速将另一张载玻片盖在上方，轻轻按压以形成一层薄而均匀的琼脂糖垫，并让琼脂糖冷却凝固。

为进行成像，将每10至20条线虫使用4到5微升麻醉剂滴加在盖玻片上，利用解剖显微镜挑选待成像的线虫，并在收集过程中将其放置于麻醉剂液滴中。当所有线虫收集完毕后，用带有琼脂糖垫的载玻片覆盖线虫。成像时，将样本以盖玻片朝向物镜的方向安装，并调节明场光源至目镜，以便定位线虫。

将蠕虫调至焦点，并相应调整聚光镜位置。通过将泵浦激光功率设为 200 毫瓦、红外激光功率设为 400 毫瓦来调节激光功率。设置锁相放大器以对蠕虫的受激拉曼散射（SRS）信号进行解调。

以较快的扫描速度开始扫描第一条线虫，调节微调焦旋钮以找到目标区域。当信号优化后，切换至较慢的扫描速度和更高的像素分辨率，以获取受激拉曼散射（SRS）图像，并以支持高分辨率的格式保存图像。所有样品成像完成后，将激光光源置于待机状态，并关闭所有相关设备。

为了分析图像，在 ImageJ 中打开文件，选择“分析”并设置测量选项以选定待分析的属性。使用多边形选择工具勾勒出需要定量的线虫肠道区域，然后再次点击“分析”并选择“测量”。测量结果将显示在结果窗口中。

当所有线虫的轮廓绘制完成后，将给定基因型中每条线虫的测量值复制并粘贴到电子表格中。对于背景测量值，选择线虫附近无SRS信号的区域，将每个个体线虫的测量值减去背景的平均灰度值，从而计算出该基因型或测试组中所有线虫背景校正后平均灰度值的平均值和标准差。随后，可将这些值归一化至对照组的平均值。

在此代表性分析中，对年龄同步的野生型线虫和缺乏胰岛素受体的 daf-2 突变体在成年期间的肠道脂质水平进行了定量。正如预期，野生型线虫的脂质水平从成年第一天开始下降，并持续至第九天。然而，daf-2 突变体的脂质水平则持续上升，直到其成年第五天，此后保持稳定，约为野生型的 2.5 至 3 倍。

daF-16 失活可抑制 daf-2 突变体脂质水平的升高。在 daf-2、daf-16 双突变体中表达 daf-16a 或 daf-16b 亚型不能恢复其脂质水平。然而，表达 daf-16d/f/h 亚型则足以使 daf-2、daf-16 双突变体的脂质水平恢复至 daf-2 单突变体所观察到的水平。

这些结果表明，daf-16d/f/h 亚型特异性调控 daf-2 突变线虫中的脂质代谢。在整个成像过程中，必须对泵浦光束和斯托克斯光束使用相同的激光功率，并且每次进行六次和四次重复定量时均需包含对照组。除了定量脂质储存外，受激拉曼散射（SRS）显微技术还可与生物正交标记（如氘标记）联用，用于可视化脂质的掺入、合成和降解动态过程。

SRS显微技术具有多重成像能力，可用于对不同亚细胞区域中的多种生物分子进行成像。这种所谓的高光谱SRS显微技术在探索代谢动态方面具有广阔的应用前景。